付岳林,周瓊瓊,朱慧文,肖啟玲,陳 琦,石德時

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室,湖北武漢 430070)

豬肝羧酸酯酶又稱豬肝酯酶(pig liver esterase,PLE),是由多種同工酶組成的酶家族。PLE獨特的手性水解特性使其在有機化學(xué)合成領(lǐng)域具有不可取代的地位,近1個世紀(jì)以來對PLE的研究主要圍繞其在有機化學(xué)合成應(yīng)用方面開展[1-4]。PLE家族作為哺乳動物中復(fù)雜的羧酸酯酶家族,成員多且理化特性相似,用物理、化學(xué)方法很難分離純化獲得單一成分的同工酶。早期研究發(fā)現(xiàn),PLE具有羧酸酯酶的基本特性,可水解丁酰膽堿、芳香胺等內(nèi)外源性酯類、酰胺類化合物。早在20世紀(jì)60年代,人們就嘗試從豬肝臟中提取天然的PLE,發(fā)現(xiàn)PLE對丁酸甲酯的水解動力學(xué)不符合米氏方程,從而發(fā)現(xiàn)從豬肝臟中提取的PLE是多種同工酶的混合物,且同工酶的水解特性各不相同,再加上不同批次的提取物成分不完全一致,這些因素嚴(yán)重阻礙了對PLE的研究應(yīng)用。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,對PLE編碼區(qū)序列、蛋白空間構(gòu)型及水解活性等有了深入了解,PLE家族成員的全基因序列、基因表達調(diào)控機制、表達譜及品種差異、在豬常用藥物代謝及豬體內(nèi)炎癥反應(yīng)中作用及機制不斷被揭示和闡明。

1 PLE的基因與同工酶分類

PLE同工酶的基因序列及氨基酸差異是研究其功能和水解特性的基礎(chǔ)。PLE家族成員中,γ-PLE是報道最早且研究最多的一種。γ-PLE完整cDNA序列長1 698 bp,編碼566個氨基酸,N-末端有18個氨基酸的信號肽序列,信號肽剪切后得到長548個氨基酸的成熟多肽,活性中心是Ser 204-Glu 336-His 449(去掉信號肽后的位置),周圍環(huán)繞著共有結(jié)構(gòu)域Gly-Glu-Ser-Ala-Gly。在C末端有His-Ala-Glu-Leu的4肽結(jié)構(gòu),與已知羧酸酯酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)潴留信號同源,表明該酶定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔,但PLE成員之一的APLE(alternative pig liver esterase)在畢赤酵母中表達卻定位在細胞周質(zhì)間隙,說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)潴留信號對PLE的細胞定位不是絕對的。

由于在GenBank中PLE基因序列不完整,導(dǎo)致PLE家族基因表達的遺傳結(jié)構(gòu)和調(diào)控機制研究存在困難。結(jié)合榮昌豬BAC文庫和第3代PacBio基因測序,篩選出PLE家族的完整基因序列并進行分析,獲得4個PLE基因的完整序列,即PLE1、PLE-B9、PLE-C4和PLE-G2(accession number:kx577727,kx5777728,kx577729,kx577730),初步揭示了PLE基因結(jié)構(gòu)和家族基因組結(jié)構(gòu)規(guī)律,還闡明了PLE家族基因在染色體上以基因簇的形式存在[5-6]。每個PLE亞型由單個基因編碼,且基因間序列同源性高,表明PLE家族是從單個祖先基因進化而來[5]。PLE的啟動子特征則與其他哺乳動物CES啟動子類似,不含有典型的TATA盒但是含有GC盒,有 2個轉(zhuǎn)錄起始位點分別位于翻譯起始密碼子ATG上游-39 bp和-37 bp處,潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點有 C/ EBP、 Sp1、 USF、 CdxA等[6]。

根據(jù)γ-PLE的cDNA序列(GenBank:X63323)設(shè)計引物,得到包含γ-PLE在內(nèi)的6種同工酶,并將γ-PLE更名為PLE1,其他5種同工酶分別命名為PLE2～PLE6,上述各種亞型PLE的cDNA序列高度同源,以PLE1為參照,各亞型分別與之有3～24個氨基酸的差異,這些差異氨基酸分布在5個固定的區(qū)段[7]。對豬肝組織PLE的ORF序列進行克隆,根據(jù)25個可變位點按氨基酸類型,對PLE亞型進行分類,在豬肝中發(fā)現(xiàn)108種PLE同工酶,除去已經(jīng)報道的5種同工酶外,有103種同工酶是新發(fā)現(xiàn)的同工酶,顯示出了PLE家族的復(fù)雜性;同時發(fā)現(xiàn)PLE的表達水平存在年齡、品種以及組織差異[8]。這些差異的存在,對豬在物質(zhì)代謝、疾病發(fā)生等生理的影響還無相關(guān)報道,需進一步研究。

2 PLE的空間結(jié)構(gòu)

生理狀態(tài)下豬肝羧酸酯酶多以三聚體的形式存在,分子質(zhì)量約175 ku。通過二維等電聚焦電泳得出組成三聚體的亞單位有3種,根據(jù)亞單位的分子質(zhì)量和等電點差異分別命名為α、β、γ,通過十二烷基硫酸鈉電泳分離,結(jié)果顯示α、γ亞基豐度高,β亞基豐度低。以免疫球蛋白重鏈(H)和牛血清白蛋白(BSA)分子質(zhì)量為參照,α、β、γ亞基的分子質(zhì)量分別為58.2、59.7、61.4 ku,等電點分別為5.8、5.2、4.7,通過氨基酸比對分析,顯示α比γ亞單位含有較多的天冬氨酸和精氨酸,研究表明PLE主要以γγγ、αγγ、ααγ、ααα三聚體形式存在[5]。

PLE成熟多肽有5個半胱氨酸殘基,分別處于70、71、99、256和267位,可以形成二硫鍵用來維持催化中心的空間結(jié)構(gòu);一個潛在的糖基化位點(Asn-Xxx-Ser/Thr)在62-64位,其糖基化程度可能與酶的活性有一定相關(guān)。催化部位肽段為“-X-Cys-Pro-Thr-Ser-Asn-X”,可以幫助PLE酶活性中心形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。參照人羧酸酯酶晶體結(jié)構(gòu),通過同源建模對PLE1的空間結(jié)構(gòu)進行分析,繪制PLE 1三聚體和單體的結(jié)構(gòu)模型,發(fā)現(xiàn)PLE1的空間結(jié)構(gòu)由α、β、γ亞單位組成,相鄰單體殘基通過范德瓦爾斯力結(jié)合[9]。關(guān)于PLE理化性質(zhì)與空間結(jié)構(gòu)研究可關(guān)注以下兩個方面:一是進一步探究 PLE 蛋白空間結(jié)構(gòu),分析 PLE-藥物分子復(fù)合物模型,從而在 PLE 的活性位點或入口通道引入靶向突變,或可將其轉(zhuǎn)化為一種更具選擇性、催化效率更高的同工酶,進一步提高臨床使用效率;二是詳細探究 PLE 空間結(jié)構(gòu)中每個結(jié)構(gòu)域的功能,以期為闡明PLE 在生物體內(nèi)藥物代謝等生理生化過程中的作用機制提供更多信息。

3 PLE的催化水解特性

酶的水解活性及底物特異性由酶的一級結(jié)構(gòu)和蛋白空間結(jié)構(gòu)決定,不同亞型PLE的水解特異性取決于兩個關(guān)鍵結(jié)構(gòu):一是Ser 204、Glu 336、His 449組成的催化三聯(lián)體,二是72-87位氨基酸組成的底物通過的螺旋通道。不同PLE亞型的螺旋通道結(jié)構(gòu)存在差異。水解過程中,底物需經(jīng)過螺旋通道,才能進入催化三聯(lián)體而被水解?，F(xiàn)在認(rèn)為PLE同工酶之間的底物特異性差異,可能由螺旋通道結(jié)構(gòu)不同所致,并不是由催化三聯(lián)體決定[10]。另外,PLE 1對三丁酸甘油酯、辛酸乙酯和乙酸甲酯的水解活性依次下降,提示PLE的水解活性與底物的某特定基團(如醇基或?；拇笮?有密切關(guān)聯(lián)。

PLE各亞型之間的氨基酸對同一底物的水解活力差異不同。如APLE與PLE1有21個氨基酸的差異,但是對苯甲酰甘氨酰法尼基半胱氨酸甲酯(benzoyl-glycyl-farnesyl-cysteine methyl ester,BzGFCM)的水解活力幾乎相同,而PLE3與PLE4、PLE1有20個氨基酸的差異,對BzGFCM的水解活力卻分別提高了7倍和9倍,說明了不同位置氨基酸對PLE水解活力的影響大小不等,通過比較發(fā)現(xiàn)PLE第285位氨基酸對PLE水解BzGFCM的活力影響較大[9]。通過對已報道的PLE亞型研究發(fā)現(xiàn),所有的亞型均存在相同的活性中心(Ser 204-Glu 336-His 449),但即便是氨基酸序列差異極小的PLE同工酶對同一底物(如p-NPA、2-AG)的水解活力也會相差甚遠[10-11],表明酶活力的高低并不完全由活性中心決定,關(guān)鍵位點的氨基酸類型可能也是影響PLE酶活力的重要因素。此外,PLE水解底物有高度的立體選擇性,PLE水解立體選擇性的差異可能與酶的螺旋通道結(jié)構(gòu)密切相關(guān),研究PLE各亞型的對映選擇性,可以為其作為生物催化劑在有機化學(xué)合成領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

4 PLE的功能

4.1 PLE與藥物代謝

PLE可高效水解多種酯類和酰胺類化合物釋放出相應(yīng)的自由酸,在藥物的水解代謝中也發(fā)揮重要作用,如PLE催化1-甲基-1-環(huán)丙烷基甲基(CM)水解,產(chǎn)物可作為組蛋白脫乙酰酶(HDACs)抑制劑,并作為治療癌癥和神經(jīng)退行性疾病等疾病的候選藥物,PLE也可以催化消旋 l,2-雙甲氧羰基-4-氧環(huán)戊烷水解生成 R,R-二酯,產(chǎn)物可以用于抑制HIV[12-13]。由于 PLE 具有高效水解活性,結(jié)合人羧酸酯酶可以通過水解功能調(diào)控藥物在體內(nèi)的療效及毒副作用的啟發(fā),有理由推測,與其他CES 同工酶一樣,PLE 的表達水平及水解活性與獸藥在體內(nèi)的療效和代謝密切相關(guān)。如PLE能夠有效的水解β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物阿莫西林(AMO)和氨芐西林(AMP),水解發(fā)生在β-內(nèi)酰胺鍵處,明顯降低甚至消除了其抗菌活性[14]。根據(jù)研究可以推測,耐藥性的產(chǎn)生可能也與宿主體內(nèi)藥物代謝酶的表達水平、組織分布及水解活性密切相關(guān),即耐藥性的產(chǎn)生是由細菌和宿主雙方共同決定的。以上研究結(jié)果提示 PLE 在機體各組織的表達水平及水解活性可能是影響藥物治療效果和代謝過程的重要因素,故在制定某些藥物的用藥方案時,應(yīng)充分考慮PLE在體內(nèi)的表達豐度與活性。

PLE對許多人類臨床常用藥物也具有顯著的水解作用。有研究比較了BNPP對人CES1、 PLE和其他哺乳動物羧酸酯酶對氯吡格雷的水解影響,發(fā)現(xiàn)BNPP可以有效抑制包括PLE在內(nèi)的羧酸酯酶對氯吡格雷的水解[15];PLE可以顯著加速阿昔洛韋及其三環(huán)衍生物(6(4-MeOPh)-TACV及其酯)的水解[16];PLE可高效催化外消旋疊氮乙酸酯,產(chǎn)物可為治療牙齦疾病提供獨特的療法[17];用PLE探究新型鎮(zhèn)痛藥瑞芬太尼的降解動力學(xué),發(fā)現(xiàn)PLE可加速瑞芬太尼的降解,并且當(dāng)PLE存在時,瑞芬太尼的體外半衰期隨溫度的升高而縮短[18]。PLE具有強大水解功能,可運用到人類臨床中藥物的設(shè)計與研發(fā)中,如瑞芬太尼是重癥監(jiān)護病房常用的鎮(zhèn)痛藥,危重病人體溫波動較大,因此在日常工作中應(yīng)特別注意溫度對藥代動力學(xué)的影響。同時在選擇動物模型進行藥物代謝研究時,應(yīng)充分考慮到動物體內(nèi)羧酸酯酶對藥物代謝的影響,以便提供更加科學(xué)準(zhǔn)確的臨床數(shù)據(jù)。

通過研究PLE和RLE對UTL-5g(一種TNF-α的小分子抑制劑)的水解發(fā)現(xiàn),PLE對肽鍵也具有水解功能[19],關(guān)于PLE是否能水解肽類物質(zhì)仍有待進一步研究。

4.2 PLE與炎癥反應(yīng)

炎癥是機體組織對損傷性刺激的一種防御性反應(yīng),炎癥反應(yīng)的程度取決于促炎介質(zhì)和抗炎介質(zhì)是否均衡,對大多數(shù)的病原或刺激引發(fā)的炎癥反應(yīng),機體自身可以通過炎癥產(chǎn)物的負(fù)反饋作用完成炎癥平復(fù)[20]。CES與機體炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系,可作為大麻素降解酶介入內(nèi)源性大麻素實現(xiàn)對機體炎癥的調(diào)控,PLE作為CES家族成員之一同樣具有調(diào)控機體炎癥的作用。

內(nèi)源性大麻素參與炎癥、疼痛、認(rèn)知等一系列生理活動[21],主要包括花生四烯酸乙醇胺(anandamide,AEA)、2-花生四烯酸甘油(2-arachidonoylglycerol,2-AG),大麻素與受體CB2等結(jié)合啟動的抑炎連鎖反應(yīng),是機體實現(xiàn)炎癥穩(wěn)態(tài)的主要機制之一[22]。經(jīng)典大麻素降解酶——?；视王ッ?monoacylglycerol lipase,MAGL)和脂肪酸酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase,FAAH),可以水解大麻素而上調(diào)炎癥水平[20],而Brittany 等發(fā)現(xiàn)小鼠羧酸酯酶可降解2-AG,其活性甚至超過了經(jīng)典大麻素降解酶[23];人羧酸酯酶水解 2-AG 的活性與經(jīng)典大麻素酶的活性相當(dāng)[24];PLE可高活力水解2-AG、AEA[25]。PLE通過水解內(nèi)源性大麻素及其氧化代謝產(chǎn)物前列腺素脂類,生成促炎介質(zhì)花生四烯酸和前列腺素類,從而發(fā)揮顯著促炎作用[26],且不同亞型PLE水解2-AG的活力存在巨大差異[10],提示不同的PLE亞型在炎癥反應(yīng)中的貢獻存在差異;而通過降低PLE的表達或抑制其活性可以降低機體的炎癥反應(yīng);同時研究發(fā)現(xiàn)PLE在豬原代肺泡巨噬細胞對2-AG的水解比例顯著高于經(jīng)典大麻素降解酶MAGL,表明PLE是2-AG水解的限速酶,在體內(nèi)炎癥反應(yīng)中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用,因此PLE可成為治療豬炎癥性疾病的新靶標(biāo),PLE作為大麻素降解酶調(diào)節(jié)機體炎癥的機制,為研究并解決炎癥相關(guān)疾病提供新的角度與視野,為治療人類炎癥性疾病的藥物開發(fā)提供參考。LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可降低組織中PLE的表達水平及對p-NPA和2-AG的水解活性[25,27],提示 PLE很可能是機體炎癥負(fù)反饋的關(guān)鍵靶標(biāo),PLE的調(diào)控很可能是機體維持炎癥穩(wěn)態(tài)的重要機制之一。

4.3 PLE與癌癥

PLE可對異戊烯基蛋白去甲基化,該蛋白的去甲基化對其將某些重要功能蛋白錨定在質(zhì)膜上是必不可少的,PLE通過這種方式,影響細胞的增殖、分化、信號傳導(dǎo)及凋亡[9]。聚異戊二烯基甲基化蛋白甲基酯酶(PMPMEase)也具有與PLE一樣的去甲基化功能,后經(jīng)蛋白組學(xué)比對和Mascot數(shù)據(jù)庫檢索證實,豬肝中的PMPMEase和PLE是同一種物質(zhì)。

PMPMEase可靶向聚異戊二烯化途徑可逆步驟中水解PPMTase(一種聚異戊二烯化依賴性酯酶)的酯產(chǎn)物,具有選擇性水解聚異戊二烯化底物的獨特能力[28]。PMPMEase活性對于聚異戊二烯化蛋白的代謝、活性和功能是重要的,最近已經(jīng)在PMPMEase siRNA對RhoA甲基化狀態(tài)、激活及其對F-肌動蛋白和細胞形態(tài)學(xué)的影響的研究中得到證實[29]。此外PMPMEase在癌癥和退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,用多不飽和脂肪酸(PUFAs)抑制PMPMEase會導(dǎo)致癌細胞死亡[28],提示PMPMEase活性在癌癥中可能增加;PMPMEase在胰腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌細胞中的酶活性和蛋白表達升高,抑制PMPMEase活性可誘導(dǎo)癌細胞凋亡,并且抑制后也改變了癌癥相關(guān)基因的表達[30];PMPMEase作為雄激素不敏感性前列腺癌的新藥物靶點的潛在作用已被確定[31]。使PMPMEase成為一種合適的生物標(biāo)志物,可用于部分癌癥的早期/伴隨診斷。開發(fā)出有效和特異性的PMPMEase抑制劑,并且靶向該酶進行特異性抑制或可成為臨床治療癌癥的有效且新穎的策略。

5 結(jié)語

國內(nèi)外對PLE家族的研究重點主要是圍繞PLE的基因克隆、結(jié)構(gòu)分析、功能性表達和手性水解特性展開,對PLE在體內(nèi)藥物代謝、營養(yǎng)物質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等藥理生理功能方面相應(yīng)的研究報道還是相對較少。但對于還有哪些PLE同工酶存在,同工酶各自的基因序列及表達產(chǎn)物的水解特點,對內(nèi)外源性物質(zhì)特別是藥物的水解機制和代謝貢獻、不同品種豬同工酶豐度及酶活性的差異、表達調(diào)控機制、表達譜等,正在被逐漸揭示或闡明?；谶m者生存、優(yōu)勝劣汰的進化原則,PLE龐大的家族被保留于動物體內(nèi),并且在組織器官內(nèi)廣泛分布,提示其在機體中必定具有重要的生物學(xué)作用及意義,目前研究所展示出的其在內(nèi)外源性化合物的水解、調(diào)控機體炎癥水平等方面的作用仍只是冰山一角,其強大功能與巨大潛力,值得進一步深入探索與研究。