杜改梅,王 月,茅慧華,雷衛(wèi)強(qiáng),儲岳峰,劉茂軍,3,4*

(1.金陵科技學(xué)院動物科學(xué)與食品工程學(xué)院,南京 210038;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/蘭州大學(xué)動物醫(yī)學(xué)與生物安全學(xué)院/動物疫病防控全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730000;3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210014;4.獸用生物制品(泰州)國泰技術(shù)創(chuàng)新中心,泰州 225300)

綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae,Mo)是引起綿羊和山羊支原體肺炎的主要病原體之一,該病呈全球性流行,不同年齡的羊均可感染,羔羊最易感,發(fā)病率高達(dá)90%[1-2]。羊感染后病變主要在肺組織,剖解可見肺尖葉、心葉有實(shí)變區(qū)[3-4],主要臨床表現(xiàn)為咳嗽、流涕、呼吸困難、生長發(fā)育遲緩、消瘦等,這給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重威脅著養(yǎng)羊業(yè)的健康快速發(fā)展。目前,該病主要通過疫苗免疫和藥物進(jìn)行防治。疫苗研究國內(nèi)外雖有較多報(bào)道,但由于Mo分離株之間存在高度基因多態(tài)性,致使菌株間毒力和免疫原性差異較大,使疫苗的交叉保護(hù)力不理想[5]。藥物防治主要以抗生素為主,其雖具有一定療效,但不能從根源上消除感染,疾病容易復(fù)發(fā),且易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性和藥物殘留等[6],給生態(tài)環(huán)境、人類和動物健康造成嚴(yán)重危害。目前在Mo致病機(jī)制、免疫機(jī)制等方面也尚未得到明確的結(jié)論。闡明該病的致病機(jī)理,研制出有效預(yù)防該病的疫苗和治療用新型藥物是該病防控的關(guān)鍵。而穩(wěn)定的感染動物模型是疫苗評估和藥物療效反應(yīng)的基礎(chǔ)保障,也是研究闡明病原體和宿主相互作用機(jī)制的必要平臺。

實(shí)驗(yàn)用Mo陰性羊篩選困難,Mo人工感染羊發(fā)病模型難建立,現(xiàn)雖已有較多羊發(fā)病模型的研究報(bào)道[7-10],但研究結(jié)果差異較大,不同品種羊?qū)d羊肺炎支原體易感性不同[11],致使后續(xù)研究進(jìn)展緩慢,且實(shí)驗(yàn)羊成本高和飼養(yǎng)條件等諸多因素均阻礙了綿羊肺炎支原體致病和免疫機(jī)制的研究以及疫苗和藥物的研發(fā)。小鼠是應(yīng)用最為廣泛的一種實(shí)驗(yàn)動物,其成本低,飼養(yǎng)方便,是建立病理模型較常用的實(shí)驗(yàn)動物,具有較好的穩(wěn)定性,且易于標(biāo)準(zhǔn)化。而目前尚未見綿羊肺炎支原體小鼠發(fā)病模型的相關(guān)研究報(bào)道。因此,本研究通過體外分離培養(yǎng)Mo,感染小鼠,通過分析感染小鼠肺病變特點(diǎn)、肺組織抗原載量、血清抗體水平,篩選出綿羊肺炎支原體感染小鼠方法,為綿羊肺炎支原體感染模型的建立提供新思路和新方法,為今后該病的致病機(jī)理、免疫機(jī)制和防治策略等研究奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

病料樣品來自于某羊場疑似綿羊支原體肺炎的病羊肺組織,酶標(biāo)二抗(Goat anti-mouse IgG-HRP)購自BETHYL。SPF健康BALB/c小鼠購于江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。

1.2 分離培養(yǎng)

將肺組織病樣用支原體培養(yǎng)基清洗3～5次,培養(yǎng)基組成:MEM培養(yǎng)基55 mL、1.7%水解乳蛋白Hank′s緩沖液35 mL、25%酵母液2 mL、健康馬血清10 mL、青霉素200 IU·mL-1、0.4%酚紅0.18 mL。然后將肺組織置于培養(yǎng)液中用無菌剪刀在超凈工作臺剪碎為1 mm3小碎塊,再用移液器反復(fù)吹打,使組織塊盡量破裂,用0.45 μm微孔過濾器過濾,將濾液放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),每天觀察記錄培養(yǎng)基顏色變化情況和清澈度情況。連續(xù)培養(yǎng)5～7 d后觀察有無支原體生長。變黃的菌液保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分離培養(yǎng)物的PCR鑒定

采用PCR方法對本研究分離培養(yǎng)的病原菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,具體方法為:取分離培養(yǎng)的變黃菌液5 mL,10 000 r·min-1離心20 min,用1 mL滅菌雙蒸水將沉淀吹吸混勻,使用天根DNA提取試劑盒提取DNA進(jìn)行Mo PCR檢測,同時以雙蒸水為DNA模板做陰性對照。參照GenBank中公布的HSP70基因序列,使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,上游引物序列:5′-ATGAAAGGAAAACAT-AATATGGC-3′,下游引物序列:5′-TTAGTTTTGTTTGATTTCAGCAT-3′,由南京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μL:2×Rapid Taq Master Mix 10 μL,上下游引物各1 μL,DNA模板4 μL,ddH2O 4 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共32個循環(huán);72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.6%瓊脂凝膠電泳檢測,觀察凝膠電泳成像結(jié)果,拍照。將PCR擴(kuò)增條帶回收進(jìn)行序列測定。

1.4 感染菌液制備及含量測定

將鑒定為Mo的分離培養(yǎng)病原菌進(jìn)行傳代培養(yǎng),連續(xù)傳5代后,將新鮮培養(yǎng)物用于小鼠攻毒試驗(yàn);同時,采用顏色變化單位(CCU)測定培養(yǎng)物濃度。方法為將傳代菌液以1∶10接種于支原體培養(yǎng)基中,依次10倍倍比稀釋10個梯度濃度,每次設(shè)4個平行重復(fù),同時設(shè)置陰性對照,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),每天觀察記錄,連續(xù)培養(yǎng)10 d后,最終以管中顏色不再變化為止,且對照無變化,不再發(fā)生顏色變化的稀釋倍數(shù)為菌液CCU。

1.5 動物試驗(yàn)

隨機(jī)將60只8周齡的SPF健康BALB/c雄性小鼠(22 g±2 g)分為對照組、Mo感染組1、感染組2、感染組3和感染組4(n=12),所有小鼠自由飲水和采食,適應(yīng)飼養(yǎng)一周后進(jìn)行試驗(yàn)。小鼠感染Mo的詳細(xì)試驗(yàn)方案見表1。

表1 小鼠感染綿羊肺炎支原體(Mo)的試驗(yàn)方案(n=12)Table 1 Experiment scheme of mice Mycoplasma ovipneumoniae (Mo) infection (n=12)

攻毒后每天觀察小鼠的臨床表現(xiàn),分別在攻毒后第0、7和14 天禁食稱量小鼠體重。試驗(yàn)第14天眼球采血并分離血清,乙醚麻醉后處死,剖檢觀察肺病理變化并進(jìn)行病理評分[12],將肺病變評定為0～5分(無病變計(jì)為0分,出現(xiàn)病變記為1分,病變面積每超過20%累加1分)。HE染色進(jìn)行肺組織病理學(xué)檢查。qPCR檢測小鼠肺組織中Mo載量(DNA拷貝數(shù)),間接ELISA檢測血清中Mo IgG抗體水平。稱量小鼠脾和肝質(zhì)量,計(jì)算臟器系數(shù)。

1.6 肺組織病理組織學(xué)檢查(HE染色)

將小鼠肺組織進(jìn)行組織固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片和HE染色后,光鏡下觀察組織病理學(xué)改變,并對其病理損傷程度進(jìn)行評分。形態(tài)改變根據(jù)輕重標(biāo)記為“1分”“2分”“3分”“4分”,分別表示輕微、輕度、中度、重度,無病變標(biāo)記為“0分”。

1.7 Mo DNA拷貝數(shù)檢測

Mo感染后第14天,采集小鼠肺組織并稱重,加裂解液研磨,采用動物組織DNA提取試劑盒(購自天恩澤生物技術(shù)有限公司)提取DNA。測定Mo全菌DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度,計(jì)算拷貝數(shù),采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法通過qPCR檢測肺組織中Mo DNA拷貝數(shù)[13]。用滅菌雙蒸水將Mo全菌DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋,101～108copies·μL-1。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋物和待測樣品DNA各取1 μL作為qPCR反應(yīng)模板,同時以水做陰性對照。qPCR使用的引物Mo F:5′-ATGTTGACCACGGAAAAACC-3′,Mo R:5′-GG-CATAGTGACGCTTGTCTG-3′。qPCR反應(yīng)體系為20 μL:2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 7.0 μL。qPCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,共38個循環(huán);60 ℃收集熒光信號,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到每個待測樣品的Mo DNA拷貝數(shù)。

1.8 血清Mo抗體檢測方法

小鼠眼球采血,3 000 r·min-1離心15 min,分離血清。采用間接ELISA方法檢測血清中Mo lgG抗體水平,參考文獻(xiàn)[14]方法改進(jìn)建立,將待檢血清按1∶50稀釋,HRP-山羊抗小鼠IgG按1∶4 000稀釋,一抗和二抗作用時間均為37 ℃ 60 min,底物顯色10 min,酶標(biāo)儀檢測OD450 nm值。PBS空白孔中以PBS緩沖液替代樣品,陰性對照孔中以陰性小鼠血清替代樣品。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 分離培養(yǎng)和PCR鑒定

從肺組織中分離培養(yǎng)的菌株在培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后,1∶10和1∶20稀釋接種培養(yǎng)的培養(yǎng)基顏色均由紅色變?yōu)辄S色,且清亮不渾濁,陰性對照瓶培養(yǎng)基顏色仍為紅色,沒有發(fā)生變化。采用PCR方法從分離培養(yǎng)的菌液中擴(kuò)增出一條與預(yù)期目的基因片段大小相符的DNA條帶,大小約為1 815 bp,對照組沒有條帶(圖1)。PCR擴(kuò)增條帶回收進(jìn)行了測序分析,由測序結(jié)果可知,擴(kuò)增條帶的基因序列與Mo代表株NCTC10151(GenBank: LR215028.1)序列相似性為98.3%,表明分離菌株為綿羊肺炎支原體,命名為NJ01株。

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1和2. 分離培養(yǎng)物;3. 空白對照M. DNA marker; 1 and 2. Isolated strain; 3. Blank control圖1 綿羊肺炎支原體PCR鑒定Fig.1 PCR identification of Mycoplasma ovipneumoniae

2.2 小鼠臨床表現(xiàn)

感染Mo后小鼠臨床表現(xiàn)異樣,Mo感染組1在感染后第6天出現(xiàn)被毛粗亂,但沒有呼吸異?，F(xiàn)象;感染組2和組4的小鼠在感染后第4天出現(xiàn)被毛粗亂和嚴(yán)重扎堆現(xiàn)象(圖2),第13天因呼吸困難而各死亡1只,剖檢發(fā)現(xiàn)肺嚴(yán)重充血和出血。感染組3小鼠第5天出現(xiàn)被毛粗亂,第8天1只小鼠呼吸加快。

2.3 Mo對小鼠體重的影響

從圖3得知,對照組小鼠體重呈逐漸上升趨勢,其它組小鼠體重在接種后第7天出現(xiàn)下降趨勢,Mo感染組3和組4小鼠體重分別比對照組顯著降低5.4%(P<0.05)和6.1%(P<0.05);第14天時各組小鼠體重呈逐漸上升趨勢,但Mo感染組小鼠體重均顯著低于對照組,感染組2和組4分別比對照組顯著降低17.2%(P<0.05)和21.6%(P<0.05),且感染組2和組4顯著低于感染組1和組3,這表明給小鼠攻毒Mo會影響其生長性能,使生長緩慢,2次滴鼻和喉頭噴霧感染影響顯著。

不同日齡點(diǎn)間差異用字母表示,字母不同表示差異顯著(P<0.05)Means not sharing common letter differ significantly (P<0.05)圖3 Mo感染對小鼠體重的影響(n=12)Fig.3 The effect of Mo infection on body weight of mice(n=12)

2.4 小鼠肺剖檢病變觀察及病理評分

對照組小鼠未見異常表現(xiàn)和肺病變。Mo感染組小鼠肺部出現(xiàn)不同程度的充血、出血和實(shí)變(箭頭),其中Mo感染組2和組4小鼠肺部實(shí)變和出血嚴(yán)重,感染組1和組3有輕微出血和實(shí)變(圖4)。Mo感染組1、組2、組3和組4的小鼠肺病變平均評分分別為2.0、3.5、2.5和3.3,其中Mo感染組2和組4均顯著高于感染組1(P<0.05)和組3(P<0.05)(圖5),這表明連續(xù)2次滴鼻或喉頭噴霧攻毒均可以使小鼠感染并出現(xiàn)肺部嚴(yán)重病變。

A. 對照小鼠肺;B～E. Mo感染組1～4小鼠肺A. Lung of control group mice, B-E. Lung of mice in Mo infected group 1-4圖4 Mo感染后第14天小鼠肺病理變化Fig.4 Pathological anatomy of lung in mice on the 14th day post infection with Mo

2.5 小鼠肺組織病理組織學(xué)檢查

如圖6所示,對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常、完整,肺泡未見萎縮、塌陷,肺泡間隔未見明顯充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤,各級支氣管未見明顯病理變化,標(biāo)記為0分;Mo感染組1小鼠肺支氣管/血管周圍可見輕微炎細(xì)胞浸潤,標(biāo)記為1分,表示輕微;Mo感染組2小鼠肺可見輕微間質(zhì)性肺炎,肺泡間隔增寬,其內(nèi)可見少量單核細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤,支氣管管腔有輕度滲出及少量脫落支氣管上皮細(xì)胞,標(biāo)記為3分,表示中度;Mo感染組3小鼠肺可見輕度間質(zhì)性肺炎,肺泡內(nèi)可見以單核細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤,標(biāo)記為2分,表示輕度;Mo感染組4小鼠肺可見中度間質(zhì)性肺炎,肺泡間隔增寬,其內(nèi)可見以單核細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤,支氣管管腔內(nèi)可見輕微滲出及少量脫落的支氣管上皮細(xì)胞,標(biāo)記為4分,表示重度。

A. 對照小鼠肺組織;B～E. 依次為Mo感染組1-4小鼠肺組織A. Lung tissues of control group mice; B-E. Lung tissues of mice in Mo infected group 1-4圖6 Mo感染第14天小鼠肺組織病理學(xué)檢查(HE染色,200×)Fig.6 Histopathological examination of lung in mice on the 14th day post infection with Mo (HE staining,200×)

2.6 qPCR檢測小鼠肺組織中Mo DNA拷貝數(shù)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到Mo感染組小鼠肺組織中Mo載量。由圖7可知,對照組沒有檢測到Mo,Mo感染組1小鼠肺臟組織中DNA拷貝數(shù)為102.56拷貝·g-1;感染組3為103.21拷貝·g-1,且顯著高于組1(P<0.05);Mo感染組2和組4的小鼠肺組織中Mo DNA拷貝數(shù)分別為103.84拷貝·g-1和103.77拷貝·g-1,均顯著高于Mo感染組1(P<0.05)和組3(P<0.05)。這表明連續(xù)2次滴鼻或噴霧攻毒Mo可以使小鼠肺臟組織中Mo載量明顯升高。

圖7 Mo感染組小鼠肺組織中Mo拷貝數(shù)DNA(n=12)Fig.7 Mo DNA copy number of mice lung tissues in Mo infected groups(n=12)

2.7 Mo對小鼠血清中Mo IgG抗體水平的影響

圖8結(jié)果顯示,Mo IgG ELISA檢測小鼠血清的OD450 nm平均值,對照組為0.11,Mo感染組1為0.63,顯著高于對照組(P<0.05),但顯著低于其它三個感染組(P<0.05);Mo感染組2為1.05,顯著高于對照組(P<0.05)、感染組1(P<0.05)和組3(P<0.05);Mo感染組3為0.81,感染組4為0.99,并顯著高于對照組(P<0.05)和感染組1(P<0.05),提示4個感染組小鼠均不同程度感染了Mo。

圖8 小鼠血清中Mo抗體水平(n=12)Fig.8 Mo antibody secretion levels in mouse serum in infected and control groups(n=12)

2.8 Mo對小鼠臟器系數(shù)的影響

Mo感染組小鼠的肝和脾均出現(xiàn)不同程度的腫大,對照組小鼠臟器未觀察到病變。由圖9可知,感染組1小鼠肝臟系數(shù)比對照組和感染組4分別顯著升高17.27%(P<0.05)和15.34%(P<0.05);感染組1和組3的小鼠脾分別比對照組顯著增加70.70%(P<0.05)和69.70%(P<0.05),比感染組2分別顯著增加65.05%(P<0.05)和64.08%(P<0.05)。這表明2次滴鼻或喉頭噴霧感染后小鼠肝和脾嚴(yán)重腫大。

圖9 Mo對小鼠臟器系數(shù)的影響(n=12)Fig.9 Effect of Mo on relative weights of organs in infected and control groups(n=12)

3 討 論

綿羊肺炎支原體感染導(dǎo)致羊生長性能和免疫力低下,易繼發(fā)細(xì)菌或病毒出現(xiàn)混合感染,導(dǎo)致死亡,給養(yǎng)羊業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[15]。動物感染模型是研究疫病發(fā)病機(jī)制、研發(fā)有效治療藥物和疫苗的關(guān)鍵和保障條件。人工感染動物模型的建立受菌株、動物品種、感染途徑和劑量等多種因素的影響[16-17]。多數(shù)動物支原體菌株致病力較弱,即使是臨床分離株也不易導(dǎo)致本動物發(fā)病。而羊的品種較多,不同品種對綿羊肺炎支原體的易感性不同[18-19]。已有研究報(bào)道,將盤羊和巴什拜的雜交羊經(jīng)鼻腔滴注和氣管注射Mo,結(jié)果雜交羊比巴氏拜羊?qū)o較易感[20];給不同品種羊人工感染Mo,結(jié)果白山羊病變明顯,死亡率高,且羔羊易感染性更高[8]。同時,感染方式在感染模型的建立中至關(guān)重要,主要有肌內(nèi)注射、腹腔注射、皮下注射、滴鼻、滴眼等方式[21-22]。為了提高感染模型的穩(wěn)定性,同時降低試驗(yàn)費(fèi)用,探索研究小鼠的發(fā)病模型不僅可以為實(shí)驗(yàn)操作提供便利,還為該病的防治研究工作提供重要保障。

小鼠是研究免疫和疫苗的有價值的常用實(shí)驗(yàn)動物模型,其來源廣泛、易于飼養(yǎng)、價格低、操作簡便易行,廣泛用于細(xì)菌學(xué)研究,且野生鼠類極易感染鼠類呼吸道支原體病,大鼠和小鼠感染不同支原體后均出現(xiàn)明顯的炎性癥狀和典型的病理變化[23-25]。有報(bào)道,煙熏過的小鼠鼻滴攻毒肺炎支原體感染率可高達(dá)93%[26]。因此,推測小鼠是綿羊肺炎支原體感染動物模型的理想選擇,但到目前為止尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究選擇小鼠為感染對象,通過滴鼻或喉頭噴霧途徑,感染不同劑量的Mo,結(jié)果發(fā)現(xiàn)連續(xù)2次滴鼻或喉頭噴霧攻毒,攻毒后第13天,小鼠出現(xiàn)氣喘,呼吸困難而死亡。本研究小鼠僅通過感染綿羊肺炎支原體而出現(xiàn)發(fā)病表現(xiàn),沒有采用煙熏等其它途徑,這樣更能排除發(fā)病的非綿羊肺炎支原體感染原因。

羔羊感染綿羊肺炎支原體后,體溫升高,出現(xiàn)咳嗽、流鼻涕等輕微癥狀,血清中Mo抗體上升為陽性,剖檢時見肺的病變顯著,顏色由紅色至灰色不等,肺出現(xiàn)不同程度的壞死[27]。本研究小鼠感染綿羊肺炎支原體后第14天剖檢發(fā)現(xiàn)肺部嚴(yán)重出血和實(shí)變,與文獻(xiàn)報(bào)道的支原體感染病變相近。

目前用于檢測綿羊肺炎支原體的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)較多,如PCR技術(shù)、間接ELISA、細(xì)菌分離培養(yǎng)等[28-29]。支原體感染小鼠模型病原體多以檢測組織中病原體載量為依據(jù),煙熏并感染肺炎支原體后小鼠組織中病原體拷貝數(shù)顯著高于單獨(dú)感染組77%[26]。本文采用qPCR檢測到小鼠感染后第14天,4個感染組肺組織中均有Mo病原,且Mo載量高達(dá)103.84拷貝·g-1,而對照組沒有檢測到該病原;感染組血清Mo IgG水平顯著高于對照組,肝和脾嚴(yán)重腫大。本研究表明,小鼠Mo感染模型實(shí)驗(yàn)操作方法簡便,不僅可靠穩(wěn)定,安全性高,而且與實(shí)驗(yàn)羊相比,在人力和經(jīng)濟(jì)上具有更低成本效益,符合動物試驗(yàn)中減少、替代和優(yōu)化的“3R”原則,本研究為該病病原生物學(xué)特性研究、疫苗和藥物研發(fā)等提供了重要基礎(chǔ)保障。

4 結(jié) 論

滴鼻或喉頭噴霧攻毒Mo均可以引起小鼠發(fā)病,以間隔48 h滴鼻或喉頭噴霧兩次感染發(fā)病嚴(yán)重,肺剖檢顯示嚴(yán)重出血和實(shí)變,肺組織病理學(xué)檢查呈重度,可見中度間質(zhì)性肺炎,肺泡內(nèi)可見以單核細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤,支氣管管腔內(nèi)可見輕微滲出及少量脫落的支氣管上皮細(xì)胞,臨床表現(xiàn)、病理變化和病變評分相一致;肺Mo載量達(dá)103.84拷貝·g-1,與陽性血清抗體檢測結(jié)果也一致。這些結(jié)果表明應(yīng)用報(bào)道的方法成功建立了Mo小鼠感染動物模型。