喻 玲, 張 蕊, 朱 琳, 張 冰, 張 妤, 郭寶元, 王松雪

(上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院1,上海 200093)

(國家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院2,北京 100037)

農(nóng)產(chǎn)品種植或儲(chǔ)藏時(shí)使用農(nóng)藥后難以避免產(chǎn)生農(nóng)藥殘留。大米中農(nóng)藥殘留限量指標(biāo)檢測(cè)是監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)大米質(zhì)量安全的重要手段之一,其檢測(cè)技術(shù)一直備受人們的關(guān)注[1-6]。其中氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好的特點(diǎn),是農(nóng)藥殘留分析中應(yīng)用最普遍的技術(shù)[7-9]。而基質(zhì)效應(yīng)(MEs)一直是影響GC-MS/MS檢測(cè)的重要因素[10]。GC-MS/MS基質(zhì)效應(yīng)主要發(fā)生在進(jìn)樣口到色譜柱以及色譜柱到檢測(cè)器之間,通常認(rèn)為是待分析農(nóng)藥與硅醇基及其與玻璃襯管表面金屬離子間的相互作用所致。當(dāng)基質(zhì)成分通過襯管和色譜柱時(shí)掩蔽活性位點(diǎn),減少了分析物的吸附和分解,與無基質(zhì)注射相比有更多的分析物到達(dá)檢測(cè)器,導(dǎo)致基質(zhì)誘導(dǎo)增強(qiáng)效應(yīng)[11]。

GC-MS/MS農(nóng)藥殘留檢測(cè)中通常采用基質(zhì)匹配法[12]、同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)法[13]、標(biāo)準(zhǔn)加入法[14]、分析保護(hù)劑法[15]等方法消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響。其中分析保護(hù)劑(AP)可以與農(nóng)藥競(jìng)爭(zhēng)吸附襯管中的活性位點(diǎn),減少了在這些活性位點(diǎn)上吸附或降解引起的敏感分析物的損失,尤其是熱不穩(wěn)定農(nóng)藥,從而提高純?nèi)軇┲修r(nóng)藥的響應(yīng)值,使之接近基質(zhì)中農(nóng)藥的響應(yīng)[16]。目前在農(nóng)殘分析中應(yīng)用的分析保護(hù)劑主要有3-乙氧基-1,2-丙二醇[17-20]、L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯[21]、山梨糖醇[22]、D-核糖酸-γ-內(nèi)酯[23-24]、莽草酸[25]、聚乙二醇[26-27]、乙二醇[28]、橄欖油[29]、深共晶溶劑[30]等。莽草酸是堿不穩(wěn)定農(nóng)藥的保護(hù)劑,3-乙氧基-1,2-丙二醇是揮發(fā)性農(nóng)藥的合適分析保護(hù)劑,對(duì)出峰較早的農(nóng)藥有明顯的保護(hù)作用,L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯是半揮發(fā)性農(nóng)藥的合適保護(hù)劑,山梨糖醇可以作為低揮發(fā)性農(nóng)藥的合適保護(hù)劑,對(duì)晚洗脫農(nóng)藥有較好的補(bǔ)償效果[31],但山梨糖醇對(duì)保留時(shí)間位于中部的農(nóng)藥補(bǔ)償效果好[32],復(fù)合分析保護(hù)劑往往可實(shí)現(xiàn)對(duì)性質(zhì)差異較大農(nóng)藥的滿意定量[31,32]。大米中農(nóng)藥殘留限量眾多,性質(zhì)差異大,多殘留同時(shí)檢測(cè)性能保障難度大,利用分析保護(hù)劑是提高大米中多農(nóng)殘檢測(cè)性能的途徑之一。目前有關(guān)保護(hù)劑在氣質(zhì)聯(lián)用大米多農(nóng)殘檢測(cè)中基質(zhì)效應(yīng)補(bǔ)償作用的系統(tǒng)研究鮮有報(bào)道。

研究以大米中47種農(nóng)藥及其代謝物(GB 2763—2021)為研究對(duì)象,系統(tǒng)考察了D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯、莽草酸和3-乙氧基-1,2-丙二醇4種分析保護(hù)劑對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的補(bǔ)償作用,進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)合分析保護(hù)劑,探討復(fù)合分析保護(hù)劑對(duì)大米農(nóng)藥殘留檢測(cè)定量分析結(jié)果可靠性的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TRACE1310-TSQ8000Evo氣相色譜/三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有EI源;5810R離心機(jī),TARGINVX-Ⅲ多管渦旋振蕩器。

乙腈(色譜純)、乙酸(色譜純)、無水硫酸鎂(分析純)、氯化鈉(分析純)、PSA和三官能十八烷基/硅膠基體(C18,粒徑40 μm)、實(shí)驗(yàn)用水為Mili-Q超純水、L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯(分析純)、D-山梨糖醇(分析純)、莽草酸(分析純)、3-乙氧基-1,2-丙二醇(分析純)。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品:47種農(nóng)藥及其代謝物單標(biāo),質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL。

原料:大米。

1.2 溶液配制

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:用乙腈配制47種農(nóng)藥及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃保存。使用前用乙腈或空白基質(zhì)溶液稀釋至所需質(zhì)量濃度。

D-山梨糖醇儲(chǔ)備液(50 mg/mL):稱取山梨糖醇500 mg于10 mL容量瓶中,加5 mL水溶解后,乙腈定容。

L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯儲(chǔ)備液(50 mg/mL):稱取L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯500 mg于10 mL容量瓶中,加4 mL水溶解后,乙腈定容。

莽草酸儲(chǔ)備液(50 mg/mL):稱取莽草酸500 mg于10 mL容量瓶中,加4 mL水溶解后,乙腈定容。

3-乙氧基-1,2-丙二醇儲(chǔ)備液(150 mg/mL):稱取3-乙氧基-1,2-丙二醇150 mg于1 mL容量瓶中,用乙腈定容。將4種儲(chǔ)備液按不同配比進(jìn)行混合,用于AP優(yōu)化。

1.3 樣品前處理

樣品提取:稱取5 g粉碎的均勻試樣(精確到0.001 g)于50 mL 離心管中,加入 20 mL 70∶29∶1(體積比)的乙腈∶水∶乙酸混合溶液,2 500 r/min 渦旋混勻20 min,7 000 r/min離心5 min,取上清液10 mL,加入 2.0 g 無水硫酸鎂和 0.8 g 氯化鈉,以2 700r/min渦旋混勻5 min,使乙腈和水相分層。

樣品凈化:移取2 mL上層乙腈溶液于15 mL刻度離心管中,離心管中事先加入20 mg PSA、50 mg C18、300 mg無水硫酸鎂,搖勻后2 500 r/min渦旋混勻5 min,7 000 r/min離心 5 min,取上清液過 0.2 μm濾膜。

樣品上機(jī)液配制:準(zhǔn)確移取1 mL過濾后的溶液于進(jìn)樣瓶,并加入分析保護(hù)劑溶液0.06 mL,搖勻,待測(cè)。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱:TraceGOLDTMTG-OCPI色譜柱;30 m×0.25 mm×0.25 μm;色譜柱溫度:50 ℃,保持1 min,以25 ℃/min升溫至100 ℃,以8 ℃/min升溫至300 ℃,保持10 min;載氣:氦氣,純度≥99.999%,流速1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度:280 ℃;進(jìn)樣量:1 μL;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊源:70 eV;離子源溫度:300 ℃;傳輸線溫度:280 ℃。

多反應(yīng)監(jiān)測(cè):每種農(nóng)藥分別選擇1對(duì)定量離子、1對(duì)定性離子。每種農(nóng)藥的保留時(shí)間、定量離子對(duì)、定性離子對(duì)和碰撞電壓,見表1。

表1 47種農(nóng)藥及代謝物的質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 大米中47種農(nóng)藥及其代謝物基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

配制質(zhì)量濃度為100 μg/L的農(nóng)藥純?nèi)軇?乙腈)標(biāo)液及大米基質(zhì)標(biāo)液,采用基質(zhì)中目標(biāo)物響應(yīng)值(峰面積)與純?nèi)軇┲心繕?biāo)物響應(yīng)值(峰面積)比值(用百分?jǐn)?shù)表示),對(duì)大米中農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。除特樂酚和戊硝酚外,大米中其他45種農(nóng)藥及代謝物基質(zhì)效應(yīng)>120%,為基質(zhì)誘導(dǎo)增強(qiáng)效應(yīng)。

2.2 單一分析保護(hù)劑對(duì)MEs的影響

本研究選用D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-內(nèi)酯、莽草酸和3-乙氧基-1,2-丙二醇4種分析保護(hù)劑,考察每種保護(hù)劑不同濃度下對(duì)溶劑中農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)的補(bǔ)償作用及對(duì)峰形的改善效果。配制質(zhì)量濃度為100 μg/L農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)乙腈溶液,分別添加單一不同濃度的保護(hù)劑,使上機(jī)液中D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯、莽草酸的質(zhì)量濃度均依次為0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL,3-乙氧基-1,2-丙二醇的質(zhì)量濃度依次為0.25、0.50、1.00、2.00、6.00 mg/mL。采用加入AP溶劑中目標(biāo)物響應(yīng)值與純?nèi)軇┲心繕?biāo)物響應(yīng)值比值(用百分?jǐn)?shù)表示),評(píng)價(jià)分析保護(hù)劑對(duì)溶劑中農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)補(bǔ)償作用。

從圖1中看出,當(dāng)上機(jī)液中D-山梨糖醇為0.1、0.2、0.4 mg/mL低質(zhì)量濃度時(shí),D-山梨糖醇對(duì)溶劑中絕大部分農(nóng)藥無基質(zhì)補(bǔ)償作用,出現(xiàn)不顯著的基質(zhì)抑制效應(yīng),初步分析可能當(dāng)D-山梨糖醇濃度較低,搶占活性位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)不明顯,反而因D-山梨糖醇添加又產(chǎn)生了新的活性位點(diǎn)吸附農(nóng)藥,從而表現(xiàn)出基質(zhì)抑制效應(yīng)。當(dāng)添加質(zhì)量濃度增加到0.8 mg/mL時(shí),基質(zhì)效應(yīng)由抑制轉(zhuǎn)為增強(qiáng),除α-六六六、氯丹、特樂酚、狄氏劑、p,p′-滴滴滴、o,p′-滴滴涕、p,p′-滴滴涕外,其他農(nóng)藥均表現(xiàn)出明顯的基質(zhì)補(bǔ)償作用,特別是對(duì)出峰時(shí)間17.8 min之前的農(nóng)藥(除特樂酚、戊硝酚外)基質(zhì)補(bǔ)償作用顯著,與基質(zhì)溶液中農(nóng)藥響應(yīng)相當(dāng),但17.8 min后大部分農(nóng)藥的響應(yīng)仍與基質(zhì)溶液中有較大差距。當(dāng)添加質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí),除特樂酚、戊硝酚外,其他農(nóng)藥并未出現(xiàn)進(jìn)一步的基質(zhì)補(bǔ)償。說明添加質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí),氣相色譜中的活性位點(diǎn)幾乎已經(jīng)被全部占據(jù),繼續(xù)增加D-山梨糖醇,不能表現(xiàn)更好的補(bǔ)償作用。確定D-山梨糖醇單一添加時(shí),最佳質(zhì)量濃度為0.8mg/mL。隨著D-山梨糖醇濃度的增加,溶劑中農(nóng)藥的峰形有明顯的改善,但敵稗和甲萘威仍存在拖尾的現(xiàn)象,見圖2。

圖1 不同濃度的D-山梨糖醇對(duì)溶劑中農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)的影響

圖2 D-山梨糖醇對(duì)溶劑中敵稗和甲萘威的峰形改善效果

與D-山梨糖醇不同,當(dāng)上機(jī)液中L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯和莽草酸為0.1、0.2、0.4 mg/mL低質(zhì)量濃度時(shí),絕大部分農(nóng)藥無基質(zhì)抑制效應(yīng)。在0.1～0.8 mg/mL范圍內(nèi),溶劑中農(nóng)藥響應(yīng)隨莽草酸添加質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)明顯遞增趨勢(shì),而添加L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯的溶液中僅氯酞酸甲酯之前出峰的農(nóng)藥響應(yīng)隨添加質(zhì)量濃度增加緩慢遞增。當(dāng)L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯和莽草酸添加質(zhì)量濃度分別繼續(xù)增加到1 mg/mL時(shí),與D-山梨糖醇類似,溶劑中農(nóng)藥并未出現(xiàn)明顯進(jìn)一步的基質(zhì)補(bǔ)償。確定L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯和莽草酸單一最佳添加質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL。

由圖3可見,添加不同質(zhì)量濃度3-乙氧基-1,2-丙二醇時(shí),14.5 min之前出峰的農(nóng)藥,隨著添加濃度增大,基質(zhì)效應(yīng)由抑制逐漸變?yōu)樵鰪?qiáng),達(dá)到基質(zhì)溶液中農(nóng)藥響應(yīng)水平;14.5 min之后出峰的農(nóng)藥,基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯,且農(nóng)藥響應(yīng)不隨添加濃度增加而發(fā)生明顯變化。3-乙氧基-1,2-丙二醇對(duì)在溶劑中峰形較差的農(nóng)藥沒有明顯改善,如敵稗、甲萘威、氟除草醚、格螨酯、三唑磷和氟酰胺,甚至氟除草醚和格螨酯拖尾更加嚴(yán)重;但添加2.0、6.0 mg/mL時(shí),氯苯甲醚和禾草敵前延峰得到非常明顯的改善。而D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯或莽草酸對(duì)氯苯甲醚和禾草敵前延峰沒有改善,這是因?yàn)?-乙氧基-1,2-丙二醇是揮發(fā)性農(nóng)藥的合適分析保護(hù)劑,對(duì)出峰較早的農(nóng)藥有明顯的保護(hù)作用[30]。確定3-乙氧基-1,2-丙二醇單一添加時(shí),最佳質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL。

圖3 3-乙氧基-1,2-丙二醇對(duì)溶劑中氯苯甲醚和禾草敵的峰形改善效果

在理想狀態(tài)下通常認(rèn)為在純?nèi)軇?biāo)樣和待測(cè)樣品中加入相同量的分析保護(hù)劑,保護(hù)劑能同等程度地補(bǔ)償標(biāo)樣溶液和樣品溶液的基質(zhì)效應(yīng)。為此,研究同時(shí)考察了每種分析保護(hù)劑不同濃度下對(duì)大米基質(zhì)中農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng),并與添加同樣分析保護(hù)劑的乙腈溶液中農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行對(duì)比。實(shí)驗(yàn)中配制質(zhì)量濃度為100 μg/L農(nóng)藥混合大米基質(zhì)溶液,分別添加不同濃度單一分析保護(hù)劑。在D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯、莽草酸最佳質(zhì)量濃度下(0.8mg/mL)下,分別對(duì)應(yīng)有14、13、21種農(nóng)藥及其代謝物的基質(zhì)補(bǔ)償為80%～130%,可見單一保護(hù)劑對(duì)全部47種農(nóng)藥及其代謝物的補(bǔ)償效果不太理想。

2.3 復(fù)合分析保護(hù)劑的優(yōu)化

單一分析保護(hù)劑對(duì)大米中農(nóng)藥MEs補(bǔ)償作用研究表明,單一分析保護(hù)劑作用存在局限性。D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯、莽草酸和3-乙氧基-1,2-丙二醇對(duì)低揮發(fā)性農(nóng)藥、半揮發(fā)性農(nóng)藥和揮發(fā)性農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)補(bǔ)償作用各不同。如進(jìn)行復(fù)配,發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì),可能實(shí)現(xiàn)對(duì)性質(zhì)差異較大農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)補(bǔ)償作用。本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)合分析保護(hù)劑,見表2。

表2 優(yōu)化復(fù)合分析保護(hù)劑正交實(shí)驗(yàn)

當(dāng)分別向基質(zhì)混標(biāo)和溶劑混標(biāo)溶液中添加不同質(zhì)量濃度組合的D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯、莽草酸和3-乙氧基-1,2-丙二醇混合溶液時(shí),不同濃度組合所對(duì)應(yīng)的基質(zhì)效應(yīng)有顯著差異,見表3。從基質(zhì)補(bǔ)償作用看,混合AP最優(yōu)組合為AP5,有29種農(nóng)藥及其代謝物的ME比值為80%～130%,可見無論是單一保護(hù)劑還是復(fù)合保護(hù)劑很難確保對(duì)標(biāo)樣溶液中所有農(nóng)藥的響應(yīng)增強(qiáng)作用都達(dá)到農(nóng)藥在樣品溶液中的響應(yīng)程度,即對(duì)基質(zhì)效應(yīng)無法達(dá)到同等程度補(bǔ)償?shù)哪康?難以實(shí)現(xiàn)無空白基質(zhì)的基質(zhì)中農(nóng)藥的準(zhǔn)確定量,這一結(jié)論與文獻(xiàn)一致[2]。組合AP5中,禾草敵和氯苯甲醚的前延峰明顯,而組合AP3,即樣品上機(jī)液中D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯、莽草酸和3-乙氧基-1,2-丙二醇質(zhì)量濃度為0.2、0.8、0.8、2.0 mg/mL時(shí)對(duì)這2種農(nóng)藥前延峰改善效果良好且其他分析物峰形也處于較理想狀態(tài),補(bǔ)償綜合作用良好(見圖4),因此,在實(shí)際測(cè)定過程,采取AP3保護(hù)劑基質(zhì)標(biāo)曲作為樣品定量標(biāo)曲。

圖4 AP3和AP5對(duì)氯苯甲醚和禾草敵峰形的影響

表3 復(fù)合分析保護(hù)劑對(duì)大米基質(zhì)中農(nóng)藥與對(duì)溶劑中農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)補(bǔ)償作用對(duì)比

2.4 方法的回收率、精密度和檢出限

選用本研究?jī)?yōu)化的復(fù)合分析保護(hù)劑AP3基質(zhì)標(biāo)曲定量,各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線在2.5～200.0 μg/L范圍內(nèi),線性良好,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.996。以空白大米樣品作為添加回收實(shí)驗(yàn)的基質(zhì),加標(biāo)水平分別為10、100、200 μg/kg,每個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),計(jì)算各添加水平下的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(見圖5)。在10 μg/kg添加水平下,各農(nóng)藥回收率62.2%～117.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.3%～29.3%;在100 μg/kg添加水平下,各農(nóng)藥回收率79.3%～97.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.4%～10.8%;在200 μg/kg添加水平,各農(nóng)藥回收率 83.1%～96.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.4%～14.9%。除滅草環(huán)在10 μg/kg回收率(58.7%)略低于農(nóng)業(yè)部公告2386號(hào)要求(0.01 mg/kg添加水平,60%～120%),三氟硝草醚在10 μg/kg回收率(122.2%)略高于農(nóng)業(yè)部公告2386號(hào)要求(0.01 mg/kg添加水平,60%～120%)外,其他農(nóng)藥在10～200 μg/kg添加水平下,均符合公告要求。該方法各農(nóng)藥定量限為0.01 mg/kg,檢出限小于0.001 mg/kg,能滿足GB 2763—2021 中大米中農(nóng)藥限量檢測(cè)的要求,可應(yīng)用于大米中限量農(nóng)殘的日常檢測(cè)工作中。該法與GB 23200.113—2018對(duì)比,在3個(gè)加標(biāo)水平下,47種農(nóng)藥及代謝物回收率結(jié)果更好,特別是低沸點(diǎn)易揮發(fā)農(nóng)藥優(yōu)勢(shì)明顯。

圖5 2種方法47種農(nóng)藥及代謝物不同水平加標(biāo)回收率對(duì)比

3 結(jié)論

通過系統(tǒng)研究4種分析保護(hù)劑對(duì)大米中47種農(nóng)藥及其代謝物基質(zhì)補(bǔ)償作用的影響,確定了單一保護(hù)劑的最佳添加濃度,為科研工作者開展分析保護(hù)劑在大米農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用研究提供了參考思路。經(jīng)優(yōu)化,獲得的復(fù)合分析保護(hù)劑AP3(上機(jī)液中D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯、莽草酸、3-乙氧基-1,2-丙二醇的質(zhì)量濃度分別為0.2、0.8、0.8、2.0mg/mL),能有效改善禾草敵和氯苯甲醚的前延峰,且其他分析物峰形也處于較理想狀態(tài),補(bǔ)償綜合作用良好。

本研究建立的同時(shí)檢測(cè)大米中47種農(nóng)藥及其代謝物殘留的方法,采用AP3基質(zhì)標(biāo)曲定量,操作簡(jiǎn)單,定量準(zhǔn)確,各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線在2.5～200.0 μg/L范圍內(nèi),線性良好,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.996,定量限為0.01 mg/kg,樣品平均加標(biāo)回收率滿足方法學(xué)要求,與GB 23200.113—2018對(duì)比,47種農(nóng)藥及代謝物回收率結(jié)果更好,適用于大批量大米樣品中農(nóng)藥篩查和定量檢測(cè)。