曾 華,鄭 勇,周 林,馮上新,唐 俊,孫妍婧,羅 瑋

0 引 言

肛腸疾病手術(shù)后的創(chuàng)面多為開放性創(chuàng)面,加之糞便的殘留和刺激,極易受細(xì)菌感染,導(dǎo)致傷口愈合緩慢,甚至引發(fā)局部和全身感染[1]。如何加速創(chuàng)面愈合一直是困擾臨床醫(yī)師的難題。創(chuàng)面愈合是由多種類型細(xì)胞參與,經(jīng)不同階段后協(xié)調(diào)有序的生理過程,涉及細(xì)胞遷移、增殖、血管生成、膠原沉積和細(xì)胞外基質(zhì)重塑等[1-2]。正常的創(chuàng)面愈合受到阻礙時,創(chuàng)面的病理變化主要表現(xiàn)為持續(xù)的炎癥反應(yīng)和血管生成的異常,從而導(dǎo)致創(chuàng)面遷延不愈。針對炎癥反應(yīng)和血管生成的調(diào)控,可以作為加速創(chuàng)面愈合的潛在基礎(chǔ)。Hippo信號通路是組織發(fā)育和機體平衡的主要協(xié)調(diào)因子,在血管生成中發(fā)揮重要作用[3]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是在胚胎發(fā)生過程中調(diào)節(jié)血管生成的分子,也是在傷口愈合、炎癥以及腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中調(diào)節(jié)組織中血管生成的分子[4]。研究表明,Hippo信號通路是VEGF誘導(dǎo)的血管生成的關(guān)鍵介質(zhì),其激活可通過調(diào)節(jié)創(chuàng)面修復(fù)過程中VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)等介質(zhì)的表達(dá)來促進皮膚創(chuàng)面愈合[5]。苦參是我國傳統(tǒng)名貴中藥之一?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),苦參中提取的多種天然化合物具有廣泛的藥理學(xué)活性,其中苦參堿(Matrine,MT)因具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗炎和抗纖維化等多種藥理作用而受到關(guān)注[6]。此外,研究發(fā)現(xiàn)MT在治療皮炎和濕疹中表現(xiàn)出良好的化學(xué)活性[7]。然而,MT對皮膚創(chuàng)面愈合的作用機制仍未闡明。因此,本研究擬通過構(gòu)建全層皮膚切除創(chuàng)傷大鼠模型,初步探討MT促進皮膚創(chuàng)面愈合的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠,5～7周齡,雌雄各半,體重180～200 g,購自湖北省動物實驗研究中心,生產(chǎn)許可證編號為SCXK(鄂)2020-0018,合格證編號為No.42000600044386。設(shè)置飼養(yǎng)溫度為22 ℃,濕度為55%～60%,12 h光暗循環(huán)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2主要藥品與試劑苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%,貨號CFN98835)購自武漢ChemFace公司。將苦參堿溶于純水制備成濃度為3 μg/mL的混合液備用。Hippo-Yap通路特異性抑制劑Verteporfin(97%;貨號S80258)購自上海源葉生物科技有限公司。京萬紅軟膏購自天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司(國藥準(zhǔn)字Z20023137)。蛋白提取試劑盒(貨號YT8951)購自北京伊塔生物科技有限公司;蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(貨號G1120-100)購自北京索萊寶科技有限公司;白細(xì)胞介素-6(IL-6;貨號PI328)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α;貨號PT516)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β;貨號PI303)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自上海碧云天科技公司;NE-PER核提取試劑和細(xì)胞質(zhì)提取試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司;兔源VEGF單克隆抗體(貨號ab32152)、兔源哺乳動物Ste20樣激酶1(mammalian sterile20-like 1,MST1)單克隆抗體(貨號ab245190)、兔源磷酸化MST1(p-MST1)單克隆抗體(貨號ab51134)、兔源大腫瘤抑制因子1(large tumorsuppressor gene1,LATS1)單克隆抗體(貨號ab243656)、兔源磷酸化LATS1(p-LATS1)單克隆抗體(貨號ab111334)、兔源磷酸化YAP(p-YAP)單克隆抗體(貨號ab76252)、兔源YAP單克隆抗體(貨號ab81183)、兔源三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體(貨號ab9485)、兔源組蛋白H3(histone H3;H3)多克隆抗體(貨號ab1791)均購自美國Abcam公司。

1.3主要儀器JJ-12J型脫水機和JB-P5型包埋機(武漢俊杰電子有限公司);RM2016型病理切片(上海萊卡儀器有限公司);NIKON ECLIPSE CI型正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)。

1.4動物建模、分組及給藥從61只大鼠中隨機數(shù)字表法選擇6只作為對照組,其余55只大鼠用于構(gòu)建全層皮膚切除創(chuàng)傷模型[8]。剃除大鼠背部毛發(fā)后,以2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射法麻醉大鼠。于大鼠背部做一直徑20 mm圓形標(biāo)記,沿標(biāo)記切除全層皮膚,深度約為2 mm,所有造模大鼠的取皮部位及形狀保持一致。創(chuàng)傷后按壓創(chuàng)面止血,使用碘伏對大鼠創(chuàng)傷部位進行消毒后,拍照記錄創(chuàng)面情況。建模4 h后,肉眼可見皮膚創(chuàng)面損傷,無死亡、感染現(xiàn)象,即為建模成功。共55只大鼠參與建模,48只成功建模的大鼠參與后續(xù)實驗。將48只模型大鼠隨機為模型組、PD組、MT組、MT+VP組,每組12只。對照組麻醉后剃除背部相同部位毛發(fā),不做皮膚創(chuàng)傷處理。

造模成功后即刻給藥。對照組大鼠于剪毛區(qū)涂抹100 μL等滲鹽水。模型組于創(chuàng)面涂抹100 μL等滲鹽水。PD組于創(chuàng)面涂抹100 μL的京萬紅軟膏[7]。MT組于創(chuàng)面涂抹濃度為200 ng/mL苦參堿混合液100 μL[9]。MT+VP組于創(chuàng)面涂抹濃度為300 μg/L苦參堿混合液100 μL后,腹腔注射100 mg/kg VP[10]。各組給藥1次/d,持續(xù)7 d。

1.5大鼠創(chuàng)面愈合情況分別于造模后0、3、7和14 d對創(chuàng)面邊緣進行測量并拍照,采用ImagePro Plush.6.0圖像分析系統(tǒng)對創(chuàng)面面積進行測定,并計算創(chuàng)面愈合率,公式如下:

創(chuàng)面愈合率(%)=(原始創(chuàng)面面積-第n天未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%

1.6標(biāo)本采集于造模后7 d,每組隨機抽取6只大鼠,麻醉后取下創(chuàng)面局部組織樣本。一部分創(chuàng)面皮膚組織用于組織病理學(xué)分析,一部分創(chuàng)面皮膚組織制備勻漿,用于ELISA和Western blot分析。其余大鼠繼續(xù)分籠飼養(yǎng)至創(chuàng)面完全愈合,記錄完全愈合時間和疤痕厚度。

1.7酶聯(lián)免疫吸附實驗將皮膚組織勻漿后,于4 ℃下以離心半徑10 cm、3000 r/min離心10 min后獲得上清液樣品,置于-80 ℃保存。采用相關(guān)檢測試劑盒檢測血清TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。

1.8HE染色石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度水化后,蘇木精染色5 min,鹽酸酒精分化2 s,水洗后用飽和碳酸鋰溶液返藍(lán)30 s。水洗后,用0.5%伊紅染色1 min。經(jīng)梯度乙醇和二甲苯處理后,用中性樹脂封片。于光學(xué)顯微鏡下進行觀察。

1.9免疫組化染色石蠟切片經(jīng)脫蠟后,經(jīng)3%雙氧水滅活內(nèi)源性酶、抗原熱修復(fù)后,于封閉液中室溫下封閉10 min。隨后,將切片與抗CD31一抗于4 ℃下孵育過夜。經(jīng)PBS洗滌后,于切片上滴加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的兔抗IgG二抗,37 ℃下孵育30 min。采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒顯色后,經(jīng)蘇木精復(fù)染、脫水、透明,用中性樹脂封固。

1.10蛋白免疫印跡分析將部分皮膚組織在含PMSF和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液中制備組織勻漿,冰浴后于4 ℃下以以離心半徑12 cm、10 000 r/min離心20 min。按照產(chǎn)品說明書,使用NE-PER核提取試劑和細(xì)胞質(zhì)提取試劑分離核蛋白質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)用雙喹啉酸(BCA)法進行定量。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。隨后,將膜用 5%脫脂牛奶阻斷2 h。隨后,將膜用一抗于4 ℃下孵育過夜。洗滌后,再將膜用過氧化物酶結(jié)合的二抗于室溫下孵育2 h。洗滌后,用增強化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒(Applygen Technologies Inc.)對膜進行顯影。使用GAPDH或H3作為內(nèi)部參照。采用Image J對條帶圖像進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面愈合率建模時,各組大鼠創(chuàng)傷面積基本一致。造模后7 d和14 d時,PD組和MT組創(chuàng)面均較模型組縮小。定量分析顯示,造模后3、7、14 d時,與模型組相比,PD組和MT組創(chuàng)面愈合率均明顯升高(P<0.05);與MT組相比,MT+VP組創(chuàng)面愈合率均明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠創(chuàng)傷愈合面積的比較

2.2創(chuàng)面組織炎癥因子水平造模后7 d,與模型組相比,PD組和MT組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯降低(P<0.05);與MT組相比,MT+VP組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯升高(P<0.05)。見圖1。

1:對照組;2:模型組;3:PD組;4:MT組;5:MT+VP組

2.3創(chuàng)面組織病理損傷HE染色顯示,與對照組相比,造模后7 d,模型組可見明顯炎性浸出層,肉芽組織水腫,成纖維細(xì)胞散在分布,少量新生毛細(xì)血管;而相較于模型組,PD組和MT組炎性細(xì)胞密度降低,炎性滲出層變薄或消失,肉芽組織水腫減輕,可見較明顯成纖維細(xì)胞及新生毛細(xì)血管。相較于MT組,MT+VP組病理組織損傷加重。見圖2。

a:對照組;b:模型組;c:PD組;d:MT組;e:MT+VP組

2.4創(chuàng)面組織血管生成免疫組織化學(xué)分析顯示,造模后7 d,與模型組CD31陽性染色細(xì)胞百分比[(5.44±0.65)%]相比,PD組[(53.62±5.39)%]和MT組[(50.58±6.26)%]明顯升高(P<0.05);與MT組CD31陽性染色細(xì)胞百分比[(50.58±6.26)%]相比,MT+VP組[(42.73±5.32)%]明顯降低(P<0.05)。見圖3。

a:對照組;b:模型組;c:PD組;d:MT組;e:MT+VP組

Western blot分析顯示,與模型組相比,PD組和MT組VEGF和TGF-β1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與MT組相比,MT+VP組VEGF和TGF-β1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖4。

1:對照組;2:模型組;3:PD組;4:MT組;5:MT+VP組

2.5Hippo信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量采用Western blot檢測Hippo信號通路相關(guān)蛋白。結(jié)果顯示,造模后7 d,與對照組相比,模型組MST1、LAST1和YAP蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.05);與模型組相比,PD組和MT組MST1、LAST1和YAP蛋白磷酸化水平明顯升高(P<0.05);與MT組相比,MT+VP組MST1、LAST1和YAP蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.05)。見圖5。

1:對照組;2:模型組;3:PD組;4:MT組;5:MT+VP組

2.6YAP核移位與對照組相比,模型組細(xì)胞質(zhì)YAP蛋白表達(dá)明顯降低,而核YAP蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05);與模型組相比,PD組和MT組胞質(zhì)YAP蛋白表達(dá)明顯增加,而核YAP蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);與MT組相比,MT+VP組細(xì)胞質(zhì)YAP蛋白表達(dá)明顯降低,而核YAP蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見圖6。

1:對照組;2:模型組;3:PD組;4:MT組;5:MT+VP組

2.7創(chuàng)面完全愈合時間及瘢痕厚度與模型組相比,PD組和MT組皮膚創(chuàng)面完全愈合時間明顯減少,且瘢痕厚度明顯降低(P<0.05);與MT組相比,MT+VP組創(chuàng)面完全愈合時間明顯增加,且瘢痕厚度明顯增加(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠創(chuàng)面完全愈合時間及瘢痕厚度的比較

3 討 論

皮膚是抵御外部侵略者的第一道防線。皮膚的完整性會因創(chuàng)傷、撕裂、割傷或挫傷而受損,從而導(dǎo)致皮膚傷口。皮膚傷口愈合過程涉及各種類型的細(xì)胞(例如白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞)和多種因子,例如細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和酶。這些細(xì)胞和因子在每個傷口愈合階段都有不同的特征。探尋多效應(yīng)促進創(chuàng)面愈合的藥物具有重要意義。近年來,大量天然藥物來源的活性成分被證明具有促進創(chuàng)面愈合作用[11]。對天然產(chǎn)物的開發(fā)和利用對皮膚創(chuàng)傷的治療具有積極意義?？鄥⑹嵌箍浦参锟鄥ophoraflavescensAit.的干燥根,具有清熱利濕、解毒水腫、拔毒生肌之功效[12]。MT是從苦參根中提取的一種生物堿,被證實具有抗炎、抗氧化作用,并能夠促進人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖[13]。本研究發(fā)現(xiàn),相較于模型組,MT組大鼠創(chuàng)面愈合率明顯增加,且創(chuàng)面完全愈合時間縮短,瘢痕厚度降低。這些結(jié)果提示,MT能夠加速全層皮膚切除創(chuàng)傷模型大鼠的皮膚創(chuàng)面愈合,且有利于抑制瘢痕過度增生。

炎癥反應(yīng)是創(chuàng)傷修復(fù)的重要階段,對于清除病原微生物并為隨后的組織修復(fù)和再生階段創(chuàng)造合適的環(huán)境至關(guān)重要[14]。皮膚受損后,傷口區(qū)域募集多種炎性細(xì)胞,如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等,并釋放各種生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子[15]。在傷口環(huán)境中,中性粒細(xì)胞上調(diào)趨化因子的基因表達(dá),如TNF-α,IL-1β,IL-6,VEGF和單核細(xì)胞化學(xué)引誘蛋白-1;招募巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和其他中性粒細(xì)胞;并促進成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的血管生成和增殖[15]。單核細(xì)胞到達(dá)傷口并分化成巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞。巨噬細(xì)胞負(fù)責(zé)吞噬凋亡中性粒細(xì)胞,清除傷口區(qū)域的細(xì)菌和死細(xì)胞,并在炎癥期與中性粒細(xì)胞合作。巨噬細(xì)胞還分泌細(xì)胞因子,如TGF-β、TNF-α、IL-1和IL-6[16]。此外,巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)運至修復(fù)狀態(tài),從炎癥中消退并刺激角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進行后續(xù)組織再生,促進向增殖期的過渡。然而,持續(xù)的炎癥反應(yīng)會損害創(chuàng)面周圍正常組織,導(dǎo)致創(chuàng)面愈合困難,甚至引起感染。因此,在皮膚創(chuàng)面愈合中精確平衡促炎和抗炎反應(yīng)十分重要。據(jù)報道,MT對中性粒細(xì)胞的浸潤、巨噬細(xì)胞極化及單核細(xì)胞的遷移和粘附具有抑制作用[17-19]。MT的抗炎特性已經(jīng)被廣泛證實[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)相較于模型組,治療6 d后,MT組創(chuàng)面炎性浸出層消退時間提前。同時,MT組IL-1β和IL-6水平均明顯低于模型組。因此,MT可以通過減輕炎性細(xì)胞浸潤、抑制促炎細(xì)胞因子分泌來減輕傷口的炎癥過程,加速愈合過程。

除炎癥反應(yīng)外,創(chuàng)面血管生成障礙也是導(dǎo)致創(chuàng)面愈合延遲的主要因素[22]。血管生成是創(chuàng)面愈合過程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,對創(chuàng)面愈合起著十分重要的作用[23]。通過促進新生血管生成來促進創(chuàng)面愈合是目前開發(fā)相關(guān)藥物的有效策略[23]。內(nèi)皮細(xì)胞活化和增殖是綜合各種調(diào)控因素后,最終促進血管生成的核心執(zhí)行程序[24]。CD31在新生血管中表達(dá)陽性,是血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物; VEGF和TGF-β1是血管生成、肉芽組織形成、膠原蛋白合成和細(xì)胞外基質(zhì)沉積的效應(yīng)因子,在血管內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)、維持和生長中發(fā)揮著積極作用[25]。VEGF和TGF-β1表達(dá)的增加與傷口愈合的加速有關(guān)[26]。本研究中HE染色顯示MT組大鼠創(chuàng)面新生血管數(shù)量明顯增多。同時,免疫組織化學(xué)分析及蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果均顯示,MT組大鼠創(chuàng)面中CD31、VEGF和TGF-β1的表達(dá)較模型組明顯增多,可見MT能夠促進創(chuàng)面血管生成。

目前尚不清楚MT促進皮膚損傷修復(fù)的機制。Hippo通路參與調(diào)節(jié)器官大小、組織再生和干細(xì)胞自我更新,是傷口修復(fù)過程中的關(guān)鍵信號通路之一[27]。在哺乳動物中,該通路的核心模塊由MST1、LAST1/2激酶及其相互作用伙伴MOB激酶激活劑1組成。已證實,Hippo通路失調(diào)與糖尿病血管生成障礙和傷口愈合延遲有關(guān)[28]。Hippo信號的激活導(dǎo)致與轉(zhuǎn)錄因子相互作用并調(diào)控基因表達(dá)的YAP蛋白被排斥出細(xì)胞核。YAP作為一種新型轉(zhuǎn)錄因子,能有效增強促炎細(xì)胞因子的表達(dá),同時提高TNF-α的表達(dá)水平。抑制YAP的表達(dá)或敲除YAP可以有效地下調(diào)促炎因子的表達(dá),表明YAP能夠發(fā)揮有效的促炎反應(yīng)[29]。此外,Hippo信號通路還充當(dāng)血管生成的各種信號通路的融合者,包括Wnt、VEGF和Notch等[30]。在皮膚傷口愈合過程中,Hippo-YAP介導(dǎo)的核信號傳導(dǎo)對于VEGF和TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是必不可少的[31]。Pulkkinen等[32]觀察到VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成主要通過Hippo信號通路傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)。Brewer等[33]在耳廓損傷小鼠模型中證實YAP活性在體內(nèi)傷口愈合中至關(guān)重要。Yang等[34]發(fā)現(xiàn),中性粒細(xì)胞細(xì)胞外陷阱通過抑制Hippo信號通路,使YAP與轉(zhuǎn)錄因子Smad2結(jié)合,并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,促進內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,最終阻礙糖尿病足小鼠血管生成并延遲傷口愈合。本研究中,我們試圖確定MT在皮膚損傷大鼠皮膚傷口愈合中的促進作用是否涉及Hippo信號通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MT處理使MST1、LAST2和YAP的磷酸化水平明顯增加,而YAP的核移位明顯減少,提示MT能夠激活Hippo途徑,并抑制YAP的核移位。為進一步確定MT在皮膚損傷大鼠模型中的作用機制,本研究也使用了Hippo-YAP通路特異性抑制劑Verteporfin(VP)進行挽救實驗。與預(yù)期一致,本研究發(fā)現(xiàn),VP可在一定程度上消除MT對Hippo-YAP通路的激活作用。同時,MT對皮膚損傷大鼠組織損傷的改善、促炎細(xì)胞因子分泌的抑制、血管生成的促進作用均能夠在一定程度上被VP所逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果證實MT至少部分通過激活Hippo-YAP通路來發(fā)揮抗炎效應(yīng),并促進血管生成,從而加速創(chuàng)面愈合,在全層皮膚切除創(chuàng)傷大鼠模型中發(fā)揮保護作用。

綜上所述,MT能夠通過抑制炎癥反應(yīng)、促進血管生成加速全層皮膚切除創(chuàng)傷大鼠的皮膚創(chuàng)面愈合,這一過程可能涉及MT對Hippo-YAP通路的激活效應(yīng)。