方 芳,劉新穎,顧媛媛,蒙艷麗,郭玉巖△,左 軍,龍 宇,郭媛琦

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150036

哮喘為一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病,根據(jù)全球哮喘倡議(GINA)報(bào)告,許多國家的患病率有所增加,特別是在兒童中[1],哮喘以咳嗽、喘息、呼吸短促和胸悶為典型臨床表現(xiàn),并伴有呼氣氣流受限的癥狀[2],其發(fā)病嚴(yán)重影響人們的日常工作、學(xué)習(xí)和生活。吸入糖皮質(zhì)激素(ICS)和支氣管擴(kuò)張劑是哮喘治療的首選一線治療方法,可以控制哮喘癥狀、提高患者生活質(zhì)量和改善肺功能,降低發(fā)病率和死亡率[3]。而長期使用ICS有明顯的副作用,據(jù)統(tǒng)計(jì),在服用ICS的患者中,約有5%～10%的患者仍有呼吸困難的癥狀,并面臨嚴(yán)重哮喘惡化的風(fēng)險[4-5]。除了一線療法外,一些補(bǔ)充和替代療法被證明具有明顯的優(yōu)勢,針灸是臨床上治療哮喘的常用方法。然而,針灸治療哮喘的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明,本研究旨在基于蛋白質(zhì)組學(xué)探析針灸治療哮喘的作用機(jī)制,為哮喘的治療提供新的思路和方法。

1 哮喘的發(fā)病機(jī)制研究

哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚無統(tǒng)一認(rèn)識,普遍認(rèn)為哮喘發(fā)病機(jī)制與氣道慢性炎性癥狀、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑、遺傳機(jī)制及機(jī)體免疫平衡遭到破壞有關(guān),可由一種或多種因素共同作用。從氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑3方面討論哮喘的發(fā)病機(jī)制如下。

1.1 氣道炎癥

氣道炎癥是哮喘發(fā)病的核心環(huán)節(jié),哮喘的炎癥反應(yīng)是由多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子參與并相互作用的結(jié)果,鈣結(jié)合在哮喘早期炎癥發(fā)生的過程中起核心作用[6],抗原通過抗原遞呈細(xì)胞激活T細(xì)胞,活化的輔助性T細(xì)胞(主要是Th2細(xì)胞)產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-5及IL-13等進(jìn)一步激活B淋巴細(xì)胞,后者合成特異性免疫球蛋白E(IgE),并結(jié)合肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞(EOS)等細(xì)胞表面的IgE受體。由EOS、中心粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等共同參與[2]。炎癥細(xì)胞合成和釋放多種炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子,造成氣道炎癥,導(dǎo)致哮喘發(fā)作。

1.2 氣道高反應(yīng)性

氣道高反應(yīng)性(AHR)是因氣道炎癥而貫穿哮喘全過程的氣道病理狀態(tài)。AHR反映由于一系列直接或間接刺激引起的氣道平滑肌(ASM)收縮增加或功能障礙。有研究表明,T細(xì)胞的生理活動是哮喘AHR和炎癥預(yù)后的關(guān)鍵因素[7]。T淋巴細(xì)胞亞群的變化中,以Th1/Th2和Th17/Treg平衡最為重要,Th2型細(xì)胞因子IL-13是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵因子,通過促進(jìn)黏液分泌和加重氣道高反應(yīng)性而引發(fā)哮喘,而Th1的細(xì)胞因子IL-12能下調(diào)Th2型細(xì)胞因子,降低氣道高反應(yīng)性,通過增強(qiáng)Th1細(xì)胞抑制Th2細(xì)胞分化促進(jìn)Th1/Th2平衡的恢復(fù)[3],有助于哮喘的防治,Treg/Th17失衡也可能導(dǎo)致哮喘患者氣道高反應(yīng)性,針刺可以緩解這種失衡,CD4+T細(xì)胞亞群的平衡參與了針灸治療哮喘氣道高反應(yīng)性的治療過程[8]。

1.3 氣道重塑

氣道重塑是哮喘的主要病理特征,氣道重塑包括呼吸道的各種結(jié)構(gòu)變化如上皮變化、粘液腺增生、上皮下膠原層增厚、粘膜下基質(zhì)沉積增加、ASM肥大和增生以及ASM束中肥大細(xì)胞[2]。氣道重塑的最顯著特征之一是氣道平滑肌增厚,且無論是成年人還是兒童,平滑肌質(zhì)量的變化都與哮喘的嚴(yán)重程度有關(guān)[4]。Rho/ rhokinase介導(dǎo)的信號通路在哮喘氣道平滑肌收縮、氣道重塑和氣道炎癥過程中起重要作用。TGF-β1被認(rèn)為是氣道重塑的主要中介[9],整個哮喘病程中均有TGF-β1的分泌,且易導(dǎo)致皮層纖維化,哮喘急性發(fā)作期能促使氣道平滑肌細(xì)胞向上皮層移動,形成新的平滑肌束。Smads蛋白是TGF-β家族的特異性細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)通路可能通過調(diào)控平滑肌肌動蛋白(α-SMA)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞,導(dǎo)致哮喘氣道重塑。劉慧慧等[10]發(fā)現(xiàn)針刺“肺俞”“定喘”“孔最”“魚際”均可下調(diào)哮喘大鼠高表達(dá)的TGF-β1、Smad3 mRNA蛋白水平,減輕氣道重塑。既往研究表明,平滑肌細(xì)胞可促進(jìn)哮喘纖維增殖性氣道重塑,TGF-β1是關(guān)鍵誘導(dǎo)信號,TGF-β在哮喘氣道重塑的結(jié)構(gòu)改變中起著重要作用[8]。

2 針灸治療哮喘

2.1 針灸治療哮喘的特點(diǎn)

針灸是中醫(yī)的組成部分,用于治療包括哮喘在內(nèi)的多種疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)針灸療法主要通過對神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)發(fā)揮治療作用,針灸作為一種非特異性的物理刺激,對疾病的影響是通過激發(fā)體內(nèi)固有的調(diào)節(jié)系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)的,通過人體經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)發(fā)揮整體調(diào)節(jié)和雙向調(diào)節(jié)等特點(diǎn)。

2.2 針灸治療哮喘的優(yōu)勢

以針刺、灸法等療法為代表的針灸療法,是在中醫(yī)整體觀念以及辨證論治的指導(dǎo)下,通過調(diào)整人體臟腑氣血陰陽,達(dá)到改善肺功能、緩解臨床癥狀的功效。針灸療法被廣泛應(yīng)用于哮喘等異質(zhì)復(fù)雜疾病的治療,對比西醫(yī)西藥具有價格低廉的優(yōu)勢。同時,針灸具有療效良好、安全性高和無副作用等優(yōu)勢。近年來相關(guān)臨床研究逐漸增多,證實(shí)了針灸療法具有改善肺功能、調(diào)節(jié)人體免疫、改善哮喘癥狀以及提高活動耐量的作用,受到越來越多患者的接受和認(rèn)可,大量臨床報(bào)道證明針灸治療哮喘有效。徐寧等[11]選取邵經(jīng)明教授總結(jié)的治療哮喘的經(jīng)驗(yàn)穴“肺俞”“大椎”“風(fēng)門”進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)針灸此3個穴位能明顯降低哮喘模型大鼠血清中IL-13及肺組織中STAT6的陽性表達(dá),證實(shí)針灸可以緩解氣道炎癥,降低氣道高反應(yīng)性,改善氣道重塑,從而改善哮喘。李巍等[12]將92例哮喘患者隨機(jī)分為治療組(46例)和對照組(46例),治療組采用電針肺俞穴,對照組口服舒氟美治療,結(jié)果顯示電針肺俞穴能顯著提高PEF、FEV1、FVC及FEV1%水平,改善哮喘的喘息、氣短和咳嗽等癥狀,使患者生活質(zhì)量明顯提高,表明針灸是治療哮喘的一種有效治療方法。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在針灸治療哮喘機(jī)制研究中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)的組成與活動規(guī)律,旨在了解這些蛋白質(zhì)在不同環(huán)境和條件下的行為,與中醫(yī)的“整體觀念”不謀而合。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是揭示生命過程或疾病狀態(tài)差異表達(dá)蛋白質(zhì),預(yù)測藥物治療靶點(diǎn)和作用機(jī)制的精確方法;是后基因組時代迅速發(fā)展的先進(jìn)組學(xué)技術(shù),主要研究某一細(xì)胞、組織或生物體在特定階段或生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)組成及變化規(guī)律,是篩選疾病早期診斷標(biāo)志物與藥物治療靶點(diǎn)的重要技術(shù)手段。

3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)與氣道炎癥

鈣結(jié)合在哮喘早期炎癥發(fā)生的過程中起核心作用,S100蛋白包含兩個EF-hand鈣結(jié)合基序,與炎癥密切相關(guān),其中S100A8和S100A9兩種鈣結(jié)合蛋白在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞溶膠中高度表達(dá)[13],誘導(dǎo)多種促炎分子的表達(dá),激活p38或p44/42 MAP激酶和NF-κB等信號通路[6],有實(shí)驗(yàn)證明抑制S100A8和S100A9可減少向肺部遷移的炎癥細(xì)胞[14]。CC10蛋白是一種激素誘導(dǎo)的、進(jìn)化保守的分泌蛋白,屬于分泌紅蛋白家族[15],CC10基因表達(dá)降低的大鼠在哮喘發(fā)作時,S100A8和S100A9水平也會升高,并伴有免疫球蛋白中的RAGE蛋白水平升高,針灸治療哮喘可能通過抑制這些炎癥相關(guān)蛋白發(fā)揮作用[16]。蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要內(nèi)容,金屬硫蛋白-2(MT-2)是一種高金屬離子含量的人類低分子量蛋白,對外界因素敏感,可被激素、細(xì)胞因子和氧化劑等高度誘導(dǎo)[17-18],MT-2缺失的小鼠肺中IL-1β和支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞水平顯著升高,抗卵清蛋白抗體水平明顯高于對照組,提示MT-2水平升高可能有助于哮喘的緩解,MT-2與針灸改善哮喘肺功能相關(guān),特異性上調(diào)MT-2mRNA表達(dá),MT-2可松弛氣道平滑肌并誘導(dǎo)一系列蛋白質(zhì)磷酸化,在針灸治療哮喘中起重要作用[16]。

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)與氣道重塑

氣道重塑是哮喘難治的關(guān)鍵因素,氣道重塑的主要表現(xiàn)是氣道平滑肌肥大增生,平滑肌細(xì)胞促進(jìn)哮喘纖維增殖性氣道重塑,Akt1是介導(dǎo)MT-2作用的最重要的樞紐蛋白之一,參與哮喘氣道平滑肌的重塑。Akt1磷酸化與氣道平滑肌收縮松弛密切相關(guān),質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)或慢病毒感染導(dǎo)致Akt1過表達(dá),可導(dǎo)致氣道平滑肌細(xì)胞增大,蛋白質(zhì)含量增加,提示Akt1激活可促進(jìn)哮喘氣道平滑肌肥大[18-19]。MT-2通過增加Akt1在Thr450位點(diǎn)的磷酸化來顯著放松氣道平滑肌細(xì)胞,改善氣道重塑的情況。CaMK2β是另一個可被MT-2誘導(dǎo)的重要蛋白,CaMK2是一種多功能激酶,控制細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、遷移等,CaMK2β作為CaMK2家族的重要成員,參與肌動蛋白的組裝和結(jié)構(gòu)調(diào)控,可增強(qiáng)肌球蛋白RLC磷酸化,從而收縮平滑肌,改善氣道重塑,另外,研究發(fā)現(xiàn)CaMK2β和Akt1之間存在相關(guān)性[19-20]。針灸可以顯著改善哮喘大鼠模型中的肺阻力,Akt1和CaMK2β等蛋白的相關(guān)磷酸化變化可能在針灸治療哮喘的療效中發(fā)揮重要作用[18]。

3.3 蛋白組學(xué)與氣道高反應(yīng)性

氣道高反應(yīng)性是由于一系列直接或間接刺激引起的氣道平滑肌收縮增加或功能障礙。有研究表明,AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶,能通過活化一系列不同的下游信號分子來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、凋亡。徐慧等[21]研究發(fā)現(xiàn),哮喘大鼠磷酸化AKT的表達(dá)明顯升高,IL-12含量明顯降低,磷酸化AKT蛋白通過上調(diào)IL-13、下調(diào)IL-12等細(xì)胞因子影響Th1/Th2的平衡,表明PI3K/AKT信號通路通過影響Th1/Th2炎性反應(yīng)因子參與了AHR的過程,T細(xì)胞的生理活動是哮喘AHR和炎癥預(yù)后的關(guān)鍵因素,因?yàn)槠湓诿庖卟±韺W(xué)和過敏原性之間建立了平衡[7]。胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(PI3K)能參與哮喘相關(guān)T細(xì)胞的發(fā)育、活化、增殖及分化,抑制PI3K信號通路可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá),還能使轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)下降,RORγt/Foxp3的表達(dá)優(yōu)勢發(fā)生逆轉(zhuǎn),從而實(shí)現(xiàn)對哮喘Th17/Treg失衡的調(diào)控[22]。針灸治療后Th17細(xì)胞的減少能減弱Treg的中和,在T淋巴細(xì)胞亞群的變化中,以Th1/Th2和Th17/Treg平衡最為重要,針灸能顯著抑制哮喘大鼠肺組織中STAT3蛋白的表達(dá)、促進(jìn)FOXP3蛋白的表達(dá),從而調(diào)節(jié)Th17/Treg免疫失衡狀態(tài)[23-24]。

4 小結(jié)

綜上所述,針灸作為對哮喘的治療具有顯著的臨床療效,但其作用機(jī)制尚未明確,通過運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),全面揭示哮喘在蛋白水平的變化趨勢,找出潛在的診斷標(biāo)志物,預(yù)測藥物治療靶點(diǎn)及作用機(jī)制,找出針灸的主要作用途徑,為針灸作用的深入研究奠定基礎(chǔ)。因此,基于蛋白質(zhì)組學(xué)的針灸治療哮喘機(jī)制研究將為針灸治療哮喘提供重要科學(xué)依據(jù)。