王欣怡,牛海亞,鄧 紅,楊新燕,劉一凡,王凱博,徐傳皓,韓 梅

0 引 言

X射線在放射治療、生物醫(yī)學(xué)成像及臨床醫(yī)療設(shè)備中均得到了廣泛的應(yīng)用[1]。在臨床診療中,X射線導(dǎo)致細(xì)胞毒性的同時(shí),也造成細(xì)胞基因組不穩(wěn)定,某些基因發(fā)生變異、異常表達(dá)等[2-3]。由于X射線不能區(qū)分正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞,其影響可能波及腫瘤周?chē)渌?xì)胞,如血管內(nèi)皮細(xì)胞。如果血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,直接影響輻射區(qū)域內(nèi)的血供,對(duì)腫瘤細(xì)胞可抑制其生長(zhǎng)發(fā)育,但對(duì)正常細(xì)胞則會(huì)產(chǎn)生不利影響。因此研究X射線輻射區(qū)域腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞基因和蛋白的改變,對(duì)X射線應(yīng)用具有重要意義。

賴(lài)氨酰氧化酶(lysyl oxidase, LOX)家族包括LOX和賴(lài)氨酰氧化酶樣蛋白1～4 (lysyl oxidase-like protein 1～4, LOXL1～4),是一類(lèi)銅依賴(lài)性單胺氧化酶,能夠穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì),保持其結(jié)構(gòu)的完整性,參與發(fā)育、組織修復(fù)和重塑、癌癥和腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理病理過(guò)程[4-6]。本課題組前期的研究表明LOX可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移、異質(zhì)黏附、血管生成,以促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移[7-8];同時(shí)發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路中的兩個(gè)分支 p38MAPK 和 ERK1/2 MAPK可調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞LOX表達(dá)[9]?，F(xiàn)已公認(rèn)LOX是腫瘤治療和預(yù)防轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。但輻射,尤其是X射線對(duì)不同細(xì)胞LOX及其家族成員的影響及其機(jī)制尚未完全闡明。本研究采用不同劑量X射線分別輻射人低分化黏液樣胃腺癌細(xì)胞MGC-803和HUVEC,比較細(xì)胞LOX及其家族成員基因、胞內(nèi)蛋白、分泌蛋白和酶活性的變化,并初步探討其機(jī)制,為胃癌放療后轉(zhuǎn)移機(jī)制、轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物的研究提供新線索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑MGC-803和HUVE(中科院上海細(xì)胞庫(kù)),細(xì)胞裂解液試劑盒(上海江萊生物有限公司),2×SYBR Green qPCR Master Mix(G3321,Servicebio),LOX ELISA 試劑盒(CK-E10984,江萊生物公司),LOXL1 ELISA 試劑盒(CK-E18380,江萊生物公司),LOXL2 ELISA 試劑盒(CK-E16044,江萊生物公司),LOXL3 ELISA 試劑盒(CK-E16108,江萊生物公司),LOXL4 ELISA 試劑盒(CK-E18381,江萊生物公司),Cell-Based ERK1/2(Thr202/Tyr204) ELISA kit(6209,RayBio),Cell-Based p38MAPK(T180/Y182) ELISA kit(6214,RayBio),兔抗人LOX多克隆抗體(Ab31238,Abcam公司/美國(guó)),兔抗人LOXL1多克隆抗體(Ab81488,Abcam公司/美國(guó)),兔抗人LOXL2多克隆抗體(Ab179810 ,Abcam公司/美國(guó)),兔抗人LOXL3多克隆抗體(sc-377216,Abcam公司/美國(guó)),兔抗人LOXL4多克隆抗體(Ab88186,Abcam公司/美國(guó))。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將MGC-803和HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、50 μL/100 mL青霉素、125 μL/100 mL慶大霉素的 DMEM培養(yǎng)液中,置于 37 ℃、5% CO2的孵箱中生長(zhǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%～90%進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3X射線輻射及LD50的測(cè)定準(zhǔn)備96孔板,每孔加入細(xì)胞懸液100 μL,含1×104個(gè)/孔。細(xì)胞貼壁后換無(wú)血清培養(yǎng)基暴露于X射線,輻射劑量分別為0、2、4、6、8和10 Gy,每個(gè)劑量設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。輻射后23 h,每孔加入CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)1 h,酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)量A值。按公式計(jì)算細(xì)胞致死率,以細(xì)胞致死率為縱軸,輻射劑量為橫軸,繪制曲線,用SPSS 21.0 Biss法計(jì)算LD50。致死率公式如下:

致死率=(對(duì)照組A值-輻射組A值)/對(duì)照組A值×100%

1.4Realtime PCR檢測(cè)LOX家族成員 mRNA 豐度X射線輻射后的細(xì)胞,用 RNA提取試劑盒提取細(xì)胞的總RNA,采用2×SYBR Green qPCR試劑盒,按照反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系設(shè)計(jì)、合成引物。PCR擴(kuò)增 95℃ 10 min;95 ℃ 15 s ,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,目的基因的相對(duì)表達(dá)量=2-△△CT,公式如下:

△CT =CT(目的基因)-CT(內(nèi)參基因)

△△CT =△CT(實(shí)驗(yàn)組)- △CT(對(duì)照組)

目的基因引物序列:LOX上游引物5'-TGGATGAGTTTAGCCACTATGACC-3',下游引物5'-TAACAGCCAGGACTCAATCCC-3';LOXL1 上游引物5'-GTACCCGCCCTACGCCAACCC-3',下游引物5'-ACTCGTCCATGCTGTGGTAATGCT-3';LOXL2 上游引物5'-ATGTACCGCCA TGACATCGACT-3',下游引物5'-ATCGGATTCTGCAACCTCGAAG-3';LOXL3 上游引物5'-GTCTGTGACCGCAAGTGGG-3',下游引物5'-AATCCTGGCTATGTGAACAATCC-3';LOXL4 上游引物5'-CTGCCTCTCCAAGTCTGCGGAT-3',下游引物5'-CAAACCCAGCTATCG CGTCCAGT-3';GAPDH上游引物5'-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3',下游引物5'-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3'。

1.5Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中LOX家族成員蛋白相對(duì)含量按照細(xì)胞裂解液試劑盒說(shuō)明裂解X射線輻射后的細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白,測(cè)定蛋白濃度。配制SDS-PAGE 濃縮膠和分離膠,每孔蛋白上樣量和體積相同。電泳后,轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上,用脫脂奶粉封閉3 h后分別加入相應(yīng)抗體。LOX、LOXL1、LOXL2、LOXL3、p-p38抗體稀釋比例均為1∶1000,LOXL4抗體稀釋比例為1∶3000,p-Erk1/2抗體稀釋比例為1∶2000,β-actin抗體稀釋比例為1∶5000。室溫孵育1 h后4 ℃過(guò)夜。洗膜后分別加入相應(yīng)二抗,室溫孵育2 h。洗膜后按照顯影曝光試劑盒說(shuō)明書(shū)曝光。將膜置于凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描,用Image J測(cè)灰度值,蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白表達(dá)強(qiáng)度/內(nèi)參(β-actin) 強(qiáng)度。

1.6ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中LOX家族成員分泌量按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作?？瞻卓撞患訕悠芳懊笜?biāo)試劑,待測(cè)樣品孔每孔加5倍稀釋后的細(xì)胞上清50 μL和酶標(biāo)試劑100 μL。置于37 ℃溫箱孵育60 min,加入顯色劑后再次避光孵育15 min,加終止液終止反應(yīng),在450 nm波長(zhǎng)測(cè)A值。以A值為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中LOX家族酶濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為細(xì)胞上清中LOX家族酶的實(shí)際濃度。

1.7Amplex Red熒光法檢測(cè)LOX酶活性按照LOX 活性試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)混合物和標(biāo)準(zhǔn)品。用Assay Buffer將3%H2O2稀釋為不同濃度梯度作為標(biāo)準(zhǔn)品,具體濃度為0.6、0.5、0.4、0.3、0.2和0.1 μg/μL。準(zhǔn)備96孔板,加樣分為空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、樣本孔?？瞻卓准尤?0 μL Assay Buffe,標(biāo)準(zhǔn)孔加入不同濃度的H2O2標(biāo)準(zhǔn)品,每孔50 μL。樣本孔加入X射線輻射后的細(xì)胞上清,每孔50 μL。加入反應(yīng)混合物50 μL/孔,充分搖勻,37 ℃避光孵育30 min。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)576 nm測(cè)A值,用H2O2標(biāo)準(zhǔn)品A值為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本孔LOX相對(duì)氧化酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 X射線輻射LD50的確定0、2、4、6、8和10 Gy劑量X射線輻射分別輻射 MGC-803和HUVEC細(xì)胞,細(xì)胞致死率隨X射線劑量增大而增加,見(jiàn)圖1。結(jié)果提示MGC-803的LD50為8.2 Gy,HUVEC的LD50為6 Gy。后續(xù)實(shí)驗(yàn)樣品選用X射線輻射0、2、4和6 Gy劑量組的MGC-803和HUVEC細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試。

圖1 不同劑量X射線輻射后兩種細(xì)胞致死率比較

2.2暴露于X射線后兩種細(xì)胞LOX家族成員mRNA變化MGC-803細(xì)胞經(jīng)2、4、6 Gy X射線輻射后,LOX mRNA的相對(duì)豐度均高于0 Gy組 (P<0.05), LOXL1、LOXL2和LOXL4 mRNA的相對(duì)豐度均低于0 Gy組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 MGC-803暴露于X射線后LOX家族mRNA相對(duì)豐度比較

HUVEC的各劑量組LOX mRNA的相對(duì)豐度均高于0 Gy組 (P<0.05);2 Gy組LOXL1、LOXL2和LOXL3 mRNA的相對(duì)豐度高于0 Gy組 (P<0.05);4 Gy組LOXL1、LOXL3和LOXL4 mRNA的相對(duì)豐度高于0 Gy組(P<0.05); 6 Gy組LOXL2和LOXL4 mRNA的相對(duì)豐度高于0 Gy 組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 HUVEC暴露于X射線后LOX家族成員mRNA相對(duì)豐度比較

2.3X射線輻射后兩種細(xì)胞中LOX家族成員蛋白相對(duì)表達(dá)量比較MGC-803細(xì)胞的各劑量組LOX、 LOXL4蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于0 Gy組(P<0.05);4 Gy組、6 Gy組LOXL1和LOXL3蛋白相對(duì)表達(dá)量較0 Gy組低(P<0.05);2 Gy組、4 Gy組LOXL2蛋白相對(duì)表達(dá)量較0 Gy組低(P<0.05);但2 Gy 組LOXL1和LOXL3蛋白相對(duì)表達(dá)量較0 Gy組高。見(jiàn)圖2。

1:0 Gy組;2:2 Gy組;3:4 Gy組;4:6 Gy組

HUVEC細(xì)胞的2 Gy組、4 Gy組和6 Gy組LOX、LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4蛋白相對(duì)表達(dá)量均較0 Gy組高(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4暴露于X射線后兩種細(xì)胞LOX家族成員酶分泌量比較MGC-803細(xì)胞的2 Gy組、4 Gy組LOX和LOXL4分泌量較0 Gy組少(P<0.05);2 Gy組、4 Gy組、6 Gy 組LOXL1分泌量較0Gy組少(P<0.05);2 Gy組LOXL2分泌量較0 Gy組多(P<0.05),而4 Gy組較0 Gy組少(P<0.05);2 Gy組LOXL3分泌量較0 Gy組多(P<0.05)。見(jiàn)表3。HUVEC細(xì)胞的4 Gy 組LOX分泌量高于0 Gy組(P<0.05);各劑量組X射線輻射后LOXL1和LOXL3分泌量較0 Gy組高(P<0.05),LOXL3隨輻射劑量增大而增高;4 Gy組和6 Gy X組LOXL2和LOXL4分泌量高于0 Gy組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 MGC-803暴露于X射線后LOX家族成員酶分泌量的變化

表4 HUVEC暴露于X射線后LOX家族成員酶分泌量的變化

2.5暴露于X射線后兩種細(xì)胞LOX酶活性的變化MGC-803細(xì)胞 LOX酶活性在X射線輻射前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HUVEC的LOX酶活性,2 Gy組和6 Gy組高于0 Gy組(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 X射線輻射MGC-803和HUVEC后LOX酶活性變化

2.6暴露于X射線后兩種細(xì)胞p38MAPK和Erk1/2 MAPK變化MGC-803細(xì)胞的2 Gy組、6 Gy組p-p38、p-p42、p-p44均較0 Gy組上調(diào)(P<0.05);4 Gy組p-p38較0 Gy組上調(diào)(P<0.05)。HUVEC細(xì)胞的2、4、6 Gy 組p-p38、 p-p42、 p-p44均較0 Gy組上調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖3。

1:0 Gy組;2:2 Gy組;3:4 Gy組;4:6 Gy組

3 討 論

不同器官、組織和細(xì)胞對(duì)于X射線輻射的敏感性不同,甚至同一腫瘤中不同細(xì)胞的敏感性也不同[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn),HUVEC暴露于X射線的 LD50較胃癌細(xì)胞MGC-803更低,提示在相同劑量時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞可能對(duì)X射線輻射更敏感,更容易被損傷。

X射線對(duì)機(jī)體的作用是多方面且復(fù)雜的,既可直接作用于DNA、蛋白質(zhì)及酶類(lèi)等生物大分子引起電離激發(fā),使化學(xué)鍵斷裂、分子變性和細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞;又可作用于機(jī)體內(nèi)水分子,使其發(fā)生水解并產(chǎn)生大量自由基,間接使組織細(xì)胞發(fā)生變性和壞死,以致整個(gè)機(jī)體出現(xiàn)多系統(tǒng)功能障礙[12]。受輻射細(xì)胞還可表現(xiàn)為基因組不穩(wěn)定,某些基因變異、異常表達(dá)等[3],造成細(xì)胞生物學(xué)特性的改變。本研究觀察了X射線輻射對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803和血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC產(chǎn)生LOX家族成員的影響。結(jié)果表明,X射線輻射對(duì)兩種細(xì)胞的LOX家族成員產(chǎn)生的影響不同,對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803的LOX、LOXL1、LOXL2、LOXL4的蛋白產(chǎn)生和分泌有不同程度抑制作用,而對(duì)HUVEC的LOX、LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4的蛋白產(chǎn)生和分泌均有不同程度的誘導(dǎo)作用。由此推測(cè)X射線可以通過(guò)對(duì)兩種細(xì)胞LOX家族成員的不同影響而使其生物學(xué)功能發(fā)生不同變化。

LOX家族成員是一組單胺氧化酶,除相似的基本功能外,五種成員在分布和生物學(xué)作用上的差異尚未完全闡明。在惡性腫瘤中,有研究發(fā)現(xiàn)LOX家族成員的表達(dá)與患者腫瘤轉(zhuǎn)移和總生存率相關(guān),尤其是LOX和LOXL2可促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展,癌細(xì)胞侵襲,促進(jìn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[13]。Kasashima 等[14]研究發(fā)現(xiàn)LOXL1、LOXL3、LOXL4的表達(dá)與原發(fā)性胃癌浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),LOXL1陽(yáng)性的胃癌患者的總生存期顯著低于LOXL1陰性表達(dá)患者。LOXL3在人體正常組織中差異表達(dá),在胃癌細(xì)胞中定位于胞核,與胃癌的侵襲和預(yù)后不良相關(guān),促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究顯示,胃癌細(xì)胞MGC-803經(jīng)X射線輻射后,LOX、LOXL1、LOXL2和LOXL4表達(dá)以下調(diào)趨勢(shì)為主,尤其是4 Gy組,但LOX酶活性的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示一定劑量X射線輻射可能通過(guò)抑制這幾種酶的產(chǎn)生和分泌抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移等特性,而酶活性無(wú)明顯改變。同時(shí),LOX及其家族成員的產(chǎn)生和分泌并未出現(xiàn)輻射劑量依賴(lài)性改變,可能是因?yàn)檩椛鋵?duì)細(xì)胞的影響較復(fù)雜,不是單一作用。Shen等[15]報(bào)道LOX在肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤、表皮樣癌等多種癌細(xì)胞中X射線輻射后表達(dá)增加,與本文結(jié)果不一致,可能與輻射劑量和細(xì)胞種類(lèi)不同有關(guān)。此外,本研究結(jié)果中LOX的mRNA在各劑量X射線輻射后上調(diào),與細(xì)胞蛋白表達(dá)與分泌不一致,可能是因?yàn)檩椛浜蠹?xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯不同步所致;而LOXL3在2 Gy X射線輻射下mRNA、蛋白和分泌均上調(diào),其意義還有待進(jìn)一步研究。

LOX及其家族成員也參與血管生成。有研究發(fā)現(xiàn)LOX通過(guò)激活血小板衍生生長(zhǎng)因子受體信號(hào)驅(qū)動(dòng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)和腫瘤的血管生成[16]。LOX、LOXL1、LOXL2和LOXL4可通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子或其受體而促進(jìn)血管生成[17-18]。本研究中,HUVEC經(jīng)X射線輻射后LOX家族成員的轉(zhuǎn)錄、合成和分泌均表現(xiàn)為上調(diào),以4 Gy組明顯,LOX酶活性也增強(qiáng)。LOX及其家族成員的產(chǎn)生和分泌同樣未出現(xiàn)輻射劑量依賴(lài)性改變。提示X射線輻射可能通過(guò)增加LOX家族成員的產(chǎn)生和酶活性促進(jìn)血管生成,增加血管彈性,修復(fù)并維持血管完整性。但LOX家族各成員之間的差異還需要更深入的研究。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinas ses,MAPK)共分為4個(gè)亞族:ERK、p38、JNK 和 ERK5[19],該信號(hào)通路是研究較多的經(jīng)典信號(hào)通路,已知有表皮樣生長(zhǎng)因子、血管生成素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等的作用與此信號(hào)通路相關(guān)[20]。本課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路中的兩個(gè)分支p38MAPK和Erk1/2 MAPK可調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞LOX表達(dá)[9]。本研究結(jié)果證實(shí),X射線輻射可使兩種細(xì)胞p-Erk1/2、p-p38不同程度上調(diào)。提示一定劑量X射線輻射可激活Erk1/2 MAPK和p38 MAPK通路,但與兩種細(xì)胞的LOX家族成員相反的表達(dá)趨勢(shì)無(wú)法對(duì)應(yīng),可能與LOX家族成員表達(dá)還受其他信號(hào)通路的影響有關(guān),仍需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果展示了胃癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞在X射線輻射下LOX家族成員的不同表達(dá)模式,為了解不同細(xì)胞對(duì)于X射線輻射的反應(yīng),為急性電離輻射損傷、輻射防護(hù)及劑量研究提供了依據(jù)。