劉文秋 董寧 孫瑩瑩

摘 要：本文建立一種氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）測(cè)定飼料產(chǎn)品中二氫砒啶含量的方法。采用避光的環(huán)境，在飼料樣品中添加保護(hù)劑降低二氫砒啶的光化學(xué)反應(yīng)，采用乙腈提取待測(cè)物，經(jīng)濃縮和固相微萃取凈化，采用BSTFA進(jìn)行衍生，衍生物通過(guò)GCMS氣化分離以及選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)二氫吡啶衍生物的電子轟擊（EI）質(zhì)譜碎片進(jìn)行解析，特征碎片離子（m/z）206、178、251、151、150、195為定性離子，206為定量離子。該分析方法中二氫吡啶在3～150 mg/kg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，樣品分析精密度RSD＜3%，樣品中二氫吡啶的檢出限0.3 mg/kg。結(jié)果表明，這項(xiàng)方法靈敏、穩(wěn)定、可靠，有效避免了飼料中二氫吡啶在處理過(guò)程中的降解，并有效排除了主要雜質(zhì)的干擾，適用于飼料產(chǎn)品中二氫吡啶的定量分析與確證。

關(guān)鍵詞：二氫吡啶，氣相色譜質(zhì)譜，避光，衍生，飼料

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.04.035

0 前 言

二氫吡啶（diludine），化學(xué)名稱(chēng)2，6-二甲基-3，5-二乙酯基-1，4-二氫吡啶，添加于飼料中作為抗氧化劑及畜禽促生長(zhǎng)劑，能顯著促進(jìn)家畜、家禽、魚(yú)、蝦、牛羊等動(dòng)物的生長(zhǎng)，改善產(chǎn)肉、產(chǎn)蛋與繁殖性能[1]?！东F藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003）規(guī)定每1000 kg牛飼料中可添加100～150 g二氫吡啶，每1000 kg種肉雞飼料中可添加150 g二氫吡啶[2]。畜禽類(lèi)飼料主要以玉米、大豆餅、肉骨粉等為主，輔氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分以及促生長(zhǎng)劑、維生素等添加劑，配方設(shè)計(jì)多樣、組成成分復(fù)雜，給二氫吡啶的檢測(cè)帶來(lái)了非常嚴(yán)重的雜質(zhì)干擾。在現(xiàn)有研究中，二氫吡啶含量測(cè)定多采用紫外分光光度法、氣相色譜電子俘獲檢測(cè)器法、高效液相色譜法等檢測(cè)技術(shù)[3-4]，不能區(qū)分目標(biāo)物與雜質(zhì)，已不能滿足對(duì)二氫吡啶檢測(cè)的需求。

另外，二氫吡啶中-N H-的給電子共軛效應(yīng)與-COOR的吸電子共軛效應(yīng)，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，光穩(wěn)定性較差。有研究表明，在自然光、漫射光、鎢燈光等光源下，二氫吡啶均會(huì)發(fā)生不同程度的光化學(xué)反應(yīng)[5]，《中華人民共和國(guó)藥典》和《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003）都提出了“避光、密閉保存”“現(xiàn)混現(xiàn)喂”的規(guī)定。這一點(diǎn)，筆者也通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)了二氫吡啶含量持續(xù)下降的現(xiàn)象。如何在分離純化過(guò)程中保持二氫吡啶的穩(wěn)定性并有效降低基質(zhì)的干擾，是飼料產(chǎn)品中二氫吡啶含量測(cè)定的巨大難題和挑戰(zhàn)。

本文對(duì)飼料中二氫吡啶檢測(cè)方法進(jìn)行研究，探討了基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法，通過(guò)避光操作和添加紫外線吸收劑、BSTFA衍生化等措施，著重提高方法的穩(wěn)定性；通過(guò)固相萃取凈化、質(zhì)譜分析等方式，解決飼料產(chǎn)品復(fù)雜的基質(zhì)干擾、準(zhǔn)確定性定量；方法的檢出限、準(zhǔn)確性能滿足飼料產(chǎn)品中二氫吡啶的含量測(cè)定，為飼料產(chǎn)品更科學(xué)準(zhǔn)確地管控質(zhì)量安全提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

二氫吡啶（98.00%），TRC公司；N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA，99%），Supelco公司；乙腈，色譜純。

C 1 8 、P S A 吸附劑（c l e a n e r t ? P S A ，cleanert?C18）：博納艾杰爾科技公司。

紫外線吸收劑：4-甲基芐亞基樟腦、丁基甲氧基二苯甲?；淄?、苯基苯并咪唑磺酸、對(duì)氨基苯甲酸、甲氧基肉桂酸乙基己酯、對(duì)甲氧基肉桂酸異戊酯等，均為分析純。

1.1.2 儀器和設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 5975C，配EI源）：美國(guó)安捷倫公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA N-1100）：上海愛(ài)朗儀器公司。

離心機(jī)（冷凍離心機(jī)L535R）：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)公司。

1.2 方法

1.2.1 前處理方法

稱(chēng)取2 g（精確至0.001 g ）飼料，加入2～3種紫外線吸收劑混合物0.2 g，混勻。加入40 mL乙腈，振蕩搖勻，超聲萃取5 min，加入1 g氯化鈉并劇烈振蕩，5000 r/min離心5 min，移取上清液。40 ℃減壓旋蒸至約1 mL，乙腈定容至2 mL。添加1 gPSA、無(wú)水硫酸鎂與C18的混合吸附劑粉末對(duì)定容液進(jìn)行凈化處理，高速振蕩1～3 min，渦旋后5000 r/min離心3 min。上清液過(guò)0.45 μm濾膜，取濾液50 uL，加入100 uL BSTFA，80 ℃加熱20 min，冷卻后供上機(jī)分析。

前處理全程均采用棕色器皿并避光操作。采用遮光窗簾阻擋室外陽(yáng)光，操作時(shí)關(guān)閉實(shí)驗(yàn)臺(tái)近處燈光，盡可能減少實(shí)驗(yàn)環(huán)境的光照強(qiáng)度和光照時(shí)長(zhǎng)。

1.2.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：DB-5 ms，30 m×0.25 um×0.25 mm；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；載氣流速：1 mL/min；分流比：50∶1；色譜柱升溫程序見(jiàn)表1；離子源溫度：150℃；SCAN模式、SIM模式、定性離子、定量離子等參數(shù)見(jiàn)表2；二氫吡啶衍生化物結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 光線對(duì)穩(wěn)定性的影響

比較了10 ug/mL未衍生標(biāo)準(zhǔn)溶液在正常光線條件下，每1 h測(cè)定一次的響應(yīng)值（見(jiàn)圖2），結(jié)果表明響應(yīng)值隨著時(shí)間的推移整體呈下降趨勢(shì)，5 h內(nèi)連續(xù)下降了近30%。

2.2 添加紫外線吸收劑與衍生化對(duì)穩(wěn)定性的影響

在2 g樣品中添加200 μg二氫砒啶，加入4-甲基芐亞基樟腦、甲氧基肉桂酸乙基己酯各0.1 g，混勻后進(jìn)行前處理并采用BSTFA衍生化，待測(cè)溶液每1 h測(cè)定一次（圖3）。結(jié)果表明在本試驗(yàn)的光照和GCMS加熱條件下，待測(cè)物響應(yīng)值基本一致，波動(dòng)較小，穩(wěn)定性良好。

2.3 衍生化條件的優(yōu)化

2.3.1 待測(cè)溶液是否氮吹至干的比較

在衍生溫度、時(shí)間、BSTFA用量一致的情況下，比較了待測(cè)溶液經(jīng)氮吹至干后加BSTFA（A）與待測(cè)溶液不經(jīng)氮吹直接加BSTFA（B）兩種方式下，50 μg/mL二氫吡啶標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值變化（圖4）。結(jié)果表明，兩種情況下響應(yīng)值沒(méi)有明顯變化，氮吹對(duì)衍生化效率影響較小，為了減少目標(biāo)物損失的機(jī)會(huì)以及提高操作效率，因此采用待測(cè)溶液不經(jīng)氮吹的方式。

2.3.2 衍生化時(shí)間的優(yōu)化

在衍生化溫度、BSTFA用量一致的情況下，比較了50 μg/mL待測(cè)溶液分別加熱10 min、20 min、30 min、60min后的響應(yīng)值變化（見(jiàn)圖5）。結(jié)果表明衍生化產(chǎn)物隨著時(shí)間的增加而上升，20 min的響應(yīng)值最高，時(shí)間增加響應(yīng)值下降，因此選擇衍生化時(shí)間為20 min。

2.4 方法標(biāo)準(zhǔn)溶液校正曲線、檢出限

本文方法中二氫吡啶的檢出限為0.3 mg/kg（SN＞3），線性范圍為3～150 mg/kg，定量限為3 mg/kg（SN＞10），詳見(jiàn)表3。方法中目標(biāo)物的峰形及分離度均良好，有效排除了樣品中復(fù)雜基質(zhì)的干擾，滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)需求。二氫吡啶衍生物的色譜圖見(jiàn)圖6，特征離子質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7。

2.5 方法準(zhǔn)確度

以配合飼料、預(yù)混合飼料、濃縮飼料為例，稱(chēng)取2 g樣品，分別添加100 mg/L的二氫吡啶標(biāo)液溶液0.2 mL、0.4 mL、2 mL，制備3個(gè)不同濃度水平的加標(biāo)樣品，每個(gè)水平制備3個(gè)平行樣，按前處理方法處理后上機(jī)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，二氫吡啶的回收率在84.7%～92.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.32%～2.66%，滿足配合飼料、預(yù)混合飼料、濃縮飼料產(chǎn)品中二氫吡啶含量的分析測(cè)定要求。

3 結(jié) 論

本研究開(kāi)發(fā)了飼料中二氫砒啶的GCMS外標(biāo)定量檢測(cè)方法，結(jié)果顯示在避光環(huán)境下，飼料樣品中加入紫外線吸收劑，用乙腈溶液提取，在40℃進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮定容，經(jīng)C18、PSA固相微萃取吸附劑凈化后，凈化液與BSTFA于80 ℃衍生20 min，即可得到80%以上的回收率，排除了飼料產(chǎn)品中主要雜質(zhì)的干擾。方法的檢出限、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性均能滿足飼料產(chǎn)品中二氫吡啶含量的分析測(cè)試要求，同時(shí)有效解決了二氫吡啶在處理過(guò)程中的降解問(wèn)題。

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作者簡(jiǎn)介

劉文秋，本科，工程師，標(biāo)準(zhǔn)中心主任，研究方向?yàn)闄z驗(yàn)檢測(cè)分析方法及標(biāo)準(zhǔn)化。

董寧，博士研究生，高級(jí)工程師，研發(fā)經(jīng)理，研究方向?yàn)闄z驗(yàn)檢測(cè)分析方法及專(zhuān)利。

孫瑩瑩，博士研究生，高級(jí)工程師，技術(shù)研發(fā)中心主任，研究方向?yàn)闄z驗(yàn)檢測(cè)分析技術(shù)及自動(dòng)化設(shè)備應(yīng)用。

（責(zé)任編輯：張佩玉）