李雅雯,張 莉,丁向彬,鄢明華*

(1.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,天津 300384;2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,天津 300381;3.國家動物疫病天津觀測實驗點,天津 300381;4.天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術(shù)工程中心,天津 300381)

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)是一種人畜共患傳染病的重要病原,可感染豬及多種家畜和野生動物[1]。豬感染該病毒以后,臨床表現(xiàn)以母豬懷孕中期流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎等繁殖障礙,哺乳仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和高死亡率等特征。PRV的傳染性強,發(fā)病后常常給豬群造成較為嚴(yán)重的經(jīng)濟損失,我國將其列為三類動物疫病[2]。1948年我國第一次報道豬偽狂犬病,隨后該病在我國大部分地區(qū)呈地方性流行。20世紀(jì)90年代我國引進Bartha-K61基因缺失疫苗并大規(guī)模推廣應(yīng)用后,豬偽狂犬病得到了較好的控制。但在2011年后由于PRV流行毒株的變異使我國再次大暴發(fā),給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[3]。當(dāng)前我國豬偽狂犬病的主要防控方法仍是疫苗免疫接種,關(guān)于豬偽狂犬病變異株疫苗的研究受到廣泛關(guān)注,本文對PRV疫苗的種類和當(dāng)前研究現(xiàn)狀等方面進行了綜述。

1 PRV的基因結(jié)構(gòu)特征

PRV是一種由病毒核心、衣殼、被膜和囊膜組成的雙鏈線DNA病毒[4],屬于皰疹病毒科水痘病毒屬。PRV的基因組由長獨特短區(qū)(UL)、短獨特區(qū)(US)、US兩側(cè)末端反向重復(fù)序列TRS和內(nèi)部重復(fù)序列IRS組成,并包含了約70多個開放閱讀框編碼的多種蛋白[4]。gE、gI、TK是PRV的主要毒力基因, gB、gC、gD是其主要保護性抗原蛋白。研究表明, PRV編碼基因中有一多半是病毒復(fù)制非必需基因,可通過缺失多個或部分非必需基因來降低病毒毒力,同時又能插入外源基因形成重組病毒,因此PRV被認(rèn)為是一種理想的活病毒載體[5]。

2 PRV疫苗研究

2.1 滅活疫苗

20世紀(jì)90年代初分離篩選到PRV鄂A株,但由于該株疫苗的抗原是用 PRV全病毒,無法通過抗體檢測來辨別免疫動物和受野毒感染的動物,因此在市場應(yīng)用中受到較大的限制。直到2012年田克恭團隊篩選出1株P(guān)RV變異毒株HN1201株,利用同源重組技術(shù)構(gòu)建的gE基因缺失疫苗株((HN1201-ΔgE株),可有效地預(yù)防由流行株引起的PRV感染,該缺失株可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體水平較高,能有效地延緩或阻止gE抗體轉(zhuǎn)為陽性阻止排毒,有利于預(yù)防和控制當(dāng)前豬群中流行的豬偽狂犬病[6]。2019年和2021年我國分別批準(zhǔn)了HN1201-ΔgE株和HNX-12株疫苗上市。

PRV滅活疫苗是將培養(yǎng)的PRV進行滅活并加入佐劑乳化制備。其優(yōu)點是安全性好,接種后不會出現(xiàn)排毒現(xiàn)象,但接種滅活疫苗的免疫抗體持續(xù)期較短,通常需要多次接種才能取得較好的免疫效果[7]。由于多次免疫一方面會對動物機體產(chǎn)生更大的應(yīng)激反應(yīng),另一方面會成倍增加工人的勞動強度和生產(chǎn)成本,導(dǎo)致此類疫苗在實際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用受到較大的限制。

2.2 亞單位疫苗

亞單位疫苗是由PRV的保護性抗原基因在原核或真核細(xì)胞中的表達產(chǎn)物制成的疫苗。gB、gC、gD等糖蛋白可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的中和抗體在沒有補體的作用下在動物機體內(nèi)均能抑制PRV,因此gB、gC、gD等糖蛋白成為研制PRV亞單位的首選蛋白[8]。20世紀(jì)90年代左右分別有不同團隊研發(fā)出誘導(dǎo)機體表達中和抗體的亞單位疫苗[8],并可預(yù)防 PRV所致的母豬流產(chǎn)及仔豬死亡。通過對優(yōu)化PRV gD胞外區(qū)密碼子構(gòu)建pCAGGS-PRV-gD真核表達載體并純化重組蛋白,被重組蛋白3次免疫的小鼠機體中產(chǎn)生較高水平的抗體[9],為后續(xù)研發(fā)PRV亞單位疫苗奠下基礎(chǔ)。有研究用PRV SA強毒株擴增出的gB基因與pET-28a載體相連構(gòu)建表達質(zhì)粒,抗原與不同佐劑配比制備的亞單位疫苗,證明gB/0il疫苗免疫保護率可達60%[10]。因亞單位疫苗只表達PRV的部分免疫原蛋白,整個過程不需要接觸活病毒,不會有潛在散毒風(fēng)險,有安全性更好、抗原純度更高、穩(wěn)定性更好以及容易和野毒進行鑒別等特點,在豬偽狂犬病的免疫和凈化中具有良好的應(yīng)用前景。但由于此類疫苗需要更高的抗原含量才能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生足夠的免疫保護,在實際應(yīng)用中生產(chǎn)成本較高,目前均處于研究階段,尚無商品化的疫苗獲批上市銷售。

2.3 弱毒疫苗

2.3.1 自然弱毒疫苗 在20世紀(jì)60年代國外學(xué)者就對PRV弱毒疫苗進行了研究,采取不同的方法制備PRV弱毒株疫苗,這些毒株共同點是通過gE基因的全部或部分缺失來達到使疫苗株毒力減弱的目的[7]。我國直到20世紀(jì)90年代從匈牙利引進自然弱毒株Bartha-K61疫苗株并成功研制疫苗,該疫苗株通過缺失整個gE、部分gI基因和gC部分位點突變來使PRV的毒力降低[11],同時保留了病毒株的免疫原性,并且可通過gE的抗體檢測鑒別PRV的野毒株感染和疫苗株免疫。該疫苗株在注射后第7天可產(chǎn)生抗體,注射后第5周抗體水平達到峰值并可持續(xù)2個月以上。但在2011年后隨著PRV變異,Bartha-K61株疫苗不能提供完全的免疫保護,因此國內(nèi)多個團隊開始對PRV變異株展開研究。

2.3.2 基因工程疫苗 隨著生物技術(shù)的發(fā)展,通過基因工程手段對PRV的某些毒力基因進行定向敲除從而得到毒力較低、免疫原性好且安全的PRV基因工程疫苗成為研究熱點。目前已報道在我國上市的疫苗中有利用基因工程技術(shù)制備出的PRV弱毒疫苗,包括HB-98株、HB-2000株、SA215株等在臨床上都具有較強的免疫原性和安全性。除此之外,我國很多學(xué)者利用同源重組技術(shù)、細(xì)菌人工染色體技術(shù)(BAC)、Cre/lox P位點特異性重組技術(shù)和CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)對PRV的變異株進行研究。

2.3.2.1 基因同源重組技術(shù) 基因同源重組技術(shù)是指在同源基因序列中DNA分子間或分子內(nèi)進行重新組合[12]。20世紀(jì)末就有學(xué)者利用同源重組技術(shù)將PRV Fa株進行基因敲除,構(gòu)建了PRV TK單基因缺失株,被免疫后小鼠可抵抗Fa株強毒的攻擊。2011年后因為PRV變異,有研究分別利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了不同PRV變異株的基因缺失株,分別接種到易感動物體內(nèi),都具有較好的免疫原性和安全性[13]。用PRV變異株(QYY2012株)擴增US3基因作為同源臂構(gòu)建了含EGFP的重組轉(zhuǎn)移載體,轉(zhuǎn)移載體和 PRVΔTK/gE株基因組共轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞,經(jīng)Cre酶去除EGFP后構(gòu)建的PRVΔTK/gE/US3缺失株具有良好的免疫原性,能作為優(yōu)秀的PRV基因工程疫苗侯選毒株[14]。隨著同源重組技術(shù)現(xiàn)發(fā)展逐漸成熟也更加穩(wěn)定,但是病毒重組效率低,重組病毒純化過程比較繁瑣等不足,近年來在人類和動物疫苗的研究中應(yīng)用逐漸減少,呈現(xiàn)被基因編輯等新技術(shù)取代的趨勢。

2.3.2.2 細(xì)菌人工染色體技術(shù) 細(xì)菌人工染色技術(shù)是將PRV的基因組插入到BAC載體中,同時借助人工染色體對基因組進行保存和修飾[13]。PRV在機體內(nèi)病毒復(fù)制比較慢,利用基因同源重組的方法構(gòu)建重組病毒的過程比較復(fù)雜,而且純化的過程也很耗時。而在大腸埃希氏菌中PRV的克隆能以單拷貝數(shù)或極低拷貝數(shù)的質(zhì)粒進行復(fù)制,這種方法不易發(fā)生變異、效率高且更加準(zhǔn)確,可成功制備出重組病毒。有研究分別利用該技術(shù)構(gòu)建了強毒分離株P(guān)RV-ZJ株和重組病毒rvPRVBAC株[13]。利用細(xì)菌人工染色技術(shù)構(gòu)建了HN1201TK-/gE-/gI-株,該毒株接種易感動物體后具有良好的免疫原性和安全性。用酶切技術(shù)對PRV基因組進行線性表達轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)該病毒生長特性與野毒基本一致且能穩(wěn)定遺傳[15]。在構(gòu)建PRVAH02LA株BAC時,用 gE和gI基因位點取代成mini-F基因,成功獲得了PRV AH02LA BAC[16]。但是BAC的構(gòu)建復(fù)雜周期長,大基因組在克隆過程中會出現(xiàn)斷裂,有可能在病毒的基因組中出現(xiàn)細(xì)菌基因組的殘留,影響疫苗的生物安全。

2.3.2.3 Cre/lox P位點特異性重組系統(tǒng) Cre/lox P位點特異性重組技術(shù)來自大腸埃希氏菌噬菌體P1中,其中包含了特異性Cre重組酶和loxP位點[17],該技術(shù)僅適合在特定的基因位點間進行特異性重組,該方法可有效地解決由隨機整合引起的不確定因素,為建立一個穩(wěn)定、高效的基因表達體系打下基礎(chǔ)。利用Cre/lox P系統(tǒng)構(gòu)建了含有單一lox P位點的TK單基因缺失株(rPRV2),結(jié)果表明插入loxP位點對病毒復(fù)制無顯著影響,缺失TK基因后毒力大幅下降[18]。有研究首次利用該技術(shù)構(gòu)建了gE單基因缺失株,再用相同的方法獲得了PRV gE-/TK-株[19]。該雙基因缺失株的半數(shù)致死量顯著高于只缺失gE基因的毒株和野生毒株,且對小鼠有80%的免疫保護率。由此可見Cre/lox P系統(tǒng)能重復(fù)構(gòu)建PRV多基因缺失株,為PRV基因缺失苗和載體疫苗快速檢測或篩選提供了有效技術(shù)手段。

2.3.2.4 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù) CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是通過入侵噬菌體和質(zhì)粒DNA的片段整合到CRISPR中,并利用相應(yīng)的CRISPR RNAs(crRNAs)將同源序列降解,為機體提供免疫能力。與傳統(tǒng)的基因同源重組技術(shù)相比,它可以高效穩(wěn)定的對基因組特定位點進行靶向修飾,提高修飾效率[20]。用CRISPR/Cas9及Cre/lox技術(shù)敲除PRV HNX病毒株的gE、TK基因,免疫保護試驗表明雙基因缺失株有較高的免疫保護能力,能抵抗親本毒株的侵襲[21]。以PRV經(jīng)典疫苗株Bartha-K61為骨架,通過該技術(shù)將gB基因替換為PRV變異株JS-2012的gB基因,獲得重組病毒r PRV-BJB,發(fā)現(xiàn)重組毒株與疫苗株具有相似生長特性和蝕斑形態(tài)[22],能作為新型疫苗的備選株。利用該技術(shù)構(gòu)建不同的PRV基因缺失株均具有較好的免疫保護能力,同時也為野生動物PRV基因工程疫苗的研制建立了一種高效的技術(shù)平臺[23-24]。利用CRISPRE/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建gE、gI、TK三基因缺失株,在免疫保護試驗中三基因缺失株對親本株P(guān)RV HeN1免疫保護率可達到100%,又成功構(gòu)建能同時表達EGFP和Luciferase的雙報告基因的重組病毒[25],可用于篩選sgRNA和抗病毒藥物,證明了CRISPR/Cas9技術(shù)能成為治療PRV的新型治療手段[26]。利用CRISPRE/Cas9技術(shù)快速構(gòu)建1株P(guān)RV單基因缺失株(PRV-1-ΔgE)[27],用CRISPRE/Cas9和Cre/lox P聯(lián)合技術(shù)分別構(gòu)建HNQYY2012ΔgE株[28]與rGXΔTK-/gE-/gI-株[29],被這兩基因缺失株免疫的機體均能抵御親本株入侵。用改造的偶聯(lián)Cas9 D10A的pX335打靶載體,構(gòu)建雙sgRNA和Cas9蛋白共表達的單質(zhì)粒打靶系統(tǒng),并通過兩質(zhì)粒打靶系統(tǒng)構(gòu)建出了PRV SX-10-2015-GM-CSF-eGFP-mCherry-ΔTK-ΔgI/gE重組病毒,該重組病毒具有較高的安全性且對小鼠具有100%免疫保護能力,能誘導(dǎo)小鼠機體產(chǎn)生更強的免疫應(yīng)答能力,可作為疫苗的侯選毒株[4]。

3 總結(jié)

PRV疫苗在豬偽狂犬病的防控和凈化中發(fā)揮了重要的作用。2011年以來,由于PRV流行株的突變,一些傳統(tǒng)疫苗株對PRV變異株的攻擊不能提供完全保護,導(dǎo)致PR在我國許多地區(qū)大規(guī)模流行。迄今,國內(nèi)已有多個團隊以PRV為骨架,應(yīng)用基因工程方法成功構(gòu)建了多種基因缺失的重組PRV毒株,為進一步研制PR疫苗奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)前,研究開發(fā)針對PRV變異株的高效疫苗已經(jīng)成為動保行業(yè)的研究熱點,其中可用于PR免疫和凈化的基因工程標(biāo)記疫苗的研究尤為受到關(guān)注。由于基因編輯技術(shù)展示出免疫原性好且安全的特點,在動物病毒疫苗的研究中得到越來越廣泛地應(yīng)用,并有望在PRV標(biāo)記疫苗和以PRV為骨架的多聯(lián)多價疫苗的研究中取得更多的成果。