熊華才 許雨欣 鄔振華 胡丹飛 李群 項振飛
喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤,喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是最常見的類型,約占90%[1]。喉部主要生理功能是吞咽、呼吸和發(fā)音,喉癌主要通過手術(shù)切除、聯(lián)合術(shù)前或術(shù)后化療、放療等綜合治療方式治療。雖然目前臨床已對喉癌的治療做了大量研究,但喉癌發(fā)病率和死亡率依舊較高。在癌癥發(fā)展過程中癌細(xì)胞存在自噬和凋亡現(xiàn)象[2]。細(xì)胞凋亡是一種阻止癌細(xì)胞存活的程序性細(xì)胞死亡途徑,而自噬通過清除受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)以及限制細(xì)胞生長,從而抑制惡性腫瘤發(fā)展,凋亡和自噬是常見的腫瘤抑制機(jī)制[3]。
膽固醇25-羥化酶(cholesterol 25-hydroxylase,CH25H)是一種催化膽固醇氧化形成可溶性產(chǎn)物25-羥基膽固醇(25-hydroxycholesterol,25-HC)的酶,參與脂質(zhì)代謝。也有研究表明,CH25H 在炎癥和免疫應(yīng)答中發(fā)揮多種功能[4]。CH25H 在黑色素細(xì)胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和膽管癌等惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。在黑色素細(xì)胞瘤患者的外周血WBC 中觀察到CH25H 丟失,這與轉(zhuǎn)移和低生存率相關(guān)[5]。但CH25H 在LSCC 中的表達(dá)模式、腫瘤相關(guān)作用及分子機(jī)制目前尚不清楚。本研究旨在探討CH25H 在LSCC中的生物學(xué)作用和調(diào)控機(jī)制。
1.1 材料 SPF 級4 周齡的BALB/c 雄性裸鼠24 只,體重20~25 g,購自杭州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心[動物許可證號:SYXK(浙)2019-0011],普通飼料喂養(yǎng)。本動物實驗方案經(jīng)浙江省實驗動物中心實驗動物福利倫理委員會審查通過(批準(zhǔn)文號:ZJCLA-IACUC-20040153)。人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞(HOK)以及人LSCC 細(xì)胞系TU-177、AMC-HN-8 購自上海雅吉生物科技公司,F(xiàn)DLSC-1 購自南京萬木春生物科技公司,過表達(dá)慢病毒購自上海吉瑪基因生物科技公司,Dulbecco 改良的Eagle 培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM)(批號:C11995500BT,規(guī)格:500 mL)和FBS(批號:10091148,規(guī)格:500 mL)均購自美國Gibco 公司,RIPA裂解液(批號:20-188,規(guī)格:100 mL)、聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)(批號:C3117,規(guī)格:0.45 μm)購自美國Millipore 公司,二辛可寧酸(bicinchonininc acid,BCA)試劑盒(批號:P0010S,規(guī)格:200次)、Trizol 試劑盒(批號:R0016,規(guī)格:100 mL)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)預(yù)制膠(批號:PG42015-S,規(guī)格:10塊)購自北京索萊寶生物科技公司,實時熒光定量PCR 試劑盒(批號:RR820A,規(guī)格:200 次)購自日本TaKaRa 公司,蛋白抗體CH25H(批號:sc-293256,規(guī)格:100 μL)購自上海玉博生物科技有限公司,B 淋巴細(xì)胞瘤-2(B cell lymphoma 2,Bcl-2)(批號:3498T,規(guī)格:20 μL)、Bcl-2 關(guān)聯(lián)X 蛋白(Bax)(批號:2772T,規(guī)格:20 μL)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)(批號:9662S,規(guī)格:100 μL)、裂解的caspase-3(C-caspase-3)(批號:9664T,規(guī)格:20 μL)、β 肌動蛋白(β-actin)(批號:4970T,規(guī)格:20 μL)、微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3(LC3)Ⅰ、LC3Ⅱ(批號:3868T,規(guī)格:20 μL),Beclin-1(批號:3738S,規(guī)格:100 μL)、p62(批號:5114T,規(guī)格:20 μL)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)(批號:9271T,規(guī)格:20 μL)、磷酸化Akt(p-Akt)(批號:4060T,規(guī)格:20 μL)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)(批號:4292S,規(guī)格:100 μL)和磷酸化PI3K(p-PI3K)(批號:4228T,規(guī)格:20 μL)均購自美國CST 公司,聚凝胺(批號:BL628A,規(guī)格:500 μL)購自中國蘭杰柯科技有限公司;自動細(xì)胞計數(shù)儀(型號:TC10)購自美國Bio-Rad 公司。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 在含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)HOK、FD-LSC-1、TU177、AMC-HN-8 細(xì)胞,細(xì)胞均在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。通過5 μg/mL 聚凝胺介導(dǎo)慢病毒轉(zhuǎn)染LSCC 細(xì)胞株并用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)CH25H 的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株AMC-HN-8/CH25H。慢病毒空白載體AMC-HN-8/Mock 作為對照,未做轉(zhuǎn)染處理為AMC-HN-8。使用自動細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
1.3 LSCC 移植瘤動物模型的構(gòu)建和觀察 采用隨機(jī)數(shù)字表法將裸鼠分為AMC-HN-8 組、AMC-HN-8/Mock 組、AMC-HN-8/CH25H 組,每組8 只。取AMCHN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H 組對數(shù)生長期細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化,重新細(xì)胞計數(shù),使細(xì)胞懸浮液濃度調(diào)整至2.0×107個/mL,各取0.5 mL 細(xì)胞懸浮液依次接種于3 組裸鼠右側(cè)腋下,每天檢查裸鼠瘤體生長情況,瘤體長出為造模成功。每隔1 周用游標(biāo)卡尺測量裸鼠右側(cè)腋下原位腫瘤的長徑(L)與短徑(W),計算原位腫瘤的近似體積(V),V=0.5×(L×W2)。接種5 周后,斷頸處死裸鼠切取原位腫瘤,測定重量并切取部分腫瘤用于后續(xù)實驗。
1.4 CH25H mRNA 表達(dá)水平檢測 采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性5 min,96 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,35 個循環(huán)。引物序列如下,CH25H-F:5'- GGCATACCAAGTGTC-CTTCTAAGC-3';CH25H-R: 5'-AACACCCTACACCCAGATTCCTC-3';βactin-F:5'-CAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAG-3';βactin- R:5'- CGCAACTAAGTCATAGTCCGCCTAG- 3'。以β-actin 為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt法計算CH25H mRNA 相對表達(dá)水平。
1.5 CH25H、Bax、Bcl-2、C-caspase-3、caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin-1、p62、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot 法。RIPA 裂解液提取AMC-HN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H組LSCC 細(xì)胞和裸鼠瘤體組織總蛋白,采用BCA 法測定蛋白濃度。取40 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE。采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶(TBST 溶解)37 ℃封閉1 h。將PVDF 膜置于CH25H、Bax、Bcl-2、C-caspase-3、caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin-1、p62、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 和β-actin 一抗溶液(1∶2 000)4 ℃過夜,PBST 洗膜(6×5 min);將膜置于辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗溶液(1∶5 000)中37 ℃孵育1.5 h,PBST 洗膜(6×5 min)后,化學(xué)發(fā)光顯色劑顯色,凝膠成像系統(tǒng)曝光成像,結(jié)果以相對灰度值表示。
1.6 細(xì)胞凋亡率檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測。收集AMC-HN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H組轉(zhuǎn)染24、48、72 h 后的LSCC 細(xì)胞,根據(jù)試劑盒說明書使用Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡試劑盒分析細(xì)胞凋亡,1 000×g 離心后棄上清液,加入195 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI 染色液,避光孵育15 min后上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。
1.7 細(xì)胞自噬檢測 采用免疫熒光法。將AMC-HN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H 組LSCC 細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min,然后用0.1%Triton X-100 4 ℃滲透細(xì)胞10 min。用含有2%FBS 白蛋白的PBS 在室溫下飽和1 h 后,用LC3Ⅱ一抗抗體進(jìn)行免疫熒光處理,然后用Alexa Fluor 488 偶聯(lián)免疫球蛋白和DAPI 進(jìn)行免疫熒光處理。采用Olympus Fluoview 1000共聚焦顯微鏡觀察自噬蛋白LC3Ⅱ熒光染色情況。
1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 9.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示,兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 HOK 與LSCC 細(xì)胞CH25H mRNA 的相對表達(dá)水平比較 相較HOK 正常細(xì)胞,F(xiàn)D-LSC-1、TU177、AMC-HN-8 3 種LSCC 細(xì)胞中CH25H 相對表達(dá)水平均明顯下調(diào)(均P<0.05),其中AMC-HN-8 水平最低,見圖1,選取其進(jìn)行后續(xù)實驗。
圖1 HOK 和LSCC 細(xì)胞系(FD-LSC-1、TU177、AMC-HN-8)中CH25H 表達(dá)水平的比較
2.2 CH25H 對喉鱗癌AMC-HN-8 細(xì)胞凋亡率和凋亡蛋白的影響 AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組CH25H表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),AMC-HN-8/CH25H組CH25H表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05),見圖2A、B。AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AMC-HN-8/CH25H組24、48、72 h 的細(xì)胞凋亡率均明顯高于AMC-HN-8/Mock 組(P<0.05),見圖2C。AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock組Bax、Bcl-2 和C-caspase-3 蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05);與AMC-HN-8/Mock 組比較,AMC-HN-8/CH25H組Bax、C-caspase-3蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(均P<0.05),Bcl-2 蛋白明顯下調(diào)(P<0.05),見圖2D、2E。
圖2 CH25H 促進(jìn)喉鱗癌AMC-HN-8 細(xì)胞凋亡(A:CH25H 表達(dá)的電泳圖;B:3 組細(xì)胞CH25H 的表達(dá)水平;C:3 組細(xì)胞不同時點凋亡率的比較;D:Bax、Bcl-2、C-caspase-3、caspase-3 蛋白表達(dá)的電泳圖;E:Bax、Bcl-2、C-caspase-3、caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較)
2.3 CH25H 對AMC-HN-8 細(xì)胞自噬蛋白的影響AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組LC3Ⅱ、Beclin-1 和p62 蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。相較AMC-HN-8/Mock 組,AMC-HN-8/CH25H 組LC3Ⅱ和Beclin-1 表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05),p62 明顯下調(diào)(P<0.05),見圖3A(插頁)。免疫熒光結(jié)果顯示,與AMC-HN-8/Mock 組比較,AMC-HN-8/CH25H 組LC3Ⅱ標(biāo)記的自噬小體數(shù)量增加,見圖3B(插頁)。
圖3 過表達(dá)CH25H 促進(jìn)喉鱗癌AMC-HN-8 細(xì)胞自噬(A:CH25H 對LSCC 細(xì)胞自噬蛋白影響的電泳圖及表達(dá)水平比較;B:3 組細(xì)胞LC3Ⅱ表達(dá)的染色結(jié)果,免疫熒光染色×400)
2.4 CH25H 對AMC-HN-8 細(xì)胞PI3K/Akt 信號通路蛋白的影響 Western blot 檢測p-PI3K、PI3K、p-Akt 和Akt 信號通路蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。與AMC-HN-8/Mock組比較,AMC-HN-8/CH25H 組p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平下調(diào),見圖4。
圖4 3 組細(xì)胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達(dá)的電泳圖及表達(dá)水平比較
2.5 CH25H 對裸鼠移植瘤體積和重量的影響 接種AMC-HN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H細(xì)胞后第5 周處死裸鼠切取的移植瘤見圖5A(插頁)。AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組裸鼠移植瘤CH25H 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義,AMC-HN-8/CH25H 組CH25H 表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05),見圖5B(插頁)。AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 裸鼠瘤體體積、重量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,而與AMC-HN-8/Mock 組比較,AMC-HN-8/CH25H 組裸鼠瘤體體積和重量顯著減?。ň鵓<0.05),過表達(dá)CH25H 裸鼠移植瘤生長速度顯著減緩(P<0.05),見圖5C、D(插頁)。
圖5 CH25H 影響喉鱗癌細(xì)胞體內(nèi)生長(A:第5 周移植瘤裸鼠及移植瘤裸鼠右側(cè)腋下原位移植瘤;B:CH25H 在AMC-HN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H 移植瘤中的表達(dá)水平;C:裸鼠移植瘤體積的變化;D:第5 周裸鼠移植瘤重量的比較)
2.6 CH25H 對裸鼠移植瘤細(xì)胞自噬蛋白、凋亡蛋白和PI3K/Akt 信號通路蛋白的影響 AMC-HN-8 和AMCHN-8/Mock 組Bax、Bcl-2、C-caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin-1、p62 蛋白表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。與AMC-HN-8/CH25H 組比較,AMC-HN-8/Mock 組Bax、C-caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin-1 表達(dá)上調(diào),Bcl-2、p62 表達(dá)下調(diào),見圖6A、B、D、E。同時檢測PI3K/Akt 信號通路相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn),AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組p-PI3K 和p-Akt蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。與AMC-HN-8/Mock組比較,AMC-HN-8/CH25H 組p-PI3K 和p-Akt 表達(dá)水平下調(diào),見圖6C、F。
圖6 CH25H 通過抑制PI3K/Akt 信號通路調(diào)控喉鱗癌細(xì)胞自噬和凋亡(A、D:凋亡蛋白表達(dá)的電泳圖及表達(dá)水平比較;B、E:自噬蛋白表達(dá)的電泳圖及表達(dá)水平比較;C、F:PI3K/Akt 信號通路蛋白表達(dá)的電泳圖及表達(dá)水平比較)
研究報道CH25H 通過25-HC 可在不同的生物過程中發(fā)揮重要作用,對25-HC 的相關(guān)研究已確定25-HC 具有抗病毒和抗炎作用[4]。此外,CH25H 可以抑制細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的胞吞作用,促進(jìn)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞活性,即促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng),進(jìn)而抑制腫瘤生長[6]。CH25H 可以作為乳腺癌患者預(yù)測因子[7]。甲基化異常基因CH25H 和其他3 個基因可以作為肺鱗癌預(yù)后風(fēng)險模型預(yù)測患者的預(yù)后[8]。而本研究發(fā)現(xiàn)CH25H 可以平衡腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡。
細(xì)胞凋亡通過清除病變細(xì)胞來維持組織穩(wěn)態(tài),促進(jìn)細(xì)胞凋亡可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長,從而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤的重要手段。癌細(xì)胞表現(xiàn)出對凋亡的抵抗,以維持其不受控制的增殖。具有調(diào)節(jié)凋亡活性的分子都有可能成為一種潛在的抗癌靶標(biāo)[9]。Bcl-2 具有抗凋亡作用,Bax 誘導(dǎo)凋亡,C-caspase-3 的激活則被視為凋亡細(xì)胞死亡的標(biāo)志[10-11]。本研究中CH25H 上調(diào)后抑制了LSCC 細(xì)胞中Bcl-2 表達(dá),同時促進(jìn)了Bax 和C-caspase-3 表達(dá),促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞凋亡。
自噬是真核細(xì)胞中一種保守的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng),其生理功能是清除衰老細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)受損蛋白,維持饑餓時氨基酸庫的穩(wěn)定。近年來研究發(fā)現(xiàn),自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),自噬激活有助于清除腫瘤細(xì)胞[12]。然而,有研究表明自噬也會維持腫瘤細(xì)胞的生存,說明自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著抑制和促進(jìn)的雙重作用,但本研究中CH25H 的表達(dá)在清除LSCC細(xì)胞中發(fā)揮著促進(jìn)自噬的作用。自噬的特征包括誘導(dǎo)、成核、延伸、成熟和破壞等多個動態(tài)過程。其中,延伸對于完全自噬體的形成至關(guān)重要,而從LC3Ⅰ到LC3Ⅱ是延伸過程中的重要轉(zhuǎn)變,LC3Ⅱ和Beclin-1 是自噬通量的標(biāo)志,分別參與自噬囊泡的起始和關(guān)閉。此外,當(dāng)自噬被激活時,自噬底物p62 會被下調(diào)[13]。本研究中CH25H 上調(diào)后抑制了LSCC 細(xì)胞中p62 表達(dá),同時促進(jìn)了LC3Ⅱ和Beclin-1 表達(dá)。
PI3K/Akt 通路是一種主要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、自噬、凋亡、代謝和血管生成[14-15]。PI3K/Akt/mTOR 信號通路在自噬和凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用,抑制mTOR 通路可增強(qiáng)自噬體的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和死亡。一些抗癌藥物通過抑制PI3K/Akt 通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬。還有證據(jù)表明,自噬和凋亡之間的相互作用是通過PI3K/Akt 信號通路[16]。在腫瘤發(fā)生過程中PI3K/Akt 通路經(jīng)常過度激活[17],這與本研究結(jié)果一致,在LSCC 細(xì)胞中PI3K/Akt 通路被過渡激活,CH25H 通過抑制PI3K/Akt 信號通路進(jìn)而影響細(xì)胞自噬和凋亡。
綜上所述,本研究探討了CH25H 在LSCC 細(xì)胞自噬和凋亡發(fā)揮的作用,發(fā)現(xiàn)CH25H 可通過PI3K/Akt通路調(diào)控LSCC 細(xì)胞凋亡和自噬進(jìn)而影響LSCC 進(jìn)展,這可能為LSCC 相關(guān)治療提供極有前景的分子靶點。