盧勁曄,高亞兵,韓心茹,劉鈺臻,趙家玉

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,泰州 225300;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,南京 210095)

奶業(yè)是健康中國、強(qiáng)壯民族的重要產(chǎn)業(yè)。乳腺炎是制約其健康發(fā)展的主要疾病,80%由細(xì)菌感染所致,在我國每年造成200多億元的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。乳房鏈球菌(Streptococcusuberis,S.uberis)是誘發(fā)乳腺炎的主要環(huán)境性病原之一,長期的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)顯示,近年來,S.uberis性乳腺炎的發(fā)病率有升高趨勢(shì),許多地區(qū)超過了總發(fā)病率的1/3[4-5]。S.uberis感染會(huì)導(dǎo)致乳腺損傷、微循環(huán)障礙和免疫代謝紊亂,使產(chǎn)奶量減少、乳品質(zhì)下降,給我國造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。一些S.uberis含有莢膜,能夠形成生物被膜,抵抗巨噬細(xì)胞的吞噬[8],降低此類病原感染造成的危害是行業(yè)當(dāng)前亟需解決的“瓶頸問題”。目前抗生素聯(lián)合用藥是治療乳腺炎的主要手段,但大量使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性和抗生素殘留等問題[9]。此外,S.uberis感染后可黏附、內(nèi)化進(jìn)入乳腺上皮細(xì)胞,躲避抗生素的殺滅/抑制作用,并產(chǎn)生相關(guān)酶和代謝小分子干擾宿主免疫反應(yīng),導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂,逃避免疫系統(tǒng)清除,導(dǎo)致持續(xù)的細(xì)胞內(nèi)感染,誘發(fā)過度炎癥反應(yīng)[10],給S.uberis性乳腺炎防控帶來困難,是奶牛養(yǎng)殖業(yè)長期面臨的難題。因此,尋找有效抵抗S.uberis感染且不易產(chǎn)生耐藥性的內(nèi)源性物質(zhì),或許能夠成為降低乳腺炎發(fā)病率的突破口。

氨基酸代謝作為三大物質(zhì)代謝之一,在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和維持機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11]。同時(shí),氨基酸是維持生命的基本物質(zhì),參與細(xì)胞內(nèi)多種代謝途徑,包括ATP生成,核苷酸合成和氧化還原平衡[12-13]。病原微生物入侵后會(huì)激活免疫細(xì)胞的識(shí)別受體,通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)使細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生顯著變化,促進(jìn)免疫效應(yīng)分子合成,誘導(dǎo)免疫細(xì)胞發(fā)生代謝重編程,在此過程中糖酵解、三羧酸循環(huán)和線粒體氧化磷酸化協(xié)同產(chǎn)生ATP,氨基酸代謝為這些產(chǎn)能途徑提供底物,以滿足增殖、分化和功能物質(zhì)合成的需要[14-15]。這表明病原感染和氨基酸代謝之間關(guān)系密切。目前,關(guān)于S.uberis感染對(duì)乳腺內(nèi)氨基酸代謝的影響還未見報(bào)道,亟需深入研究。

為此,本研究以S.uberis和小鼠乳腺上皮細(xì)胞為研究對(duì)象,通過靶向氨基酸代謝組學(xué)分析技術(shù)、RT-qPCR和Western blot等方法,探究S.uberis感染對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中氨基酸代謝的影響,為挖掘關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行代謝調(diào)控緩解乳腺感染提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)也為S.uberis性乳腺炎早期預(yù)警奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

S.uberis標(biāo)準(zhǔn)株(S.uberis0140J)與小鼠乳腺上皮細(xì)胞系(EpH4-Ev)購自美國ATCC公司。

1.2 主要試劑

Trizol試劑、Evo M-MLV和miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒為湖南艾科瑞生物工程有限公司產(chǎn)品,RIPA蛋白裂解液購自南京碧云天生物技術(shù)有限公司;PVDF膜購自美國Millipore公司;ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司等。

兔源β-Tubulin抗體(貨號(hào)AP0064)購自南京巴傲得生物科技有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(貨號(hào)56970 S)購自美國CST生物公司;兔源精氨酸酶1抗體(ARG1,貨號(hào)ab96183)、兔源誘導(dǎo)型一氧化氮合酶抗體(NOS2,貨號(hào)ab178945)購自英國Abcam生物科技有限公司;TureColor寬范圍(10～250 ku)雙色預(yù)染蛋白Marker(貨號(hào)C520010)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng) 將-80 ℃保存的S.uberis標(biāo)準(zhǔn)菌株劃線接種于新鮮的THB固體培養(yǎng)基,并過夜培養(yǎng),挑取單菌落的接種于新鮮的THB液體培養(yǎng)基中,然后在設(shè)置參數(shù)為37 ℃,200 g·min-1的搖床中培養(yǎng),直至對(duì)數(shù)生長期(OD600 nm=0.45～0.55)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與樣品制備 將EpH4-Ev細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)至正常狀態(tài),并接種于T75細(xì)胞瓶中培養(yǎng)至聚合度為80%左右,用無血清DMEM饑餓處理4 h,然后以MOI=10的感染劑量將S.uberis與細(xì)胞在37 ℃、5% CO2細(xì)胞溫箱共孵育4 h。棄掉培養(yǎng)基,用預(yù)冷PBS洗滌3次,胰酶消化后,1 200g離心5 min,用PBS重懸,取107個(gè)細(xì)胞再次離心,去除上清,將細(xì)胞沉淀快速置于液氮中速凍30 s,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 方法

1.4.1 靶向氨基酸代謝分析

1.4.1.1 代謝物提取:精確吸取樣本于2 mL離心管中,加入300 μL 10%甲酸甲醇溶液(1∶1),加入100 mg玻璃珠,液氮快速冷凍5 min,取出離心管,室溫凍融后在研磨器中以50 Hz頻率振蕩1 min;12 000 r·min-14 ℃離心5 min,取上清50 μL,加入450 μL 10%甲酸甲醇溶液(1∶1),渦旋振蕩30 s,取100 μL,再加入100 μL濃度為10 μg·L-1的Trp-d3內(nèi)標(biāo)樣品,渦旋振蕩30 s,用0.22 μm濾膜過濾上清液于檢測(cè)瓶中。

1.4.1.2 LC-MS/MS分析:采用Shimadzu Nexera X2 LC-30AD高效液相色譜。色譜柱:Waters UPLC BEH Amide column (1.7 μm 2.1 mm×100 mm Column)。流動(dòng)相:A液為5%乙腈水溶液(含20 mmol·L-1乙酸銨pH 9.45),B液為100%乙腈。樣品復(fù)溶于90 μL 50%乙腈水溶液,置于4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中,柱溫40 ℃,流速300 μL·min-1,進(jìn)樣量5 μL。樣本隊(duì)列開始前設(shè)置1個(gè)QC樣本,之后每12個(gè)樣本間隔加入一個(gè)QC樣本,樣本隊(duì)列結(jié)束后設(shè)置一個(gè)QC樣本,用于檢測(cè)和評(píng)價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及重復(fù)性。采用5500QTRAP質(zhì)譜儀(AB SCIEX)在正離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.4.1.3 數(shù)據(jù)處理:用 MultiQuant 軟件提取色譜峰面積和保留時(shí)間。再用20種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行保留時(shí)間校正,鑒定代謝物。代謝物的離子峰面積使用內(nèi)標(biāo)L-Glutamate_D5進(jìn)行歸一化處理。

1.4.2 關(guān)鍵代謝酶表達(dá)驗(yàn)證分析

1.4.2.1 RNA提取:處理后的細(xì)胞快速用PBS洗滌3次,加入1 000 μL預(yù)冷Trizol裂解3 min,轉(zhuǎn)移至RNase Free EP管中;加入200 μL氯仿,輕輕混勻,靜置3 min,12 000 g·min-1、4 ℃離心15 min;取上層水相并加入等體積預(yù)冷異丙醇混勻,-20 ℃放置1 h;12 000 g·min-1、4 ℃離心10 min,棄上清,加入75%的乙醇溶液洗滌2次;管底沉淀干燥至透明色后,加入20 μL DEPC水,混勻后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。

1.4.2.2 RT-qPCR:為了在轉(zhuǎn)錄水平上驗(yàn)證關(guān)鍵代謝酶的基因表達(dá)情況,在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索所需目的基因序列,將序列導(dǎo)入Primer Premier 5.0軟件中,設(shè)計(jì)并篩選特異性引物序列,并在NCBI Primer-BLAST網(wǎng)站對(duì)引物特異性進(jìn)行驗(yàn)證,將引物序列(表1)送擎科生物科技有限公司(南京合成部)合成。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行Real-Time PCR擴(kuò)增反應(yīng),從儀器中讀取樣品的Ct值,以β-actin為內(nèi)參基因,并采用2-ΔΔCt計(jì)算公式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences designed for RT-qPCR

1.4.2.3 Western blot:

①蛋白提取:用RIPA裂解液(含1% PMSF)提取細(xì)胞蛋白,經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度后統(tǒng)一蛋白濃度,加入上樣緩沖液混勻,100 ℃ 10 min,-20 ℃保存;②SDS-PAGE 電泳:配制5%濃縮膠和10%分離膠,每孔上樣20 μg,蛋白Marker 3 μL,電泳條件:濃縮膠80 V,分離膠120 V;③轉(zhuǎn)印:將分離膠與PVDF膜按順序疊放于轉(zhuǎn)膜儀內(nèi),加入預(yù)冷轉(zhuǎn)膜液,100 V轉(zhuǎn)膜90 min;④雜交和顯色:轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h,TBST洗膜。分別加入一抗(β-Tubulin兔源抗體1∶10 000稀釋;NOS2、ARG1兔源抗體1∶1 000稀釋),4 ℃孵育過夜。TBST洗膜,加入山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000稀釋),室溫孵育2 h,最后洗膜。ECL發(fā)光(A液∶B液=1∶1),凝膠成像系統(tǒng)曝光并拍照。⑤數(shù)據(jù)處理:Image J軟件檢測(cè)各蛋白條帶灰度值,以β-Tubulin為內(nèi)參,將目的條帶與其相比得到目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量,然后對(duì)數(shù)值進(jìn)行歸一化處理。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.5.1 GC-TOF-MS數(shù)據(jù)分析 將數(shù)據(jù)中心化和標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行PCA和OPLS-DA分析,總體觀察代謝物差異。再根據(jù)P<0.05來篩選差異代謝物,隨后對(duì)差異代謝物表達(dá)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 多變量數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)采用此方法分析S.uberis感染對(duì)細(xì)胞中20種氨基酸的代謝變化,其R2X值為0.902,說明當(dāng)前PCA模型可靠,能夠準(zhǔn)確地顯示對(duì)照組和感染組之間的氨基酸代謝物差異。如圖1 A所示,對(duì)照組處于PC1的左側(cè),S.uberis組處于PC1的右側(cè),表明這兩組之間的氨基酸代謝物有顯著差異。

A. 代謝物PCA分析;B. 代謝物OPLS-DA分析A. Metabolite PCA analysis; B. Metabolite OPLS-DA analysis圖1 多變量數(shù)據(jù)分析Fig.1 Multivariable analysis

為了濾除與分類信息無關(guān)的噪音,提高模型的解析能力和有效性,本研究進(jìn)一步使用OPLS-DA分析方法進(jìn)行了分析。在OPLS-DA模型中,感染組vs對(duì)照組的模型解釋率R2Y值為0.999,預(yù)測(cè)性Q2值分別為0.979,這說明模型有效性高,可預(yù)測(cè)性好,同時(shí),在圖1B中,組間OPLS-DA得分圖未重疊,組內(nèi)的代謝物離散度小,表明組內(nèi)的代謝物差異較小,組間的氨基酸代謝物差異顯著。

2.2 層次聚類分析

層次聚類分析可全面直觀地顯示樣本間關(guān)系以及代謝物在不同樣本中的表達(dá)差異,為了表示感染組與對(duì)照組差異氨基酸間的關(guān)系,本研究測(cè)定了顯著差異氨基酸的表達(dá)量,并對(duì)各組樣本進(jìn)行層次聚類分析,以熱圖展示(圖2),從而輔助本研究準(zhǔn)確地篩選標(biāo)志代謝物,并對(duì)相關(guān)代謝過程進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,S.uberis感染細(xì)胞后,甘氨酸、蘇氨酸、鳥氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺這5種氨基酸含量上升,谷氨酸、脯氨酸 、精氨酸、絲氨酸、組氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、γ-氨基丁酸、亮氨酸和甲硫氨酸等16種氨基酸含量下降,精氨酸含量下調(diào)最為顯著(P<0.000 1);其中,天冬酰胺和谷氨酰胺兩種生糖氨基酸含量顯著上升(P<0.05),賴氨酸和亮氨酸兩種生酮氨基酸含量顯著下降(P<0.05)。

熱圖中紅色代表上調(diào)的氨基酸,藍(lán)色代表下調(diào)的氨基酸The red color represents upregulated amino acids, while the blue color represents downregulated amino acids圖2 差異氨基酸分析Fig.2 The analysis of the differential amino acids

2.3 差異代謝物重要性分析

VIP(variable important in projection)是OPLS-DA模型變量的權(quán)重值,用來衡量各代謝物的表達(dá)模式對(duì)各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力,VIP值越大代表該變量的重要性越高,常與t

檢驗(yàn)P值(P<0.05)作為結(jié)合分析,篩選具有生物學(xué)意義的差異代謝物。由圖3可知,S.uberis感染細(xì)胞中VIP>1且P<0.05的氨基酸有精氨酸、纈氨酸、組氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、鳥氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸和絲氨酸,其中,精氨酸的重要性最高,這提示精氨酸可能在S.uberis感染中發(fā)揮著重要的作用。

2.4 差異代謝物相關(guān)性分析

在前期結(jié)果的基礎(chǔ)上,本研究以精氨酸為關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行代謝物相關(guān)性分析,結(jié)果如圖4所示,精氨酸與丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、組氨酸和絲氨酸之間有較強(qiáng)的正相關(guān),與鳥氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸和天冬酰胺有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)。

圖4 差異氨基酸相關(guān)性分析Fig.4 The correlation analysis of differential amino acids

2.5 精氨酸代謝通路分析

2.5.1 關(guān)鍵代謝物含量的測(cè)定 差異代謝物分析結(jié)果提示精氨酸是S.uberis感染細(xì)胞中最重要的氨基酸,因此對(duì)精氨酸代謝通路進(jìn)行了進(jìn)一步研究。由圖5可知,ARG1和NOS2是精氨酸分解代謝途徑的關(guān)鍵酶,將精氨酸分別代謝為鳥氨酸、尿素、瓜氨酸和NO,與對(duì)照組相比,S.uberis感染使細(xì)胞中NO含量和鳥氨酸含量顯著上升(P<0.05),表明精氨酸分解代謝增強(qiáng)。

A. 精氨酸代謝通路;B. NO含量的測(cè)定;C.鳥氨酸含量的測(cè)定A. Arginine metabolic pathway; B. Determination of NO content; C. Determination of ornithine content圖5 精氨酸代謝通路關(guān)鍵代謝物含量Fig.5 Content of key metabolites of the arginine metabolic pathway

2.5.2 關(guān)鍵代謝酶的基因表達(dá)驗(yàn)證 由圖6可知,S.uberis感染顯著下調(diào)了精氨酸代謝關(guān)鍵酶ARG1的表達(dá)(P<0.05),顯著上調(diào)了NOS2的表達(dá)(P<0.05),這提示宿主可能通過誘導(dǎo)NOS2的表達(dá)代謝細(xì)胞內(nèi)的精氨酸,以抵抗S.uberis感染。

A. ARG1的mRNA表達(dá)水平;B. NOS2的mRNA表達(dá)水平A. mRNA expression level of ARG1; B. mRNA expression level of NOS2圖6 關(guān)鍵代謝酶的基因表達(dá)Fig.6 Gene expression of key metabolic enzymes

2.5.3 關(guān)鍵代謝酶的蛋白表達(dá)驗(yàn)證 由圖7可知,S.uberis感染顯著下調(diào)了精氨酸代謝關(guān)鍵酶ARG1的表達(dá)(P<0.05),顯著上調(diào)了NOS2的表達(dá)(P<0.05),在蛋白水平上進(jìn)一步驗(yàn)證了“2.5.2”中的結(jié)果,表明S.uberis感染會(huì)耗竭細(xì)胞內(nèi)精氨酸。

圖7 關(guān)鍵代謝酶的蛋白表達(dá)Fig.7 Protein expression of key metabolic enzymes

2.6 S. uberis感染誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)

進(jìn)一步分析炎性因子的表達(dá)情況,結(jié)果如圖8所示,與control組相比,S.uberis感染小鼠乳腺上皮細(xì)胞后顯著上調(diào)Il-1β和TNF-α的表達(dá)水平(P<0.05),而對(duì)IL-8和IL-10無顯著影響,提示精氨酸可能在S.uberis感染中發(fā)揮重要作用。

圖8 S. uberis感染對(duì)炎性因子表達(dá)水平的影響Fig.8 The effect of S. uberis infection on the expression level of inflammatory factors

3 討 論

近年來,由于免疫代謝這一概念的提出,越來越多的研究人員開始關(guān)注病原感染時(shí)代謝物的變化,以從中發(fā)現(xiàn)與免疫功能關(guān)系最為密切的代謝物,從而開辟新的治療方法,這促使代謝組學(xué)技術(shù)快速發(fā)展,誕生了氨基酸分析儀、高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)等氨基酸檢測(cè)技術(shù)。由于氨基酸分析儀對(duì)樣品背景干擾太大,HPLC無法提供適用于同時(shí)檢測(cè)多種氨基酸的衍生試劑,限制其廣泛應(yīng)用。LC-MS/MS具有靈敏度高、選擇性好和高效快捷等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛地應(yīng)用于體內(nèi)化合物的測(cè)定[16]。與傳統(tǒng)方法相比,用氨基衍生標(biāo)記的LC-MS/MS氨基酸定量技術(shù)在精密度、準(zhǔn)確度、使用范圍和結(jié)果分析方面有顯著提高和改善[17]。因此,本研究采用LC-MS/MS靶向氨基酸代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)S.uberis感染小鼠乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)的氨基酸進(jìn)行了全面分析,篩選差異代謝物,為進(jìn)一步了解S.uberis的致病機(jī)制和疾病防控提供數(shù)據(jù)支持。

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)和多肽的基本單位,對(duì)機(jī)體的生長發(fā)育至關(guān)重要,同時(shí)作為中間代謝物參與機(jī)體各種病理、生理過程,如免疫調(diào)控和炎癥反應(yīng)。健康狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)的氨基酸含量處于動(dòng)態(tài)平衡,但在感染、疾病等條件下,氨基酸將發(fā)生重新分配,主要用于免疫功能物質(zhì)(如炎癥因子)的合成,進(jìn)而影響宿主對(duì)病原的炎癥性免疫應(yīng)答。Gardinassi等[18]研究表明,新型冠狀病毒感染會(huì)顯著上調(diào)精氨酸代謝、脯氨酸代謝、天冬氨酸代謝以及賴氨酸代謝等多種氨基酸代謝。本研究采用LC-MS/MS技術(shù)對(duì)S.uberis感染乳腺上皮細(xì)胞中的氨基酸進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn),S.uberis感染后顯著上調(diào)了乳腺上皮細(xì)胞中甘氨酸、蘇氨酸、鳥氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的含量,顯著下調(diào)了谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、絲氨酸、組氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴氨酸和天冬氨酸的含量,造成了氨基酸代謝紊亂[19]。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,S.uberis感染會(huì)使宿主體內(nèi)ROS含量升高,誘發(fā)氧化應(yīng)激,同時(shí)宿主也會(huì)通過合成抗氧化劑如谷胱甘肽等來抵抗氧化應(yīng)激[20],而半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸是合成抗氧化劑谷胱甘肽的底物,因此在病原微生物感染時(shí),宿主會(huì)優(yōu)先合成上述物質(zhì)[21]。本研究中發(fā)現(xiàn)甘氨酸和谷氨酰胺含量升高,這可能是由于機(jī)體為了應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激,合成更多的抗氧化劑所導(dǎo)致的。絲氨酸是一種非必需氨基酸,能夠利用糖酵解的中間產(chǎn)物從頭合成,本研究發(fā)現(xiàn)S.uberis感染乳腺上皮細(xì)胞4 h顯著降低了絲氨酸的含量,這可能是被絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶代謝成為甘氨酸或用于合成嘌呤和炎性因子。

病原微生物感染宿主后會(huì)和宿主競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)物質(zhì),用于自身生長增殖,Urso和Prince[22]研究表明,腦膜炎奈瑟菌入侵宿主后會(huì)誘導(dǎo)宿主將精氨酸代謝為亞精胺來促進(jìn)自身毒力因子的表達(dá),增強(qiáng)在腦部的定殖,加速體內(nèi)精氨酸的耗竭。但宿主在感染過程中啟動(dòng)各種免疫反應(yīng)抵御和清除病原微生物,如Mtb感染早期會(huì)使宿主招募巨噬細(xì)胞進(jìn)行代謝重編程,促進(jìn)M0巨噬細(xì)胞極化為M1巨噬細(xì)胞,將精氨酸代謝為NO,抵抗病原感染,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)精氨酸含量顯著降低[23]。這表明,精氨酸含量的變化能夠作為病原感染宿主的生物標(biāo)志物,對(duì)疾病預(yù)警有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn),S.uberis感染會(huì)顯著降低細(xì)胞內(nèi)精氨酸的含量,上調(diào)鳥氨酸的含量,同時(shí)在轉(zhuǎn)錄水平上,顯著升高關(guān)鍵代謝酶NOS2的表達(dá),降低ARG1的表達(dá),推測(cè)這可能與宿主細(xì)胞產(chǎn)生NO清除病原有關(guān)[23]。

炎癥是機(jī)體對(duì)各種致炎因素(病源微生物、物理因素、化學(xué)因素等)及其所引起的損傷而發(fā)生的一種防御性免疫反應(yīng),而氨基酸的可用性對(duì)于產(chǎn)生適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)至關(guān)重要[24]。炎癥發(fā)生時(shí)機(jī)體會(huì)加快機(jī)體內(nèi)新陳代謝,消耗大量能量及氨基酸用于免疫功能物質(zhì)的合成,促進(jìn)免疫細(xì)胞的激活并釋放大量的細(xì)胞因子和相關(guān)激素,氨基酸缺乏可能導(dǎo)致免疫細(xì)胞遷移、分裂、成熟和效應(yīng)功能完成缺陷[25-26]。如巨噬細(xì)胞會(huì)利用氨基酸分解代謝來維持其免疫活性的激活和維持[27]。氨基酸可用性控制巨噬細(xì)胞反應(yīng)的幾種途徑,包括mTOR信號(hào)傳導(dǎo)和NO產(chǎn)生,改變氨基酸代謝會(huì)影響巨噬細(xì)胞反應(yīng)[27-28]。最后,宿主細(xì)胞和病原體之間的代謝競(jìng)爭(zhēng)可能會(huì)影響病原感染的進(jìn)程。

綜上所述,S.uberis感染會(huì)顯著升高NOS2的表達(dá),耗竭精氨酸,造成細(xì)胞氨基酸代謝紊亂,促進(jìn)生成甘氨酸和谷氨酰胺等氨基酸,用于抗氧化劑的合成,抵抗病原微生物侵襲,提示精氨酸或許可作為防控奶牛乳腺炎的潛在靶點(diǎn)。

4 結(jié) 論

S.uberis感染造成小鼠乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)氨基酸代謝紊亂,加速精氨酸耗竭,誘發(fā)炎癥反應(yīng),提示精氨酸在S.uberis感染中具有重要作用,也為從代謝的角度尋找奶牛乳腺炎新型調(diào)控靶點(diǎn)提供了新思路。