依日扎提·艾力 王增亮 努爾斯曼古麗·買買提明 秦虎 汪永新

【摘要】膠質(zhì)瘤是一種最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，由于其早期診斷困難、解剖位置復(fù)雜及復(fù)發(fā)率高，導(dǎo)致其預(yù)后極差，使之成為致死性最高的惡性腫瘤之一。近幾年來，隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，液體活檢以可重復(fù)性和微創(chuàng)為特點(diǎn)在膠質(zhì)瘤的早期發(fā)現(xiàn)、耐藥監(jiān)測(cè)、靶點(diǎn)檢測(cè)及預(yù)后預(yù)測(cè)中表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。然而，液體活檢在膠質(zhì)瘤患者臨床應(yīng)用中仍面臨著一系列的挑戰(zhàn)，本文綜述液體活檢及其生物標(biāo)志物在膠質(zhì)瘤中的研究進(jìn)展及其臨床應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】膠質(zhì)瘤；液體活檢；腦脊液；生物標(biāo)志物

【中圖分類號(hào)】R739.41【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1672-7770（2024）01-0091-04

Application and prospect of liquid biopsy in glioma Yirizhati Aili， WANG Zengliang， Nuersimanguli Maimaitiming， et al. Department of Neurosurgery， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China

Corresponding author： WANG Yongxin

Abstract： Glioma is one of the most common primary intracranial tumors. Due to difficulty of early diagnosis， complicated anatomical location and high recurrence rate， it has a very poor prognosis， making it one of the most fatal malignant tumors. In recent years， with the development of second-generation sequencing technology， liquid biopsy characterized by reproducible and minimally invasive methods has shown promising applications in the early detection， drug resistance monitoring， target detection and prognostic prediction of glioma. However， liquid biopsy still faces several columns of challenges in the clinical application of glioma patients. Therefore， this paper will explore the progress of liquid biopsy and its biomarkers and its clinical application in glioma.

Key words： glioma; liquid biopsy; cerebrospinal fluid; biomarkers

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2022D01D70）；新疆維吾爾自治區(qū)區(qū)域協(xié)同創(chuàng)新專項(xiàng)（上海合作組織科技伙伴計(jì)劃及國際科技合作）項(xiàng)目（2021E01013）

作者單位：830054 烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科中心（依日扎提·艾力，王增亮，秦虎，汪永新），干部保健中心（努爾斯曼古麗·買買提明）

通信作者：汪永新

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的成人惡性腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的75%～80%。根據(jù)WHO分級(jí)分為Ⅰ-Ⅳ級(jí)，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）的惡性程度最高，平均總生存期不足14.6個(gè)月［1］。膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)的診斷和治療手段主要以組織活檢為標(biāo)準(zhǔn)，但由于腫瘤異質(zhì)性、特殊的解剖部位及侵襲性等原因使得其在臨床上仍具有一定的局限性［2］。液體活檢則在一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)活檢的局限性，從診斷到指導(dǎo)個(gè)體化治療具有重要的意義和應(yīng)用前景。

1液體活檢

“液體活檢”通過監(jiān)測(cè)尿液、腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）及血液等樣本中腫瘤起源的原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤病變脫落的細(xì)胞，循環(huán)DNA、RNA及循環(huán)外泌體等，實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期、動(dòng)態(tài)及低創(chuàng)監(jiān)測(cè)。由于傳統(tǒng)活檢無法動(dòng)態(tài)檢測(cè)腫瘤發(fā)展過程，同時(shí)難以捕捉較小的病灶，因此，由于非侵入性診斷工具的不斷發(fā)展，液體活檢因其優(yōu)勢(shì)在多種實(shí)體腫瘤的診斷和治療中廣泛應(yīng)用［3］。對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者而言，液體活檢最常用的標(biāo)本主要是CSF、血液及唾液。其中，CSF可以與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)病灶直接接觸并包含腫瘤代謝產(chǎn)物，因此CSF成為中樞神經(jīng)腫瘤液體活檢理想的樣本［4］。1990年科學(xué)家首次在皰疹性腦炎患者CSF中，檢測(cè)出病毒特異性DNA。此后，Siegal等［5］在膠質(zhì)瘤CSF來源的循環(huán)DNA中檢測(cè)到p53基因突變。隨后液體活檢逐漸成了膠質(zhì)瘤基礎(chǔ)和臨床研究的新熱點(diǎn)，有望替代傳統(tǒng)活檢，進(jìn)而幫助膠質(zhì)瘤患者制定更好的治療方案。

相對(duì)于傳統(tǒng)的組織病理活檢而言，液體活檢不會(huì)對(duì)腦組織造成損傷，可以在疾病不同階段連續(xù)進(jìn)行，在腫瘤進(jìn)展的不同時(shí)期可檢測(cè)到原發(fā)腫瘤相關(guān)遺傳信息，從而實(shí)現(xiàn)早期診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及評(píng)估預(yù)后，因此成為一種有前途的監(jiān)測(cè)工具。

1.1膠質(zhì)瘤中的CTCs檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）是從原發(fā)灶的膠質(zhì)瘤細(xì)胞或膠質(zhì)瘤干細(xì)胞脫落并進(jìn)入血管、CSF或唾液的游離腫瘤細(xì)胞，因此CTCs具有腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞的特性，包含原發(fā)腫瘤的特異性遺傳物質(zhì)和腫瘤分子表型等重要的信息［6］。目前多項(xiàng)研究證實(shí)，CTCs在肺癌、黑色素瘤、骨肉瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤等多種實(shí)體腫瘤的早期診斷、評(píng)估療效和預(yù)后中具有一定的作用［7］。但是，由于目前CTCs最常用的方法依賴于監(jiān)測(cè)上皮細(xì)胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecules，EpCAM），而該分子在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中不表達(dá)，導(dǎo)致CTCs在膠質(zhì)瘤患者中檢出率約為21%～82%［8］，從而限制了其在臨床上的實(shí)際應(yīng)用。

研究表明，膠質(zhì)瘤患者CSF中的CTCs具有高間充質(zhì)和少量的神經(jīng)信號(hào)，隨著表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）拷貝數(shù)增加，染色體數(shù)量也改變（3、7和12號(hào)染色體增加，10、13和22號(hào)染色體丟失），此過程與原發(fā)腫瘤同步。使用二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）或更敏感的靶向檢測(cè)方法對(duì)膠質(zhì)瘤患者CSF中的CTCs進(jìn)行突變分析可能有助于篩查復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高的GBM患者和直接動(dòng)態(tài)干預(yù)治療策略。因此，GBM患者CSF中的CTCs分析有助于更確切地區(qū)分分子亞型，因此可以作為評(píng)價(jià)預(yù)后和療效的生物標(biāo)志物［9］。此外，CTCs狀態(tài)與膠質(zhì)瘤患者的臨床特征有密切聯(lián)系，CTCs陽性與治療耐藥、局部復(fù)發(fā)和較短的無進(jìn)展生存期顯著相關(guān)；同時(shí)，對(duì)于晚期GBM患者CTCs的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)具有區(qū)分腫瘤復(fù)發(fā)和假性進(jìn)展的能力［10-11］。因此，表明CTCS計(jì)數(shù)反映了疾病狀態(tài)，隨著病情進(jìn)展而增加，而在放化療之后會(huì)下降。CTCs分析可能作為常規(guī)MRI的補(bǔ)充，更確切地監(jiān)測(cè)GBM患者病程變化。

雖然CTCs在GBM患者中有很大的應(yīng)用前景，但是其在臨床環(huán)境中仍受到質(zhì)疑和挑戰(zhàn)。首先，GBM患者CSF中提取CTCs存在濃度低及方法復(fù)雜等缺點(diǎn)。其次，由于腫瘤細(xì)胞基底膜的異質(zhì)性，從單個(gè)分析CTCs的分子亞型和特征所獲得的信息不能充分代表患者整個(gè)病變進(jìn)展。最后，到目前為止關(guān)于GBM患者CSF中CTCs的研究數(shù)量有限，各研究所包含的患者樣本量較少，沒有長期研究數(shù)據(jù)，所得出的研究結(jié)果存在質(zhì)疑。

1.2膠質(zhì)瘤中的循環(huán)腫瘤核酸檢測(cè)循環(huán)腫瘤核酸（circulating tumor nucleic acids，ctNAs）包括循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA、ctDNAs）和循環(huán)腫瘤RNA（circulating tumor RNA、ctRNAs），它們通過病變組織的分解釋放到血液、CSF以及尿液中［12］。分析ctNAs的難點(diǎn)是需要高靈敏度和特異度的技術(shù)來提取循環(huán)中低濃度的ctNAs，同時(shí)需要與正常細(xì)胞釋放的高濃度循環(huán)游離DNA和RNA分離。在晚期的實(shí)體腫瘤，如晚期肺癌患者血液中存在較高濃度的ctNAs，并且已被廣泛研究證明是預(yù)測(cè)全身治療反應(yīng)的早期預(yù)測(cè)因子［13］。

相關(guān)研究已表明，ctNAs已在一些原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者中檢測(cè)到，包括星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤。在一項(xiàng)研究中，所有少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和80.5%星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者血清中可以檢測(cè)到較高濃度的ctDNAs，并且ctDNAs中顯示腫瘤相關(guān)特異性生物標(biāo)志物［O6-甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）基因子甲基化/10q LOH/1p或19q LOH］［14］。另一項(xiàng)研究中，在33例中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者（7例原發(fā)性GBM，8例星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤，2例膠質(zhì)肉瘤，6例腦膜瘤和10例轉(zhuǎn)移瘤）的血清中檢測(cè)與原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤相關(guān)的基因（MGMT、RASSF2B、CDKN2A）甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示，星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤組70%的患者血清ctDNAs中，檢測(cè)到至少一個(gè)基因啟動(dòng)子甲基化；同樣，轉(zhuǎn)移瘤組中的7例患者和腦膜瘤組中的3例患者中，檢測(cè)到至少一個(gè)基因啟動(dòng)子甲基化；在5例GBM患者血清中檢測(cè)到較低濃度ctDNAs并發(fā)現(xiàn)與原發(fā)腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物。但是與其他腫瘤區(qū)別的是，GBM患者血清中ctDNA的濃度和陽性率均較低［15］。2014年，Bettegowda等［16］證實(shí)CSF是比血清更好的，作為檢測(cè)原發(fā)性腦部腫瘤來源的ctNAs的樣本。Huang等［8］對(duì)35例中樞神經(jīng)系統(tǒng)患者進(jìn)行CSF的ctDNAs進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示74%的樣本中含有原發(fā)腫瘤DNA，且腫瘤DNA的檢出率與腫瘤的解剖位置和腫瘤分級(jí)有關(guān)，而與腫瘤大小無關(guān)。Baraniskin等［17］發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤患者CSF的ctRNAs中miR-15b和miR-21的聯(lián)合檢測(cè)可以區(qū)分膠質(zhì)瘤和原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤。由于在治療過程較容易獲得患者CSF，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者CSF或血液中的ctNAs不但有助于疾病的早期診斷，也有望實(shí)現(xiàn)不同階段的個(gè)體化治療。

1.3膠質(zhì)瘤中的循環(huán)外泌體檢測(cè)外泌體（exosomes）是被膜包裹的胞外囊泡，一般直徑為40～100 nm，多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均主動(dòng)分泌外泌體，它攜帶了各種細(xì)胞成分，如蛋白質(zhì)、核酸（mRNA、DNA、非編碼RNA）和脂類。外泌體可以介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，通過釋放包含的生物因子，從而改變受體細(xì)胞的分子活動(dòng)。因此，腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體中含有腫瘤特異性生物標(biāo)志物并可以檢測(cè)到原發(fā)腫瘤特點(diǎn)。一項(xiàng)研究結(jié)果表明，移植人類癌癥干細(xì)胞的小鼠模型中，小鼠CSF中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞相關(guān)的胞外囊泡［18］。另一項(xiàng)研究表明，在膠質(zhì)瘤患者中低級(jí)別和高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者CSF中都可以分離胞外囊泡，并且反映病變進(jìn)展程度［19］。這些研究結(jié)果證明，外泌體可用于檢測(cè)臨床相關(guān)的預(yù)后生物標(biāo)志物，如CSF來源的胞外囊泡中檢測(cè)到 IDH1-R132H的突變。

一項(xiàng)研究中，隨訪檢測(cè)腫瘤切除術(shù)后膠質(zhì)瘤患者血漿外泌體中基因表達(dá)情況，結(jié)果表明這些胞外囊泡與腫瘤切除后復(fù)發(fā)有關(guān)，其外泌體中特異性miRNA的差異表達(dá)可為膠質(zhì)瘤的診斷和監(jiān)測(cè)藥物耐性提供新的生物標(biāo)志物［20］，進(jìn)一步地證明CSF或血漿中外泌體分析有助于膠質(zhì)瘤的早期診斷、評(píng)估預(yù)后以及檢測(cè)對(duì)化療藥物的耐藥性。

2樣本的選擇

CSF被認(rèn)為是一種包含大量腫瘤信息的、可分析循環(huán)腫瘤標(biāo)志物的理想液體活檢樣本。雖然獲取CSF途徑是有創(chuàng)操作并具有一定的風(fēng)險(xiǎn)，并不是所有患者都能承受風(fēng)險(xiǎn)，但是與傳統(tǒng)取活檢相比，它是一種微創(chuàng)手術(shù)活檢，獲取較簡單、創(chuàng)傷小。在膠質(zhì)瘤患者中CSF可作為液體活檢的樣本，可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展，但這個(gè)過程需要患者同意并反復(fù)進(jìn)行腰椎穿刺［21］。

目前研究表明，在膠質(zhì)瘤患者CSF中可以提取較高濃度的ctDNAs，而ctDNAs的濃度相比血清中的濃度高，這一結(jié)果表明CSF是比較理想的液體活檢樣本［22］。在一項(xiàng)研究中，采用NGS對(duì)85例膠質(zhì)瘤患者CSF的ctDNA進(jìn)行分析，其中WHO分級(jí)Ⅳ級(jí)46例，Ⅲ級(jí)26例，Ⅱ級(jí)13例，其中49.4%的患者CSF的ctDNAs中檢測(cè)到基因改變，20例患者的實(shí)體組織活檢樣本與CSF的ctDNAs分析的基因都有相似的突變。同時(shí)，CSF中的ctDNAs也顯示拷貝數(shù)改變、啟動(dòng)子突變、蛋白質(zhì)編碼突變和結(jié)構(gòu)重排，盡管患者缺乏腫瘤分級(jí)、病程或既往病史，但ctDNAs分析的上述變化與較差的預(yù)后相關(guān)，且具有指導(dǎo)用藥的作用［9］。一項(xiàng)對(duì)繼發(fā)性腦轉(zhuǎn)移瘤的原發(fā)性肺癌患者的研究支持上述觀念，認(rèn)為CSF是理性的液體活檢樣本。該研究通過NGS方法分別對(duì)CSF的ctDNAs和血清的ctDNAs突變模式進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明與原發(fā)腫瘤相關(guān)突變基因在CSF ctDNAs、血清ctDNAs和CTCs中陽性率分別為95.2%（20/21）、66.7（14/21）和39%（8/21）。12例患者（57.2%）通過CSF中生物標(biāo)志物分析可以檢測(cè)到EGFR突變，而通過血清ctDNAs和CTCs檢測(cè)到5例。CSF中ctDNAs EGFR的突變與原發(fā)性腫瘤EGFR的突變一致率為88.9%［14］。

綜上所述，對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤CSF可以作為更可靠、更理想的液體活檢樣本，是因?yàn)镃SF本身在腦室和脊髓腔內(nèi)循環(huán)流動(dòng)，能直接接觸病變組織，含有大量的腫瘤脫落細(xì)胞及代謝產(chǎn)物。然而，由于CSF液體活檢用于動(dòng)態(tài)連續(xù)檢測(cè)疾病進(jìn)展，而CSF獲取具有一定的侵襲性，不同個(gè)體接受程度不同，所以這需要在實(shí)際臨床中權(quán)衡其利弊。CSF液體活檢在臨床中的應(yīng)用價(jià)值還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

3液體活檢在膠質(zhì)瘤臨床診療中的應(yīng)用

隨著基因芯片技術(shù)的大力發(fā)展，液體活檢在膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)后及療效評(píng)價(jià)中展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用前景。Baraniskin等［17］首次報(bào)道在CSF中miR-15b和miR-21的聯(lián)合檢測(cè)可以用于膠質(zhì)瘤的早期診斷。隨后，Teplyuk等［23］也發(fā)現(xiàn)，CSF中miR-10b和miR-21可以將膠質(zhì)瘤和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病鑒別，而miR-200家族則有助于鑒別腦轉(zhuǎn)移瘤和膠質(zhì)瘤。同時(shí)，已有研究表明［18］，CTCs和外泌體可用于診斷可外科手術(shù)治療的膠質(zhì)瘤，其隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加在血液和CSF中CTCs和外泌體數(shù)量增加。此外，一些研究表明CSF中特定的生物標(biāo)志物也可以用于膠質(zhì)瘤的早期診斷［24］。

此外大量的研究表明，特定CTCs或ctNAs的異常表達(dá)與較短的總生存期（overall survival，OS）和/或無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）顯著相關(guān)，提示可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者中具有預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值。Martínez-Ricarte等［25］研究分析來自癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的2個(gè)腫瘤組（包括 648 例彌漫性膠質(zhì)瘤）的 異檸檬酸脫氫酶1（isocitric dehydrogenase 1，IDH1）、IDH2、TP53、TERT、ATRX、H3F3A 和 HIST1H3B 基因突變，對(duì)20例膠質(zhì)瘤患者的臨床腫瘤標(biāo)本及CSF中上述7個(gè)基因進(jìn)行的靶向外顯子測(cè)序和微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）分析發(fā)現(xiàn)，CSF-ctDNA可對(duì)腫瘤進(jìn)行準(zhǔn)確地組織病理分型，并與預(yù)后相關(guān)。禹金良等［26］在膠質(zhì)瘤患者CSF中發(fā)現(xiàn)，PIK3CA、KRAS、EGFR突變基因匹配到潛在耐藥藥物，對(duì)臨床靶向治療具有指導(dǎo)作用。Zhi等［27］的研究證實(shí)了9個(gè)miRNAs組合是一個(gè)獨(dú)立于其他臨床病理因素的重要預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，其還觀察到星形細(xì)胞瘤患者血液中9種miRNAs，包括miR-15b、miR-21、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-106a、miR-182、miR-182、miR-520h的表達(dá)水平均比健康組顯著增高，而手術(shù)后這9種miRNAs的表達(dá)水平明顯降低。以上述種種證據(jù)初步表明，基于膠質(zhì)瘤患者中CSF和血漿的液體活檢，可用于腫瘤的診斷、預(yù)后及療效評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物分析，然而液體活檢在臨床診療中處于初步應(yīng)用階段，仍需要大量的研究證實(shí)。

4結(jié)論

大量的研究結(jié)果表明，對(duì)膠質(zhì)瘤患者中CSF和血漿的液體活檢，可以作為組織活檢的潛在替代品，用于膠質(zhì)瘤的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物?？紤]到傳統(tǒng)取活檢相對(duì)困難及風(fēng)險(xiǎn)較高，而開發(fā)與腫瘤發(fā)展相關(guān)生物標(biāo)志物是膠質(zhì)瘤個(gè)體化治療趨勢(shì)中必不可少的。液體活檢提供了更安全、更方便的技術(shù)來獲取腫瘤相關(guān)分子信息，可以低創(chuàng)動(dòng)態(tài)地對(duì)疾病進(jìn)行診斷、調(diào)整治療方案以及有助于靶向藥物的研發(fā)。然而，這些研究規(guī)模較小，尚不能形成有力的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)論來證明腫瘤生物標(biāo)志物的檢測(cè)與疾病參數(shù)的相關(guān)性。而且液體活檢需要依靠一些較前沿的技術(shù)如NGS，數(shù)字PCR等，技術(shù)成本較高且對(duì)檢測(cè)人員要求也高，因而限制了其在臨床中的應(yīng)用。因此，這些需要大量的研究驗(yàn)證液體活檢技術(shù)在膠質(zhì)瘤患者中的有效性和可靠性，同時(shí)需要不斷地開發(fā)更簡單、更準(zhǔn)確的方法來進(jìn)行生物標(biāo)志物的監(jiān)測(cè)及療效評(píng)估等。

利益沖突：?所有作者均聲明不存在利益沖突。

［參 考 ?文 ?獻(xiàn)］

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（收稿2022-10-20修回2023-01-31）