王家麗,楊 帆,邵文華,黃夢瑤,曹偉軍,蒲秀瑛, 張 偉*,鄭海學,3*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州獸醫(yī)研究所 蘭州大學動物醫(yī)學與生物安全學院 動物疫病防控全國重點實驗室國家口蹄疫參考實驗室,蘭州 730000;2.蘭州理工大學 生命科學與工程學院,蘭州 730050;3.甘肅省病原生物學基礎學科研究中心,蘭州 730046)

Toll相互作用蛋白(Tollip)是Toll樣受體(TLR)相關信號蛋白,在TLR信號通路中作為內源性調節(jié)因子[1],也在一系列信號通路中充當重要的負調節(jié)因子,是一種模塊化蛋白,具有Myb1(Tom1)N端靶標結合結構域(TBD)、中央保守2(C2)結構域和泛素與內質網(wǎng)降解(CUE)結構域的C端偶聯(lián)。Tollip是先天性白細胞中的一種穩(wěn)態(tài)調節(jié)因子,負責協(xié)調巨噬細胞極化以減輕炎癥[2]。

有研究表明,Tollip通過促進自噬實現(xiàn)其穩(wěn)態(tài)功能[3]。通過減少表達或改變細胞定位來參與自噬、細胞應激和炎癥的破壞[4]。Tollip基因的遺傳多態(tài)性與多種細菌和原生動物疾病有關[5]。此外Tollip在腸黏膜炎癥、α-皰疹病毒、冠狀病毒、甲型流感病毒、登革熱病毒、HIV病毒、非洲豬瘟病毒等方面有廣泛的研究, 然而,它在口蹄疫中的作用尚不清楚,相關研究甚少,為此,作者在PK-15細胞上構建Tollip缺失細胞系,研究Tollip的缺失對FMDV復制的影響,為后續(xù)Tollip功能研究及抗病毒機制研究提供理論依據(jù)。

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)是單股正鏈RNA病毒,屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬。FMDV與其他小RNA病毒相比,具有廣泛的宿主嗜性,可以感染家養(yǎng)和野生的偶蹄動物[6]。FMDV的快速和廣泛傳播對動物健康和肉食品安全產(chǎn)生重大影響,并給全球畜牧業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失[7]。FMDV 基因組 ORF 編碼一個多聚蛋白,經(jīng)逐級降解,產(chǎn)生多個中間蛋白和約 12 個成熟蛋白。中間和成熟病毒蛋白都在病毒生命周期中發(fā)揮功能[8],但這些蛋白不足以完成FMDV的生命周期,因而必須借助宿主細胞蛋白,宿主細胞蛋白種類繁多,功能多樣,其中,一些蛋白質功能的發(fā)揮有利于病毒生長,另一些蛋白質功能的發(fā)揮威脅病毒生存[9]。病毒要成功感染宿主細胞,一方面要通過一定的機制利用宿主細胞蛋白表達病毒蛋白、復制病毒基因組和組裝子代病毒粒子,另一方面病毒需要通過某種方式避免其被宿主清除,包括逃避免疫監(jiān)視、抑制免疫相關基因表達、誘導凋亡等。

本研究發(fā)現(xiàn)宿主蛋白Tollip在調控FMDV復制中有重要作用,采用CRISPR/Cas9基因編輯技術,在PK-15細胞上成功構建了Tollip敲除細胞系,該細胞系為研究宿主蛋白Tollip在調控FMDV生活史復制中的作用提供良好的細胞模型。通過實時熒光定量PCR、Western blot和病毒滴度測定試驗,評價Tollip對FMDV感染的PK-15細胞的作用,為進一步闡明Tollip抑制FMDV復制及調控FMDV復制機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 載體、細胞及病毒

CRISPR/Cas9 載體質粒pX459-puro-MCS 、PK-15細胞、BHK-21 細胞、FMDV(O/BY/CHA/2010)來源于中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫與新發(fā)病流行病學團隊與國家口蹄疫參考實驗室。

1.2 試劑及抗體

DMEM細胞培養(yǎng)基及0. 25% EDTA胰酶購自Gibco公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)、T4 DNA連接酶購自寶生物公司;胎牛血清(FBS)購自Biological Industries(BI)公司;蛋白預染Marker、Trizol試劑等均購自 Invitrogen公司;Western-抗體稀釋液購自碧云天生物技術有限公司;10×PCR Buffer購自康為世紀生物科技有限公司;Prime Script TMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒、qPCR用SYBR Green qPCR Super Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自OMEGA公司;Polyplus jetPRIME轉染試劑購自Polyplus Transfection公司。蛋白檢測顯色試劑盒(Pierce TM ECL Western Blotting Substrate)購自Thermo公司;限制性核酸內切酶BbsⅠ購自 NEB公司。Tollip抗體購自Proteintech公司。兔抗FMDV多克隆抗體由本實驗室保存;β-actin抗體購自Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔 IgG抗體、HRP標記的山羊抗鼠IgG抗體、Alex Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)購自Sigma-Aldrich (USA)公司。

1.3 sgRNA引物的設計及合成

自NCBI數(shù)據(jù)庫查詢Tollip基因序列(Transcript: ENSSSCT00000045167. 2),根據(jù)CRISPR/Cas9設計原則,基于張峰實驗室網(wǎng)站(http://crispr. mit. edu/)的推薦,在Tollip基因的外顯子區(qū)域設計兩條sgRNA序列,具體如表1所示。

表1 Tollip-sgRNA序列Table 1 Tollip-sgRNA sequences

1.4 重組質粒pX459-Tollip-sgRNA的構建

將上述sgRNA上下游引物進行退火處理,以形成雙鏈DNA。利用BbsI內切酶酶切pX459載體,膠回收酶切片段。將膠回收獲取的線性化酶切產(chǎn)物與gRNA序列在T4連接酶作用下進行連接,然后轉化到DH5α感受態(tài)細胞,涂布于氨芐抗性的固體LB平板中,37 ℃倒置培養(yǎng)過夜,挑取單克隆培養(yǎng),通過菌液PCR鑒定篩選陽性克隆,并提取質粒,送西安擎科生物科技有限公司測序。

1.5 細胞的轉染與篩選

復蘇PK-15細胞于T25細胞培養(yǎng)瓶中,放置37 ℃,5%CO2溫箱中培養(yǎng),傳代細胞1～2次,細胞狀態(tài)穩(wěn)定后鋪板繼續(xù)培養(yǎng),細胞生長密度至70%～80%后,根據(jù)Polyplus 的標準轉染程序,將CRISPR重組質粒轉染PK-15細胞系,轉染24 h后,加入終濃度3 μg·mL-1的嘌呤霉素篩選3 d后,剔除大量 sgRNA 陰性細胞,利用有限稀釋法進行亞克隆,接種于 96 孔板中,每孔 0.1 mL,即每孔中有 1 個細胞,篩選一周。單個細胞克隆形成后轉移至48孔板,擴大培養(yǎng),待細胞長滿,選取細胞狀態(tài)良好的孔進行傳代并鑒定。

1.6 Sanger 測序鑒定

取野生型細胞與待鑒定單克隆細胞株,使用細胞微量 DNA 提取試劑盒提取 DNA,用Tollip鑒定引物擴增含有 sgRNA 靶向位點的片段后,使用 1%瓊脂糖凝膠對質粒大小進行初步鑒定 ,擴增產(chǎn)物膠回收后,用測序引物進行測序,引物序列如下:5′-TTTCCGGAAATGTTTTTTCCGTA-3′(F);5′-GATCTCAACACGAGTCCTACA-3′(R)。

1.7 細胞活力檢測

將WT型PK-15細胞、Tollip-KO-1和Tollip-KO-2消化,細胞消化后計數(shù),調整細胞懸液濃度,每孔100 μL接種至96孔板,置細胞培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)一定時間;向板的每個孔加入 10 μL CCK-8 溶液,注意不要向孔中引入氣泡。置于細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 1～4 h,用酶標儀測定每孔在450 nm波長處的OD值,分析數(shù)據(jù)。

1.8 Western-blot 分析病毒蛋白的表達

為了研究敲除Tollip之后對FMDV蛋白水平的影響,將Tollip基因敲除PK-15細胞系Tollip-KO-1和Tollip-KO-2和野生型PK-15細胞(WT)分別接種6孔板,待細胞長滿后感染FMDV,收取細胞樣品。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉NC膜,冰浴中100V恒壓轉膜1.5 h。用TBST配置5%脫脂奶粉封閉1～2 h。β-actin抗體1∶1 000倍稀釋,兔抗FMDV多克隆抗體1∶1 000倍稀釋,孵育一抗4 ℃慢搖過夜,用TBST洗NC膜3遍,每次5 min。辣根過氧化物酶(HRP)標記的相應二抗1∶5 000倍稀釋,二抗室溫孵育1～2 h,用TBST洗NC膜3遍,每次5 min。蛋白檢測用Thermo公司的顯色試劑盒(PierceTMECL Western Blotting Substrate),1∶1配制,將NC膜浸潤在顯色液中,使用 Image Lab 4.1(BIO-RAD)掃描成像。

1.9 間接免疫熒光試驗

將 PK-15-Tollip-KO 和 PK-15-Tollip-WT 細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中,待細胞融合度約為 70%時,進行病毒感染,培養(yǎng) 8 h,棄去上清,用 PBS 清洗細胞 3 次;加入 4%多聚甲醛,4 ℃固定過夜;用 PBS 清洗細胞 3 次,每次 5 min;加入 0.3%的 Triton X-100 室溫通透 30 min;用 PBS 清洗細胞3次,加入 5% BSA 4 ℃封閉 4 h;加入用 PBS 溶液1∶500 倍稀釋的兔抗FMDV抗體作為一抗,4 ℃孵育過夜;PBST 清洗細胞 3 次,每次 10 min;加入用 PBS 溶液 1∶500 倍稀釋 的 Alex Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)作為二抗,4 ℃避光孵育過夜;PBST 清洗細胞 3 次,每次 10 min,再加入 0.5 mL DAPI 染核 15 min 后,用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光并拍照分析。

1.10 RT-qPCR檢測

分別將Tollip基因敲除PK-15細胞系Tollip-KO-1和Tollip-KO-2和野生型PK-15細胞(WT)鋪于6孔板中,待細胞長滿后感染FMDV,于0、4、12 h分別收取細胞,用Trizol裂解法提取細胞總RNA,測定濃度后,利用Prime Script TMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒進行反轉錄,qPCR用SYBR Green qPCR Super Mix試劑完成。GAPDH作為內參基因,對FMDV的相對表達水平進行定量。

1.11 病毒滴度

在Tollip基因敲除PK-15細胞系Tollip-KO-1、Tollip-KO-2和WT細胞中分別比較了病毒滴度的差異,將FMDV分別感染Tollip基因敲除PK-15細胞系Tollip-KO-1、Tollip-KO-2和WT細胞,不同時間點收取細胞樣品。反復凍融3次后,用無血清的DMEM將獲得細胞樣品進行10-2倍～10-8倍梯度稀釋,用各稀釋度毒液分別接種96孔細胞培養(yǎng)板中長滿單層的BHK-21細胞,每個稀釋度接種8個孔,每個孔100 μL。置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察4 d,每隔12 h觀察并記錄細胞病變(CPE)情況,根據(jù)Reed-Muench法計算擴增病毒的病毒滴度。

1.12 統(tǒng)計學分析

試驗數(shù)據(jù)使用 Graph pad Prism 8. 01 軟件進行統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)分析并作圖。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P< 0.001。

2 結 果

2.1 pX459-Tollip-sgRNA重組質粒的構建

根據(jù)CRISPR/Cas9設計原則,利用CRISPR軟件在Tollip基因第3外顯子區(qū)域設計了2條sgRNA序列,結果如圖1A所示。分別構建至載體 pX459 中,提取質粒送測序。使用BLAST軟件對測序結果與目的基因序列進行對比,成功構建具有靶向Tollip基因不同外顯子的sgRNA重組質粒,重組質粒分別命名為pX459-Tollip-sgRNA-1、pX459-Tollip-sgRNA-2。

A. 靶向豬Tollip基因組序列的sgRNA示意圖;B .全基因組中擴增含有gRNA-1和gRNA-2的目的基因A. Schematic diagram of sgRNA targeting the porcine Tollip genome sequence;B. Whole genome amplification of target genes containing gRNA-1 and gRNA-2圖1 豬Tollip敲除重組質粒的構建與鑒定Fig.1 Construction and identification of porcine Tollip knockout recombinant plasmid

2.2 Tollip-gRNA打靶效率的檢測

將構建的兩個重組質粒pX459-Tollip-sgRNA分別轉染 PK-15 細胞,轉染24 h后加入嘌呤霉素篩選,取適量篩選后的多克隆細胞株,使用細胞微量 DNA 提取試劑盒提取 DNA,用Tollip鑒定引物擴增含有 sgRNA 靶向位點的片段后,使用 1%瓊脂糖凝膠對擴增片段大小進行初步鑒定 (圖1B),擴增產(chǎn)物含有sgRNA靶向位點的目的片段,與預期大小相符。目的片段擴增產(chǎn)物膠回收后,進行Sanger測序。嘌呤霉素篩選之后的多克隆細胞株在相應的gRNA附近有明顯的打靶(圖2),可以進行下一步單克隆細胞株的篩選。

圖2 Tollip-gRNA打靶細胞目的基因的測序結果Fig.2 Sequencing results of target genes in Tollip gRNA targeting cells

2.3 不同單克隆細胞株蛋白水平的鑒定

將嘌呤霉素加壓篩選后的已打靶的多克隆細胞株用有限稀釋法進行亞克隆,一周后,待單個細胞克隆形成,將單克隆細胞擴大培養(yǎng),并收集不同細胞克隆在蛋白水平進行鑒定,利用Western blot檢測Tollip的蛋白水平表達。結果如圖3A所示,#1、#2、#3、#4和#9號單克隆細胞株中Tollip基因完全敲除。

A. Western blot檢測Tollip-gRNA單克隆細胞系的敲除情況;B. Tollip基因功能缺失細胞系Tollip-KOs細胞活力檢測;C.Western blot檢測敲除Tollip細胞系對FMDV復制的影響;D.Tollip敲除細胞系感染FMDV的間接免疫熒光試驗;E. 實時熒光定量檢測Tollip-KO-1和Tollip-KO-2敲除細胞系對病毒復制的影響;F. FMDV在Tollip-KO-1和Tollip-KO-2敲除細胞系中病毒滴度檢測結果A. Western blot detects knockout of Tollip-gRNA monoclonal cell lines;B. The viability assay of Tollip gene loss-of-function cell line Tollip-KOs cell;C. Western blot detects the effect of knockout Tollip cell lines on FMDV replication;D. Indirect immunofluorescence assay for FMDV infection in Tollip knockout cell lines;E. Real-time real-time quantitative detects the effects of Tollip-KO-1 and Tollip-KO-2 knockout cell lines on viral replication;F. The results of FMDV viral titer in Tollip-KO-1 and Tollip-KO-2 knockout cell lines圖3 敲除細胞的篩選及對FMDV復制的影響Fig.3 Screening of knockout cells and effect on FMDV replication

2.4 敲除 Tollip基因的 PK-15 細胞系的測序鑒定

同時取上述已擴大培養(yǎng)的單克隆細胞株,使用細胞微量 DNA 提取試劑盒提取 DNA,使用Tollip鑒定引物擴增含有 sgRNA 靶向位點的片段,擴增產(chǎn)物送測序,使用 MegAlign 軟件對測序結果進行比對分析,結果顯示,Tollip-KO-1在Cas9外顯子3的9528預定切割位置處[距離PAM基序(TGG)第3和4個堿基之間切割]有1個堿基的缺失,Tollip-KO-2在外顯子3的9616預定切割位置處[距離PAM基序(AGG)第1和2個堿基之間切割]有1個堿基的插入?？傊?測序結果顯示,成功構建了敲除Tollip基因的PK-15細胞系。

2.5 細胞活力檢測

WT型PK-15細胞、Tollip-KO-1和Tollip-KO-2細胞鋪96孔板,加CCK-8 溶液后,放細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 1～4 h,用酶標儀測定每孔在450 nm處的OD值分析數(shù)據(jù)。結果如圖3B顯示,Tollip基因敲除PK-15細胞系Tollip-KO-1和Tollip-KO-2與野生型PK-15細胞的細胞活力相同,表明Tollip基因的敲除并不影響宿主細胞的正常生長。

2.6 敲除 Tollip基因對 FMDV 復制的影響

為了研究Tollip基因在豬源細胞中對 FMDV 復制的潛在作用,分別在 PK-15-Tollip-KO 細胞和 PK-15-Tollip-WT 細胞上感染相同劑量的 FMDV,收集樣品,利用Western blot、間接免疫熒光試驗、RT-qPCR 和 TCID50方法綜合評價內源性Tollip對 FMDV 復制的影響。

2.6.1 Western blot 分析 將Tollip基因敲除PK-15細胞系Tollip-KO-1和Tollip-KO-2與野生型PK-15細胞(WT)感染FMDV,對FMDV的相對表達水平進行分析。結果如圖3C所示,敲除Tollip基因之后顯著促進FMDV復制。

2.6.2 細胞病變分析 將Tollip基因敲除PK-15細胞系Tollip-KO-1和Tollip-KO-2與野生型PK-15細胞感染FMDV,8 h后在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化,與野生型細胞相比,敲除細胞形態(tài)發(fā)生變化,細胞變圓,脫落等。

2.6.3 間接免疫熒光試驗 分別用 FMDV 感染 PK-15-Tollip-KO 細胞和 PK-15-Tollip-WT 細胞,感染后第8 小時,用 FMDV 兔多抗為一抗,Alex Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)作為二抗進行間接免疫熒光試驗,分析Tollip對 FMDV 復制的影響,結果顯示, PK-15-Tollip-KO 細胞中出現(xiàn)大量紅色熒光,且明顯多于 PK-15-Tollip-WT 細胞,說明在 PK-15-Tollip-KO 細胞中 FMDV 復制量較野生型細胞高(圖3D)。

2.6.4 實時熒光定量檢測分析 PK-15-Tollip-KO 細胞和 PK-15-Tollip-WT 細胞分別感染 FMDV,分別于感染后第0、4、12 小時收取樣品并提取總 RNA 進行反轉錄,以GAPDH作為內參基因,用 qPCR 方法對 FMDV 的相對 mRNA 水平進行定量。結果顯示,感染 FMDV 后的不同時間點,PK-15-Tollip-KO 細胞中 FMDV 的 mRNA 表達水平均顯著高于對照細胞 PK-15-Tollip-WT(圖3E)。

2.6.5 敲除Tollip基因對病毒滴度的影響 將FMDV分別感染Tollip基因敲除PK-15細胞系Tollip-KO-1、Tollip-KO-2和WT細胞,不同時間點收取病毒液,反復凍融3次并離心后,測定病毒滴度。結果如圖3F顯示,在FMDV接毒后收取的樣品中,Tollip基因敲除PK-15細胞系Tollip-KO-1和Tollip-KO-2中口蹄疫病毒的病毒滴度遠高于野生型細胞,說明Tollip基因功能缺失單克隆細胞系能夠顯著促進FMDV的復制。

綜上所述,敲除Tollip基因顯著促進 FMDV 復制。

3 討 論

本研究采用 CRISPR/Cas9 技術成功構建了Tollip基因敲除的 PK-15 細胞系。首先構建了重組質粒 pX459-Tollip-sgRNA,轉染 PK-15 細胞后,使用嘌呤霉素加壓篩選,剔除了大量 pX459-Tollip-sgRNA 陰性細胞,再經(jīng)過有限稀釋法獲得單克隆細胞株,提高了候選細胞株敲除目的基因的效率。通過測序和蛋白表達水平鑒定,成功獲得了Tollip基因敲除細胞系。對野生型細胞和敲除細胞進行細胞活性試驗,結果表明,敲除細胞系細胞生長狀態(tài)和生長速率與野生型細胞相比無差異,以保證后續(xù)相關試驗的有效性,也為在Tollip基因敲除細胞系中進行病毒感染機制的深入研究奠定了一定的基礎。同時,作者利用 CRISPR/Cas9 基因編輯技術實現(xiàn)了靶基因的高效編輯,可進一步推論并擴展到對其他動物細胞中Tollip基因敲除,構建具有提升FMDV抗原表達的基因敲除細胞系。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)對基因的定向識別和剪切是由sgRNA和Cas9實現(xiàn)的,sgRNA決定了Cas9的靶向性,也決定了Cas9的切割活性[10]。本研究旨在應用CRISPR/Cas9基因編輯技術,通過體內外篩選針對Tollip基因的sgRNA序列,實現(xiàn)Tollip基因的準確、高效地敲除,獲得一種能夠促進FMDV抗原表達的Tollip基因敲除單克隆細胞系,從而為FMDV疫苗的生產(chǎn)提供新的策略。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術,通過靶向Tollip基因的sgRNA引導Cas9蛋白結合到Tollip基因特定序列位置對DNA雙鏈進行切割,造成基因雙鏈斷裂[11],在細胞自身修復機制作用下,產(chǎn)生隨機突變,核苷酸的缺失或插入等突變會造成基因的讀碼框發(fā)生改變而出現(xiàn)終止密碼子[12],最終達到基因編碼蛋白功能喪失的目的,獲得基因編碼蛋白功能喪失細胞系。本試驗中Tollip敲除細胞系,與野生型 PK-15細胞相比,在感染FMDV后,不同時間點均能顯著提高病毒 mRNA 轉錄、蛋白表達及病毒滴度,從而促進不同感染濃度的FMDV復制,表明Tollip對 FMDV的復制具有重要的調控作用。

TLR在先天免疫反應和適應性免疫反應中都發(fā)揮著重要作用[13]?？稍诿庖呒毎⒕奘杉毎托难芗毎榷喾N細胞類型中表達。先前的研究表明,TLR在調節(jié)生物過程中發(fā)揮著至關重要的作用,如先天免疫反應、誘導適應性免疫反應、調節(jié)炎癥、流感病毒、冠狀病毒復制及致癌等[14]。有人提出,巨噬細胞中的Tollip通過與TLR/MyD88/IL-1受體活化激酶(IRAK)復合物結合,抑制細菌脂多糖刺激的IRAK磷酸化,降低NF-κB的轉錄,從而抑制炎癥反應,進一步減少腸黏膜損傷,促進腸黏膜修復和黏膜屏障重建,有效地緩解腸黏膜炎癥。已有文獻報道Tollip基因敲除能夠抑制皰疹病毒中UL21蛋白誘導的環(huán)狀GMP-AMP合成酶(cGAS)降解,進而抑制皰疹病毒的復制。Tollip介導的選擇性自噬抑制ACE2 SUMO化可以有效地對抗嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)感染[15]。舒尼替尼誘導的非適應性自噬通過Tollip介導的體內相關途徑選擇性地降解心肌細胞生存介質細胞通信網(wǎng)絡因子2(CCN2),并通過腺相關病毒血清型9 (AAV9)在體內模擬舒尼替尼誘導的心功能障礙,表明Tollip參與的CCN2的自噬降解是舒尼替尼誘導心肌細胞心毒性和死亡的原因之一[16]。Tollip還通過促進 sST2 的產(chǎn)生和抑制 IRAK2 活化,在鼻病毒(RV)感染期間限制Ⅰ型細胞因子暴露的人氣道中過量產(chǎn)生 IL-2?？赡苁菧p輕哮喘中過度中性粒細胞氣道炎癥的治療靶點,尤其是在右心室感染期間[17],此外,已知Tollip基因變異通過抑制促炎細胞因子,特別是IL-6、TNF-α和IL-10來調節(jié)人類TLR信號通路[18],例如,Tollip表達抑制NF-κB依賴性HIV-1長末端重復(LTR)驅動的轉錄,從而抑制HIV-1感染[19]。在非洲豬瘟病毒研究方面,病毒蛋白MGF300-2R通過募集Tollip促進IKKα和IKKβ的自噬降解,與病毒致病性有關[20]。越來越多的證據(jù)表明,TLR的刺激導致多種信號通路的激活,包括NF-κB、MAPK、Jun-N末端激酶、P38和細胞外信號調節(jié)激酶,以及幾種干擾素調節(jié)因子[21]。本研究發(fā)現(xiàn),抑制宿主細胞中Tollip基因的表達能促進小RNA病毒病毒的復制,尤其是FMDV的復制;此外,本研究提供了一種特異性靶向Tollip基因的sgRNA,所述的sgRNA能夠特異性靶向Tollip基因,結合CRISPR-Cas9技術實現(xiàn)了Tollip基因的敲除,獲得的單克隆細胞系,提高小RNA病毒疫苗的生產(chǎn)量和抗原表達量。然而,Tollip基因的表達如何抑制口蹄疫病毒的復制,還有待進一步研究。人們將利用成功建立的Tollip基因敲除細胞系,深入開展Tollip調控 FMDV 復制的分子機制研究,挖掘Tollip蛋白的功能。

4 結 論

本研究基于CRISPR/Cas9基因編輯工具在PK-15細胞中敲除Tollip基因,成功構建了Tollip基因敲除細胞系,并通過RT-qPCR、蛋白質印跡和間接免疫熒光試驗評估了Tollip基因敲除后對FMDV復制的影響。Tollip基因敲除細胞系的建立能為Tollip調控 FMDV復制的研究奠定基礎,也能夠為進一步開展Tollip調控其他病毒復制的機制研究提供思路?？勺鳛樾NA病毒疫苗的生產(chǎn)細胞系,具有廣闊的應用前景。