張婷婷 楊陳 胡巧洪 王世兵 范小明

胰腺癌患者通常發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，手術(shù)是目前最有效的治療方法，然而大多數(shù)患者確診時(shí)已不具備手術(shù)條件[1]。對于無法切除且化療不敏感的患者，溶瘤病毒的免疫激活和腫瘤內(nèi)選擇性復(fù)制等特點(diǎn)為臨床提供了新的診療思路。重組人5 型腺病毒藥物在2005 年時(shí)已被我國批準(zhǔn)用于鼻咽癌治療[2]。溶瘤病毒通過增強(qiáng)抗原釋放、識(shí)別和免疫激活來增強(qiáng)腫瘤組織周圍促炎環(huán)境形成，以抵消腫瘤細(xì)胞的免疫逃避[3-4]。然而，胰腺腫瘤周圍結(jié)締組織增生和免疫抑制性微環(huán)境（tumor micro-environment，TME）限制了病毒與腫瘤細(xì)胞接觸以及免疫細(xì)胞在腫瘤周圍浸潤，使溶瘤病毒抑制腫瘤的效果大打折扣[5]。在低頻超聲條件下，誘導(dǎo)微泡破裂引起的空化效應(yīng)能改變細(xì)胞膜通透性，從而提高藥物或基因傳送，該技術(shù)被稱為超聲靶向微泡破壞（ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD）[6]。超聲和微泡因具有安全、無毒、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，使UTMD 產(chǎn)生的空化作用在藥物運(yùn)輸、血管破壞等領(lǐng)域被廣泛關(guān)注[7]。本研究通過將UTMD 與溶瘤腺病毒（oncolytic adenovirus, oAd）聯(lián)合使用，探索UTMD 是否能促進(jìn)oAd 對胰腺腫瘤的抑制作用，及其相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 C57BL/6 SPF 級雌性小鼠55 只（6～8 周，體重18～20 g）購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，均飼養(yǎng)在浙江省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，溫度20～26 ℃，空氣濕度40%～70%，12 h 晝夜光照交替。鼠源胰腺癌細(xì)胞（Panc-02 細(xì)胞）、人胚胎腎細(xì)胞293（HEK293 細(xì)胞）和oAd 均由浙江省人民醫(yī)院臨床科研所提供。DMEM 培養(yǎng)基（批號：C11995500BT）、FBS（批號：C0235）均購自美國Gibco公司，PBS（批號：PB180327）購自武漢普諾賽生命科技有限公司，無水乙醇（批號：10009228）、氯化銫（批號：20014213）、檸檬酸（批號：10007108）、二甲苯（批號：10023418）、中性樹膠（批號：10004160）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，聚乙二醇8000（批號：60304ES76）購自上海翌圣生物科技有限公司。青/鏈霉素雙抗溶液（批號：C0222）、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號：C1062S）、過氧化物酶顯色試劑（propidium iodide，DAPI；批號：C1002）、HE 染色試劑盒（批號：C0105S）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（批號：A0216）、透析袋（批號：FDM303-5m）、多聚甲醛（批號：P0099）均購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司，oAd-5 E1A 單克隆抗體（sc-58658）購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司，CD3 抗體（ab16669）抗體購自美國Abcam 公司，Tunel染色試劑盒（批號：11684817910）購自瑞士Roche 公司，抗熒光淬滅封片劑（批號：0100-01）購自美國SouthernBiotech 公司，膠原酶Ⅱ（批號：C8150）購自北京索萊寶科技有限公司。小鼠血清（批號：SBJ-SEM004）購自南京森貝伽生物科技有限公司。超聲治療儀（型號：VINNO M86）購自中國飛依諾科技股份有限公司。微泡為醫(yī)用Sono Vue 對比劑，購自意大利Brocco 公司。超聲醫(yī)用耦合墊購自深圳市全立好實(shí)業(yè)有限公司，倒置顯微鏡（型號：DM750P）購自德國Leica 公司，高速低溫離心機(jī)（型號：Optima XPN-10）購自美國Beckman 公司，流式細(xì)胞儀（型號：NovoCyteAdanteon V6B5R3）購自美國Agilent Technologies 公司。本研究經(jīng)浙江省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查通過（批準(zhǔn)文號：20231016192616359566）。

1.2 微泡oAd 混合液制備 oAd 病毒擴(kuò)增：將HEK293細(xì)胞放在含有10%FBS、1%青/鏈霉素雙抗（100 U/mL）的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至40 皿。待HEK293 細(xì)胞長滿至80%～90%時(shí)將培養(yǎng)基換成含有5%FBS、1%青/鏈霉素雙抗（100 U/mL）的DMEM 培養(yǎng)基，加入50 μL濃度為106PFU/mL病毒感染HEK293 細(xì)胞。觀察培養(yǎng)皿，當(dāng)全部布滿病毒空斑時(shí)收集所有培養(yǎng)液和細(xì)胞，將培養(yǎng)液和細(xì)胞反復(fù)凍融3 次以上，放置在-80 ℃冰箱保存。

氯化銫梯度超速離心法病毒提純：將凍融后的培養(yǎng)液和細(xì)胞在4 ℃高速離心機(jī)12 000 r/min離心10 min，收集上清液。將上清液和聚乙二醇8 000 溶液以2∶1 的比例混勻，置4 ℃冰箱內(nèi)過夜。次日將溶液放在4 ℃高速離心機(jī)12 000 r/min 離心20 min，棄上清液，收集沉淀。在沉淀中加2 mL 密度為1.1 g/mL 的氯化銫溶液并重懸沉淀，移至4 ℃高速離心機(jī)12 000 r/min 離心10 min，收集上清液。先在離心管加入2 mL 密度為1.4 g/mL 的氯化銫溶液，再用滴管加入3 mL 密度為1.3 g/mL 的氯化銫溶液，最上層加入5 mL 含病毒的上清液，置4 ℃高速離心機(jī)20 000 r/min 離心2 h。離心結(jié)束后用移液槍收集密度在1.3～1.4 g/mL 氯化銫溶液之間的病毒條帶，轉(zhuǎn)移至透析袋中封存。將透析袋放在透析緩沖液中，置4 ℃冰箱內(nèi)過夜，8 h 換1 次透析緩沖液。收集透析袋內(nèi)的病毒溶液，置-80 ℃冰箱保存。通過TCID50 法測定病毒的滴度。

將微泡按產(chǎn)品說明書注入0.9%氯化鈉溶液5 mL用力振蕩30 s 形成微泡懸液，用剛配制的微泡懸液將1010PFU/mL oAd 稀釋至108PFU/mL，冰上孵育30 min，制成微泡oAd 混合液[8]。

1.3 小鼠體內(nèi)腫瘤模型建立和分組 在C57BL/6 小鼠右前肢皮下注射Panc-02 細(xì)胞2×106個(gè)/只，選擇腫瘤體積在100～150 mm3的小鼠55只。將小鼠隨機(jī)分為NC組（注射PBS 溶液100 μL）、UTMD 組（注射微泡溶液100 μL，并行超聲微泡破壞處理5 min）、oAd 組（注射108PFU/mL oAd 溶液100 μL）、oAd+微泡組（注射108PFU/mL 微泡oAd混合液100 μL）、oAd+UTMD組（注射108PFU/mL微泡oAd混合液100 μL，并行超聲微泡破壞處理5 min），每組11 只。2 d 給予1 次瘤內(nèi)注射治療及超聲微泡破壞處理，共處理5 次。2 d 記錄1 次小鼠腫瘤體積。當(dāng)有小鼠腫瘤體積超過2 000 mm3時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，所有小鼠均在實(shí)驗(yàn)第14 天采用頸椎脫臼法處死，所有數(shù)據(jù)記錄終止在第12 天。第3 次給藥結(jié)束后24 h 每組隨機(jī)取6 只小鼠處死，剝離小鼠皮下腫瘤組織，隨后PBS 沖洗干凈置于冰上，其中3 只用于流式分析，3 只用于切片染色分析。腫瘤體積計(jì)算公式：腫瘤體積=長度（mm）×寬度（mm）×寬度（mm）×0.5。

1.4 UTMD 處理及超聲儀器參數(shù)設(shè)置 UTMD 組和oAd+UTMD 組小鼠在瘤內(nèi)注射微泡溶液或微泡oAd混合液后，立即給予持續(xù)異氟烷吸入麻醉（氣體流量為300 mL/min，濃度為1.5%），隨后在小鼠皮下腫瘤處涂滿滅菌耦合劑，放置超聲醫(yī)用耦合墊（厚約5 mm），探頭緊貼耦合墊垂直于皮下瘤照射。超聲選用X4-12L探頭下CBI 造影模式，設(shè)置發(fā)射頻率4 MHz，脈沖重復(fù)頻率為1 000 Hz，脈沖長度18.0 cycle，聲功率40%，脈沖時(shí)間1 s，間隔時(shí)間1 s，持續(xù)時(shí)間300 s，占空比0.2%[9]。

1.5 腫瘤組織壞死區(qū)域的觀察 采用HE 染色。將每組3 只小鼠的腫瘤組織放至多聚甲醛中固定、石蠟包埋，切片厚約5 μm，二甲苯溶液浸泡，然后用無水乙醇沖洗脫蠟，再進(jìn)行HE 染色，中性樹膠封片。倒置顯微鏡觀察切片并拍照，采用Image J 軟件圈取切片中粉色壞死區(qū)域計(jì)算壞死面積，比較各組小鼠壞死面積（以與NC 組比值表示）的差異。

1.6 腫瘤組織E1A 蛋白/CD3+T 細(xì)胞的檢測 制作切片步驟同HE 染色步驟，切片脫蠟后，用1×檸檬酸（pH 6.0）修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)。將切片放于3%H2O2溶液中，室溫孵育20 min 進(jìn)行內(nèi)源性酶阻斷。然后在切片組織上滴加小鼠血清，室溫孵育30 min 進(jìn)行血清封閉。加入一抗（E1A抗體、CD3抗體）室溫孵育30 min，PBS 洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗孵育30 min。將DAPI 染液滴加到組織上，玻片放在倒置顯微鏡下觀察，待出現(xiàn)E1A 抗體/CD3 抗體棕色染色后清水沖洗干凈，風(fēng)干并用中性樹膠封片，倒置顯微鏡對切片拍照。E1A 抗體表達(dá)為細(xì)胞內(nèi)蛋白染色，觀察各組切片上E1A 蛋白棕色染色分布及染色深淺情況。CD3 抗體表達(dá)為細(xì)胞膜染色，采用Image J 軟件計(jì)數(shù)切片中棕色CD3+T 細(xì)胞數(shù)。

1.7 觀察腫瘤組織凋亡染色情況 采用Tunel 染色。血清封閉之前的步驟同E1A 蛋白染色，按產(chǎn)品說明書配置Tunel 反應(yīng)液，血清封閉后在切片組織上滴加Tunel 反應(yīng)液，4 ℃孵育過夜。PBS 洗滌，甩干后在切片組織內(nèi)滴加DAPI 染液，避光室溫孵育10 min。PBS 洗滌，甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。使用熒光顯微鏡對切片拍照（委托武漢市皮諾飛生物有限公司拍攝），觀察各組小鼠切片中熒光情況。

1.8 腫瘤細(xì)胞總凋亡率的檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。每組3 只小鼠的腫瘤組織用剪刀剪碎，加入300 μL Ⅱ型膠原酶（200 U/mL），37 ℃持續(xù)振蕩培養(yǎng)箱中孵育6 h 后，PBS 洗滌，用濾網(wǎng)過濾去大塊細(xì)胞團(tuán)，留下細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液加入Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑，室溫避光孵育30 min，PBS 洗去多余染料，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞發(fā)光情況，NovoExpress 軟件分析流式圖，流式圖右下象限表示早期凋亡，右上象限表示晚期凋亡，兩象限值相加即為總凋亡率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 第12 天各組小鼠腫瘤組織體積的比較 在第12天時(shí)oAd 組、oAd+微泡組和oAd+UTMD 組腫瘤體積比NC 組均明顯降低（均P＜0.05），其中oAd+UTMD 組腫瘤增長減緩效果最強(qiáng)。oAd+UTMD 組的腫瘤組織體積小于oAd 組（P＜0.05），oAd 組和oAd+微泡組腫瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），UTMD 與NC 組腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 第12 天各組小鼠腫瘤組織體積比較（mm3）

2.2 各組小鼠腫瘤組織E1A 蛋白表達(dá)情況 NC 組和UTMD 組切片中未見E1A 蛋白表達(dá)，oAd 組、oAd+微泡組和oAd+UTMD 組均見到E1A 蛋白表達(dá)，oAd+UTMD組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)E1A 蛋白染色最深，oAd 組染色最淺，見圖1（插頁）。

圖1 各組小鼠腫瘤組織E1A 蛋白表達(dá)情況

2.3 各組小鼠腫瘤組織切片壞死面積的比較 含oAd的3 組小鼠腫瘤壞死面積均大于UTMD 組（均P＜0.05），其中oAd+UTMD 組壞死最大。oAd+UTMD 組壞死面積又較oAd 組明顯增加（P＜0.05），oAd 組和而oAd+微泡組之間的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2（插頁）、表2。

圖2 各組小鼠腫瘤組織切片病理檢查所見

表2 各組小鼠腫瘤組織切片壞死面積的比較

2.4 各組小鼠腫瘤組織CD3+T 細(xì)胞數(shù)比較 相比于NC 組和UTMD 組，含oAd 的3 組小鼠腫瘤組織內(nèi)CD3+T細(xì)胞數(shù)均增加（均P＜0.05）。oAd+UTMD 組腫瘤組織中CD3+T 細(xì)胞數(shù)較oAd 組和oAd+微泡組均增多（均P＜0.05），UTMD 組與NC 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3（插頁）、表3。

圖3 各組小鼠腫瘤組織CD3+T 細(xì)胞分布

表3 各組小鼠腫瘤組織CD3+T 細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)）

2.5 各組小鼠腫瘤組織凋亡情況比較 oAd 組、oAd+微泡組和oAd+UTMD 組的總凋亡率均高于NC 組（均P＜0.05），oAd+UTMD 組比oAd 明顯增多（P＜0.05）。oAd 組和oAd+微泡組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），UTMD 組和NC 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4（插頁）、表4。同樣的趨勢，在腫瘤組織Tunel 染色中也觀察到，oAd+UTMD 組綠色熒光分布最多，見圖4（插頁）。

圖4 各組小鼠腫瘤組織凋亡分析（A：凋亡的腫瘤組織染色結(jié)果，Tunel 染色，×20；B：腫瘤細(xì)胞凋亡流式分析圖）

表4 各組小鼠腫瘤總凋亡率比較（%）

3 討論

腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，胞內(nèi)抑制病毒的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)異常，使溶瘤病毒可以選擇性的在腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染[10]。Zhang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)單純皰疹病毒通過下調(diào)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，增加腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞百分比來減緩胰腺腫瘤細(xì)胞增長。Koujima 等[12]發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲性與磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1 和2 的表達(dá)有關(guān)，端粒酶特異性oAd 可以破壞細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號傳導(dǎo)，抑制胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。本研究建立小鼠胰腺癌腫瘤模型中，給予包含oAd 的3 組小鼠腫瘤體積增長都有所減緩，符合oAd 對腫瘤有殺傷作用。胰腺腫瘤結(jié)締組織增生和腫瘤TME 限制病毒的進(jìn)入復(fù)制以及效應(yīng)T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞的腫瘤浸潤[13]。將藥物溶解在微泡殼內(nèi)的脂質(zhì)中，或附著在微泡殼表面[14-15]，當(dāng)載藥的微泡到達(dá)目標(biāo)位置后，用低強(qiáng)度超聲刺激微泡破裂，產(chǎn)生的液體流動(dòng)增加了細(xì)胞的剪切應(yīng)力，使細(xì)胞膜通透性增加，促進(jìn)分子、納米顆粒等治療劑在細(xì)胞內(nèi)遞送而不造成不可逆的細(xì)胞損傷[16-17]。為了探尋UTMD 是否能增強(qiáng)oAd 對胰腺癌的溶瘤作用，筆者對小鼠瘤體進(jìn)行測量并進(jìn)一步行腫瘤組織HE 染色和Tunel 染色及腫瘤細(xì)胞凋亡分析，結(jié)果顯示oAd+UTMD 組小鼠腫瘤體積增長比oAd 組顯著減緩，腫瘤組織腫瘤壞死和凋亡均為最多。為進(jìn)一步研究UTMD 是否提高oAd 在腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染，對腫瘤組織進(jìn)行oAd 獨(dú)特表達(dá)的E1A 染色，結(jié)果顯示在給予相同病毒量的情況下oAd+UTMD組E1A 蛋白染色最深，這提示UTMD 通過提高oAd 在體內(nèi)利用率來增強(qiáng)其抗腫瘤作用。oAd 組和oAd+微泡組無論是在抑制腫瘤生長還是富集CD3+T 細(xì)胞等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示單純的微泡對oAd溶瘤效果幫助不大，微泡破裂產(chǎn)生的空化作用才是溶瘤的關(guān)鍵因素。

實(shí)體腫瘤內(nèi)促血管生成因子過表達(dá)，使腫瘤內(nèi)血管生成畸形和血液灌注少，血液內(nèi)抗腫瘤因子無法進(jìn)入[18]。有相關(guān)研究表明，UTMD 可以促進(jìn)前列腺素和一氧化氮的產(chǎn)生，使腫瘤血管正?；?，增加腫瘤局部的血流灌注[19]。Lin 等[20]研究發(fā)現(xiàn)UTMD 的空化將腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞從M2 巨噬細(xì)胞重新定向到抑制腫瘤的M1 巨噬細(xì)胞，使腫瘤內(nèi)血管正?；?，促進(jìn)藥物向腫瘤內(nèi)滲透。這也解釋了在實(shí)驗(yàn)中UTMD 組的腫瘤體積增長比NC 組略緩，UTMD 組在富集CD3+T 細(xì)胞和誘導(dǎo)腫瘤凋亡等方面比NC 組略強(qiáng)。Zhang 等[21]在探尋如何以低成本的方式將核酸轉(zhuǎn)染進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中時(shí)，發(fā)現(xiàn)UTMD 處理后細(xì)胞立即出現(xiàn)孔隙，并在30 min 內(nèi)細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常。UTMD 不僅使細(xì)胞產(chǎn)生空隙增加藥物運(yùn)輸，同時(shí)刺激細(xì)胞內(nèi)吞作用增加。Jin 等[22]用微泡運(yùn)輸腺相關(guān)病毒，對Hela 細(xì)胞超聲照射后發(fā)現(xiàn)病毒不完全通過超聲形成的空隙運(yùn)輸，由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞作用增加，細(xì)胞通過內(nèi)吞來攝取溶瘤病毒，同時(shí)恢復(fù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。

溶瘤病毒將腫瘤細(xì)胞溶解后釋放的腫瘤相關(guān)抗原和腫瘤新抗原可被樹突狀細(xì)胞呈現(xiàn)在細(xì)胞表面，刺激免疫細(xì)胞啟動(dòng)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[23]。溶瘤病毒介導(dǎo)的免疫治療在實(shí)體腫瘤治療中療效差的原因主要考慮：一是腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)中纖維增生多，使病毒無法滲透進(jìn)腫瘤內(nèi)部；二是腫瘤周圍有免疫抑制微環(huán)境，其中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和骨髓源性抑制細(xì)胞增多，而免疫細(xì)胞處于耗竭狀態(tài)，進(jìn)而無法響應(yīng)溶瘤病毒引發(fā)的抗腫瘤免疫[24]。本研究中注射oAd 的3 組小鼠腫瘤切片中CD3+T 細(xì)胞均有所增加，其中以oAd+UTMD 組增加最明顯且與oAd 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示UTMD 和oAd 聯(lián)合使用可以提升oAd 引的抗腫瘤免疫能力。

綜上所述，UTMD 和oAd 聯(lián)合使用時(shí)，UTMD 可以促進(jìn)oAd 在腫瘤內(nèi)的轉(zhuǎn)染，協(xié)助oAd 在腫瘤內(nèi)富集更多的免疫細(xì)胞，增加腫瘤內(nèi)壞死和凋亡從而抑制腫瘤增長。