張明月，陳晨，王萌，王守宇

0 引言

胃癌是全球第五大常見(jiàn)腫瘤，死亡率居全球前三，是威脅人民健康的重要疾病之一[1-2]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的提高，人們發(fā)現(xiàn)基因突變、基因表達(dá)差異以及表觀遺傳的改變對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展影響巨大[3]。因此，在分子水平上探究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對(duì)于提高胃癌診療水平具有重要的意義。

哺乳動(dòng)物基因組存在編碼基因和非編碼基因，而非編碼基因占整個(gè)基因組98%以上[4]。非編碼RNA可以分為短鏈非編碼RNA（長(zhǎng)度＜200 bp）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（長(zhǎng)度＞200 bp），其中長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）不僅可以調(diào)節(jié)自身轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)附近的基因表達(dá)，還可以與遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)錄因子或細(xì)胞質(zhì)中蛋白相互作用[5]。在前期研究中，我們?cè)谌幮匀橄侔┘?xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA，命名為L(zhǎng)nc-BM（long noncoding for brain metastasis），其主要定位于細(xì)胞質(zhì)并具有較低的蛋白編碼潛力。通過(guò)研究，我們發(fā)現(xiàn)Lnc-BM通過(guò)激活JAK2-STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)下游細(xì)胞黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1, ICAM1）和趨化因子配體2（C-C motif chemokine ligand 2, CCL2）的表達(dá)。ICAM1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附到腦血管，CCL2促進(jìn)巨噬細(xì)胞招募并分泌抑瘤素M（oncostatin M, OSM）和白細(xì)胞介素6（interleukin 6,IL-6）進(jìn)一步激活JAK2信號(hào)通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移[6]。目前，Lnc-BM在其他腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制還不清楚，值得深入研究。

線粒體是生物能量和生物合成的細(xì)胞器，線粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致發(fā)育功能異常，代謝系統(tǒng)紊亂以及腫瘤等多種疾病的發(fā)生[7]。2008年Ghezzi團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)Fas激活的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族（fasactivated serine/threonine kinase, FASTK）中的FASTKD2定位于線粒體基質(zhì)，可以參與調(diào)節(jié)線粒體功能[8]。最近研究表明，F(xiàn)ASTK蛋白均可以定位于線粒體基質(zhì)，是線粒體基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子[9]。線粒體編碼的NADH脫氫酶6（MT-ND6）參與線粒體電子傳遞和線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的組裝[10]，F(xiàn)ASTK可以作用于MTND6 mRNA的3′端通過(guò)增強(qiáng)其穩(wěn)定性提高M(jìn)TND6蛋白表達(dá)水平[9]。TOM20是線粒體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)TOM復(fù)合體的亞基，可直接識(shí)別具有N端前導(dǎo)序列的前體蛋白，然后與TOM40形成蛋白復(fù)合體。TOM20代謝異常會(huì)導(dǎo)致線粒體相關(guān)疾病的發(fā)生，可作為線粒體相關(guān)的功能性蛋白[11]。

Lnc-BM是一種與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的LncRNA，但其是否會(huì)影響胃癌或其他腫瘤的進(jìn)展，目前尚不清楚。因此，本研究將探討Lnc-BM對(duì)胃癌增殖、遷移和侵襲能力的影響，并探索其分子機(jī)制，為胃癌臨床診斷尋找新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 組織樣本

收集在江蘇省南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院手術(shù)并經(jīng)病理診斷明確的36例胃癌患者的胃癌組織及癌旁正常組織。本研究經(jīng)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：2023-016-02），所有患者及其家屬知情并簽署同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞

人胃上皮細(xì)胞（GES-1、BGC823、SGC 7901、NCI-N87、MKN74）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

RPMI1640、Opti-MEM培養(yǎng)基、胰酶、PBS、青鏈霉素、胎牛血清（維森特生物）；FISH試劑盒（廣州銳博生物）；RT SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ChamQ SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物）；Western及IP細(xì)胞裂解液、結(jié)晶紫染液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物）；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（Bimake）；ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BIORAD）；Transwell小室（美國(guó)Corning）。FASTK抗體（PA5-21449，Invitrogen）；MT-ND6抗體（DF9676，Affinity Biosciences）；TOM20抗體（66777-1-Ig，Proteintech）；Tubulin抗體（AF0001，碧云天）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔二抗（1:1500，碧云天）。商品化GST-FASTK重組蛋白購(gòu)自Abnova公司（H00010922-P01）。Lnc-BM和FASTK的siRNA合成委托廣州銳博生物有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 上述細(xì)胞用含10%胎牛血清以及1%青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)在37℃、5%CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱中。

1.4.2 siRNA及慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 在6孔板中接種適宜密度的細(xì)胞，待細(xì)胞恢復(fù)正常形態(tài)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。在200 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中分別加入siRNA（50 pmol）或2.5 μl Dharmacon轉(zhuǎn)染試劑，混勻，靜置5 min。然后將兩管溶液混勻，靜置20 min后緩慢滴加至6孔板中，48 h后完成轉(zhuǎn)染進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用完全培養(yǎng)基將病毒稀釋至適宜濃度，與病毒感染試劑polybrene混勻后加入目的細(xì)胞，72 h后完成感染，使用1 μg/ml嘌呤霉素篩選細(xì)胞并進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4.3 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 使用TRIzol提取目的RNA，測(cè)定濃度。按照10 μl體系（2 μl的5×Supermix、500 ng RNA以及適量無(wú)酶水）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，程序如下：37℃ 15 min；85℃ 5 s。然后進(jìn)行RTqPCR反應(yīng)，5 μl SYBR、0.2 μl正向引物、0.2 μl反向引物、3.6 μl無(wú)酶水以及1 μl的cDNA。RT-qPCR擴(kuò)增程序：50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s；60℃ 15 s；95℃ 15 s，共循環(huán)40次。平行樣本的Ct值取均值，采用2-ΔΔCt的方法分析，引物序列如下：Lnc-BM的正向引物：5’-GTGGTTGTCAAAGGCAGTCA-3’，反向引物5’-AACACTGGGAGAGGATTGGG-3’；GAPDH的正向引物：5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3’，反向引物：5’-GGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCC-3’。

1.4.4 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 在細(xì)胞樣品中加入適量RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定樣品蛋白總量。蛋白定量后，加入蛋白上樣緩沖液，100℃變性5 min。電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，置于搖床4℃孵育一抗過(guò)夜。第2天室溫孵育二抗1 h后，加入超敏型ECL發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。

1.4.5 細(xì)胞原位雜交（FISH）實(shí)驗(yàn) 將NCI-N87細(xì)胞接種于熒光小皿中，細(xì)胞生長(zhǎng)至適宜密度后使用4%多聚甲醛固定，加入0.3%Triton X-100通透液于4℃靜置5 min后，PBS洗滌。加入200 μl預(yù)熱的預(yù)雜交液，37℃濕盒孵育30 min。棄預(yù)雜交液，加入含2.5 μl探針預(yù)熱的雜交液，37℃下置于避光濕盒中雜交過(guò)夜。第2天，在42℃使用雜交洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別避光洗滌，常溫PBS洗滌后使用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，然后使用激光共聚焦顯微鏡拍攝。

1.4.6 組織切片F(xiàn)ISH實(shí)驗(yàn) 將組織切片置于二甲苯及梯度乙醇中脫蠟，100°C左右純化水預(yù)處理切片，胃蛋白酶消化15 min，洗滌后使用梯度乙醇脫水。加入含探針的雜交液，37℃下置于避光濕盒中雜交過(guò)夜。第二天，在42℃下使用雜交洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別避光洗滌，DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，激光共聚焦顯微鏡拍攝。

1.4.7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將處理過(guò)的細(xì)胞以500個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)7～10天后，棄上清液、PBS洗滌、4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，洗凈后置于顯微鏡下拍照。

1.4.8 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染si-Lnc-BM的SGC7901細(xì)胞和Lnc-BM穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的BGC823細(xì)胞消化后，以5×103個(gè)/孔用新鮮培養(yǎng)基重懸后接種于96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，邊緣孔各加入100 μl的PBS緩沖液以防止蒸發(fā)。將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4 d，棄掉培養(yǎng)基，加入含10 μl CCK-8溶液的100 μl新鮮培養(yǎng)基，避光繼續(xù)孵育1.5 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度。

1.4.9 Transwell實(shí)驗(yàn) 在Transwell小室底部均勻涂抹50 μl纖連蛋白，晾干后放入24孔板置于培養(yǎng)箱中用于檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)：以1:30比例用無(wú)血清的培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，每孔加入50 μl至Transwell上室，放入培養(yǎng)箱中使其凝固。將細(xì)胞以4×104個(gè)/孔用無(wú)血清的培養(yǎng)基重懸后接種于Transwell上室中，下室加入600 μl完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)12 h后使用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，洗凈后置于顯微鏡下拍照。

1.4.10 RNA Pull-down實(shí)驗(yàn) 30 μg PGEM-3ZLnc-BM質(zhì)粒與2 μl限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ或EcoRⅠ混合配置酶切體系，37℃水浴加熱2 h后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，利用DNA回收試劑盒（LSKGEL050, Merck）得到純化的Lnc-BM正義鏈及反義鏈線性DNA。利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（AM1320,Ambion）轉(zhuǎn)錄得到Lnc-BM正義鏈及反義鏈RNA產(chǎn)物，進(jìn)行生物素標(biāo)記后純化備用。純化的RNA加入緩沖液[10 mmol/L Tris-HCl（pH=7.5），0.1 mol/L KCl，10 mmol/L MgCl2]恢復(fù)線性構(gòu)型。準(zhǔn)備適量細(xì)胞，加入含RNA酶抑制劑、蛋白酶和磷酸酶抑制劑以及組蛋白脫乙酰酶和去甲基化酶抑制劑的蛋白裂解液超聲裂解，離心后取上清液備用。RNA捕獲緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl（pH=7.5），1 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA]重懸鏈霉親和素磁珠后，加入20 μg生物素標(biāo)記的Lnc-BM室溫旋轉(zhuǎn)孵育后加入10×蛋白-RNA結(jié)合緩沖液 [20 mmol/L Tris-HCl（pH=7.5），0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L MgCl2，1%吐溫20] 50 μl，50%甘油150 μl，30 mg細(xì)胞裂解液，加無(wú)酶水補(bǔ)齊至500 μl，4℃旋轉(zhuǎn)孵育4 h。孵育得到的RNA-蛋白復(fù)合物使用洗滌緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl（pH=7.5），10 mmol/L NaCl，0.1%吐溫20]洗滌4次，得到的蛋白復(fù)合物變性后跑聚丙烯酰胺凝膠，銀染后進(jìn)行質(zhì)譜分析結(jié)合的蛋白。Lnc-BM與GST-FASTK重組蛋白的RNA Pull-down實(shí)驗(yàn)過(guò)程同上，將生物素標(biāo)記的1 μg Lnc-BM正義鏈及反義鏈RNA產(chǎn)物與鏈霉親和素磁珠孵育2 h后，加入1 μg GST-FASTK重組蛋白4℃旋轉(zhuǎn)孵育4 h，洗脫、變性后進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.4.11 Seahorse細(xì)胞能量代謝檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)前一天，接種8×103個(gè)細(xì)胞至培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。向水化板中加入200 μl的無(wú)菌水，將檢測(cè)板放入水化板中并置于無(wú)CO2的37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜；另取50 ml的校準(zhǔn)液于50 ml離心管中一起放入無(wú)CO2的37℃培養(yǎng)箱。次日，將檢測(cè)板中原有無(wú)菌水棄掉，加入提前準(zhǔn)備的200 μl校準(zhǔn)液，繼續(xù)置于無(wú)CO2的37℃培養(yǎng)箱中。配置終濃度為1 mmol/L丙酮酸、2 mmol/L谷氨酸以及25 mol/L葡萄糖的檢測(cè)培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH至7.4，過(guò)濾除菌后置于37℃預(yù)熱。棄去原有培養(yǎng)基，加入200 μl的檢測(cè)培養(yǎng)液洗滌兩次，然后加入180 μl的檢測(cè)培養(yǎng)液置于37℃培養(yǎng)箱平衡1 h。加入對(duì)應(yīng)藥物后置于Seahorse細(xì)胞能量代謝儀檢測(cè)。

1.4.12 裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn) 將10只6周齡Balb/c雄性裸鼠隨機(jī)分為兩組，每組5只，皮下注射Lnc-BM穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的BGC823細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/100微升。荷瘤12天后，每隔2天用游標(biāo)卡尺測(cè)量一次腫瘤長(zhǎng)徑和短徑，并計(jì)算腫瘤體積（長(zhǎng)徑×短徑×短徑×1/2）。荷瘤20天后，麻醉小鼠頸椎脫臼處死，取腫瘤稱(chēng)重分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS21.0和GraphPad Prism 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)分析，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lnc-BM在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lnc-BM在胃癌及癌旁正常組織中表達(dá)水平，結(jié)果顯示在36對(duì)胃癌組織中Lnc-BM表達(dá)水平高于癌旁組織（P=0.014），見(jiàn)圖1A。此外，我們?cè)谖赴┘?xì)胞系中檢測(cè)了Lnc-BM的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在胃癌細(xì)胞BGC823、SGC7901、NCI-N87和MKN74中的表達(dá)明顯高于正常胃黏膜細(xì)胞GES-1（均P＜0.05），見(jiàn)圖1B。RNA原位雜交（FISH）實(shí)驗(yàn)也證明Lnc-BM在胃癌組織中表達(dá)量較癌旁正常組織高（P＜0.05），見(jiàn)圖1C。

2.2 構(gòu)建Lnc-BM敲低及過(guò)表達(dá)的胃癌細(xì)胞株

為進(jìn)一步研究Lnc-BM對(duì)胃癌進(jìn)展的影響，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了特定干擾Lnc-BM表達(dá)的siRNA，轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞后，RT-qPCR證實(shí)si-Lnc-BM組表達(dá)顯著低于si-Ctrl組（均P＜0.01），見(jiàn)圖2A。同時(shí)，我們構(gòu)建了Lnc-BM過(guò)表達(dá)的慢病毒感染BGC823細(xì)胞，通過(guò)嘌呤霉素篩選得到Lnc-BM穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的BGC823細(xì)胞。RT-qPCR驗(yàn)證過(guò)表達(dá)組Lnc-BM表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），見(jiàn)圖2B。

圖2 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lnc-BM敲低及過(guò)表達(dá)胃癌細(xì)胞中Lnc-BM的表達(dá)水平Figure 2 Expression of Lnc-BM in its knockdown and overexpressing gastric cancer cells detected by RT-qPCR

2.3 Lnc-BM增加胃癌細(xì)胞的增殖能力

通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lnc-BM對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-L n c-B M 后，S G C 7 9 0 1 細(xì)胞克隆形成數(shù)下降（均P＜0.001），見(jiàn)圖3A～B；過(guò)表達(dá)Lnc-BM后，BGC823 細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯增多（P＜0.001），見(jiàn)圖3C～D。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，轉(zhuǎn)染si-Lnc-BM后，SGC7901細(xì)胞增殖能力下降（均P＜0.0001），見(jiàn)圖3E；過(guò)表達(dá)Lnc-BM后，BGC823細(xì)胞增殖能力高于對(duì)照組（均P＜0.0001），見(jiàn)圖3F。

圖3 克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lnc-BM對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響Figure 3 Effect of Lnc-BM on the proliferation of gastric cancer cells detected by colony formation and CCK-8 assays

2.4 Lnc-BM增加胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lnc-BM對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-Lnc-BM后的胃癌細(xì)胞遷移、侵襲能力下降（均P＜0.001），見(jiàn)圖4A～B；相反，Lnc-BM穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的胃癌細(xì)胞遷移、侵襲能力增強(qiáng)（均P＜0.001），見(jiàn)圖4C～D。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lnc-BM對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲能力影響Figure 4 Effect of Lnc-BM on the migration and invasion of gastric cancer cells detected by Transwell assay

2.5 Lnc-BM定位于細(xì)胞質(zhì)

通過(guò)Lnc-BM的FISH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lnc-BM在胃癌細(xì)胞中的定位，發(fā)現(xiàn)Lnc-BM主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，見(jiàn)圖5，提示Lnc-BM可能在胞質(zhì)中發(fā)揮其生物學(xué)作用。

圖5 RNA FISH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lnc-BM在細(xì)胞中的定位Figure 5 Location of Lnc-BM in cells detected by FISH assay

2.6 Lnc-BM結(jié)合FASTK蛋白

為了驗(yàn)證Lnc-BM是否與FASTK蛋白結(jié)合，我們首先在體外轉(zhuǎn)錄得到生物素標(biāo)記的Lnc-BM正義和反義的RNA產(chǎn)物，然后和SGC7901細(xì)胞裂解液孵育進(jìn)行RNA Pull-down實(shí)驗(yàn)。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)Lnc-BM與FASTK結(jié)合，而與陰性對(duì)照蛋白GAPDH沒(méi)有結(jié)合，見(jiàn)圖6A。此外，我們利用FASTK重組蛋白（通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，見(jiàn)圖6B）和生物素標(biāo)記的Lnc-BM正義和反義的RNA產(chǎn)物孵育后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Lnc-BM與FASTK可以直接結(jié)合，見(jiàn)圖6C。

圖6 RNA Pull-down驗(yàn)證Lnc-BM與FASTK蛋白結(jié)合Figure 6 Interaction between Lnc-BM and FASTK detected by RNA pull-down assay

2.7 Lnc-BM調(diào)控FASTK蛋白表達(dá)

Lnc-BM的siRNA轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞后，Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲低Lnc-BM后，細(xì)胞中FASTK蛋白水平也下降（均P＜0.05），見(jiàn)圖7A～B。相反，Lnc-BM穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的BGC823細(xì)胞中FASTK蛋白表達(dá)水平也增高（P＜0.05），說(shuō)明Lnc-BM可以調(diào)控FASTK的蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖7C～D。

圖7 Western blot檢測(cè)Lnc-BM敲低和過(guò)表達(dá)細(xì)胞中FASTK的蛋白表達(dá)水平Figure 7 FASTK protein levels in Lnc-BM knockdown and overexpression cells detected by Western blot

2.8 Lnc-BM調(diào)控線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)分析Lnc-BM是否調(diào)控線粒體相關(guān)蛋白MT-ND6和TOM20的表達(dá)。結(jié)果顯示，敲低Lnc-BM抑制了MT-ND6和TOM20蛋白表達(dá)水平（均P＜0.05），見(jiàn)圖8A～C；而Lnc-BM過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中MT-ND6和TOM20蛋白水平顯著增高（均P＜0.05），見(jiàn)圖8D～F。

圖8 Western blot檢測(cè)Lnc-BM敲低和過(guò)表達(dá)細(xì)胞中線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 8 Levels of mitochondria-associated proteins in Lnc-BM knockdown and overexpression cells detected by Western blot

2.9 Lnc-BM調(diào)控胃癌細(xì)胞線粒體呼吸功能

利用Seahorse檢測(cè)改變Lnc-BM表達(dá)后線粒體呼吸功能的改變。結(jié)果表明，降低Lnc-BM表達(dá)后細(xì)胞的基礎(chǔ)呼吸值、ATP產(chǎn)生量以及最大呼吸值均低于對(duì)照組細(xì)胞，說(shuō)明降低Lnc-BM表達(dá)后細(xì)胞的線粒體呼吸能力減弱，氧化磷酸化水平降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖9A。相反，Lnc-BM穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的BGC823細(xì)胞中線粒體呼吸能力顯著增強(qiáng)（均P＜0.05），見(jiàn)圖9B。

圖9 Seahorse實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lnc-BM敲低和過(guò)表達(dá)細(xì)胞中線粒體呼吸功能的改變Figure 9 Mitochondrial respiratory function in Lnc-BM knockdown and overexpression cells detected by Seahorse assay

2.10 Lnc-BM靶向FASTK調(diào)控線粒體呼吸能力

為了進(jìn)一步研究Lnc-BM是否通過(guò)FASTK發(fā)揮調(diào)節(jié)線粒體呼吸作用，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了特定干擾FASTK表達(dá)的siRNA，轉(zhuǎn)染Lnc-BM穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的BGC823細(xì)胞后，Western blot證實(shí)si-FASTK組表達(dá)顯著低于si-Ctrl組（均P＜0.05），見(jiàn)圖10A～B。此外，敲低FASTK顯著抑制Lnc-BM過(guò)表達(dá)所增加的MT-ND6和TOM20蛋白水平（均P＜0.05），見(jiàn)圖10A、C、D。同時(shí)，Seahorse實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在過(guò)表達(dá)Lnc-BM基礎(chǔ)上抑制FASTK表達(dá)，細(xì)胞的基礎(chǔ)呼吸值、ATP產(chǎn)生量以及最大呼吸值均降低，線粒體呼吸功能受到抑制（均P＜0.05），見(jiàn)圖10E。

圖10 Lnc-BM通過(guò)FASTK調(diào)控細(xì)胞中線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)以及線粒體呼吸功能的改變Figure 10 Lnc-BM regulated expression of mitochondria-associated proteins and mitochondrial respiratory function via FASTK

2.11 Lnc-BM促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)

為了觀察Lnc-BM在體內(nèi)是否促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，我們利用Lnc-BM穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的BGC823細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞注射在裸鼠皮下，構(gòu)建了裸鼠荷瘤模型。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Lnc-BM過(guò)表達(dá)組腫瘤中Lnc-BM表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)圖11A。與對(duì)照組相比，Lnc-BM穩(wěn)定過(guò)表達(dá)組腫瘤生長(zhǎng)更快，腫瘤體積更大，腫瘤重量顯著增加(均P＜0.05)，見(jiàn)圖11B～D。

圖11 裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)證明過(guò)表達(dá)Lnc-BM促進(jìn)胃癌生長(zhǎng)Figure 11 Growth of gastric cancer in nude mice promoted by Lnc-BM overexpression

3 討論

胃癌是人類(lèi)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，由于胃癌早期癥狀不明顯、篩查率低，大多數(shù)胃癌患者在確診時(shí)已處于晚期，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。目前胃癌臨床治療主要包括化療、靶向治療和免疫治療，但胃癌患者5年總體生存率仍然不足50%，尋找胃癌潛在分子靶標(biāo)對(duì)于治療胃癌意義重大[12]。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃測(cè)序的最終完成，人們認(rèn)識(shí)到長(zhǎng)鏈非編碼RNA具有豐富的生物學(xué)功能，可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控靶基因的表達(dá)，是腫瘤診斷的重要生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[5]。本課題組前期通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)Lnc-BM與乳腺癌進(jìn)展密切相關(guān)，可通過(guò)Lnc-BM/JAK2/STAT3/ICAM1通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移[6]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Lnc-BM在胃癌組織中表達(dá)高于正常組織，過(guò)表達(dá)Lnc-BM可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移潛能。這說(shuō)明Lnc-BM與胃癌進(jìn)展密切相關(guān)，因此進(jìn)一步研究了Lnc-BM調(diào)節(jié)胃癌進(jìn)展的具體分子機(jī)制。

線粒體氧化磷酸化是細(xì)胞的能量來(lái)源，線粒體功能改變引起的能量代謝失衡可以影響腫瘤細(xì)胞進(jìn)展，氧化磷酸化通路也已經(jīng)成為多種疾病治療靶點(diǎn)[13]。在我們先前的研究中，RNA pull-down結(jié)合蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)FASTK在Lnc-BM的結(jié)合蛋白中顯著富集，我們進(jìn)一步利用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Lnc-BM可以與FASTK蛋白直接結(jié)合，并且調(diào)控FASTK的蛋白水平[6]。siRNA降低Lnc-BM表達(dá)可以下調(diào)FASTK的蛋白表達(dá)水平，相反，過(guò)表達(dá)Lnc-BM可以提高FASTK表達(dá)水平。這些結(jié)果提示，Lnc-BM可能通過(guò)靶向FASTK表達(dá)影響線粒體氧化磷酸化功能。

MT-ND6參與線粒體呼吸鏈電子傳遞和線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的組裝[14]，有研究表明，F(xiàn)ASTK可以調(diào)節(jié)MT-ND6的穩(wěn)定性影響其表達(dá)[9]。白血病干細(xì)胞通過(guò)氧化磷酸化獲得能量，它是導(dǎo)致白血病微小殘留病的主要原因。有研究發(fā)現(xiàn)，在白血病干細(xì)胞中誘導(dǎo)FASTK基因剪切，降低FASTK的蛋白表達(dá)水平，可以抑制下游MTND6的表達(dá)水平，抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的作用，從而阻礙白血病進(jìn)展[15]。但是，F(xiàn)ASTK調(diào)控MT-ND6表達(dá)是否可以影響腫瘤進(jìn)展尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，我們?cè)谖赴┲醒芯苛薒nc-BM是否通過(guò)靶向FASTK改變MT-ND6的表達(dá)，影響線粒體呼吸功能從而調(diào)控胃癌進(jìn)展。我們通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Lnc-BM后MTND6和線粒體標(biāo)志蛋白TOM20表達(dá)升高，降低Lnc-BM表達(dá)后MT-ND6和TOM20蛋白表達(dá)也相應(yīng)下降。Seahorse實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，過(guò)表達(dá)Lnc-BM后細(xì)胞的基礎(chǔ)呼吸值、ATP產(chǎn)生以及最大呼吸值均高于對(duì)照組細(xì)胞，說(shuō)明過(guò)表達(dá)Lnc-BM后胃癌細(xì)胞線粒體呼吸能力增強(qiáng)，氧化磷酸化水平增強(qiáng)；降低Lnc-BM表達(dá)，線粒體呼吸能力也發(fā)生相應(yīng)改變。此外，在Lnc-BM穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中敲低FASTK，發(fā)現(xiàn)線粒體的呼吸能力明顯減弱，氧化磷酸化水平降低。提示Lnc-BM促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移是通過(guò)FASTK增強(qiáng)線粒體呼吸功能，促進(jìn)ATP產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)的。

本研究也存在一些不足之處，Lnc-BM是否可以作為胃癌的標(biāo)志物以及Lnc-BM調(diào)節(jié)FASTK表達(dá)的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。敲低Lnc-BM是否可以對(duì)胃癌臨床腫瘤藥物有協(xié)同增敏作用還有待驗(yàn)證。

綜上所述，本研究證實(shí)了Lnc-BM在胃癌中高表達(dá)，可以與FASTK直接結(jié)合影響其蛋白水平，增加線粒體呼吸鏈復(fù)合體I的關(guān)鍵蛋白MT-ND6表達(dá)，增強(qiáng)線粒體呼吸能力，促進(jìn)ATP產(chǎn)生，促進(jìn)胃癌惡性進(jìn)展。Lnc-BM-FASTK-MT-ND6信號(hào)軸可能成為胃癌診斷的分子標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)，為胃癌的綜合防治提供新策略。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。