陳夢雅 謝賽陽 鄧偉

【摘要】目的?探究泛素特異性蛋白酶7（USP7）抑制劑FT671在血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的H9C2細胞肥大中的作用和潛在機制。方法?將H9C2細胞隨機分為四組：對照組、FT671組、AngⅡ組、FT671+AngⅡ組。利用α-actinin細胞免疫熒光染色檢測心肌細胞表面積；western blot檢測心房鈉尿肽（ANP）、腦鈉肽（BNP），B細胞淋巴瘤2（BCL-2）、B細胞淋巴瘤2相關(guān)蛋白X（Bax）、白細胞介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）以及NADPH氧化酶4（Nox4）的蛋白表達水平；RT-PCR檢測 ANP、BNP、肌球蛋白重鏈（β-MHC）、IL-6、MCP-1、TNF-α的mRNA表達；TUNEL染色檢測細胞凋亡情況，細胞計數(shù)試劑盒8（CCK8）實驗檢測各組細胞活力，活性氧（ROS）染色檢測細胞內(nèi)氧化損傷水平。結(jié)果?與對照組相比，AngⅡ組USP7蛋白表達明顯增加，而使用FT671后，USP7表達明顯被抑制。與AngⅡ組相比，F(xiàn)T671+AngⅡ組心肌細胞面積減小；ANP、BNP、Bax的蛋白表達減少，ANP、BNP、β-MHC、Bax、IL-6、MCP-1以及TNF-α的mRNA表達減少；BCL-2的蛋白和mRNA表達均增加。與AngⅡ組相比，F(xiàn)T671+AngⅡ組TUNEL陽性細胞明顯減少，心肌細胞活力增強， ROS生成減少，Nox4、NLRP3蛋白表達減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論?FT671通過抑制Nox4/ROS/NLRP3炎性通路減輕AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞中的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，從而減輕心肌細胞肥大。

【關(guān)鍵詞】泛素特異性蛋白酶7；血管緊張素Ⅱ；FT671；心肌肥厚；氧化應(yīng)激

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.02.000

Inhibition of Ubiquitin-Specific Protease 7 Improves AngiotensinⅡ-Induced Cardiomyocyte Hypertrophy

CHEN Mengya，XIE Saiyang，DENG Wei

（Department of Cardiology，Renmin Hospital?of Wuhan University，Hubei Key Laboratory of Metabolic and Chronic Diseases，Wuhan?430060，Hubei，China）

【Abstract】Objective?To investigate the effect and mechanism of ubiquitin-specific protease 7（USP7） inhibitor FT671 in cardiomyocyte hypertrophy induced by angiotensinⅡ（AngⅡ）. Methods?H9C2?cardiomyocytes were randomly divided into four groups：?control group，F(xiàn)T671 group，AngⅡ?group，F(xiàn)T671+AngⅡ?group. The surface area of cardiomyocytes?was detected by immunofluorescence staining of α-actinin. The protein expression of?atrial natriuretic peptide （ANP），brain natriuretic peptide （BNP），B-cell lymphoma-2 （BCL-2），B-cell lymphoma-2-associated X protein （Bax），interleukin-6 （IL-6），monocyte chemoattractant protein-1 （MCP-1），tumor necrosis factor-α （TNF-α），nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 （NLRP3） and reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase?4?（Nox4） were detected by western blot. The mRNA levels of ANP，BNP，β-myosin heavy chain （β-MHC），IL-6，MCP-1，TNF-α?were detected by Real-Time PCR. TUNEL staining was used to evaluate cell apoptosis. Cell Counting Kit-8（CCK8）?was used to detect cell viability. The fluorescent probe 2'，7'-dichlorofluorescein diacetate （DCFH-DA） was used to measure intracellular reactive oxygen species （ROS） formation. Results There was a significant increase in USP7 protein expression in the AngⅡ?group，which was evidently inhibited by the USP7 inhibitor FT671. Compared with AngⅡ?group，cardiomyocyte?surface area was significantly?reduced in FT671+AngⅡ group; the protein expression of ANP，BNP and?Bax，as well as?mRNA level of ANP，BNP，β-MHC，Bax，IL-6，MCP-1，TNF-α，were decreased?in FT671+AngⅡ?group. In addition，the protein expression and mRNA level of BCL-2 were increased in FT671+AngⅡ group. Additionally，compared with AngⅡ?group，TUNEL positive cells was significantly reduced，cell viability was improved and ROS generation was inhibited in FT671+AngⅡ group. Further studies showed the protein expression of NLRP3 and Nox4?was decreased after FT671 treatment in AngⅡ?induced cardiomyocyte hypertrophy.?Conclusion The USP7 inhibitor FT671 attenuated oxidative stress and inflammatory response in AngⅡ-induced cardiomyocyte by inhibiting the Nox4/ROS/NLRP3 inflammatory pathway，thereby reducing cardiomyocyte hypertrophy.

【Keywords】Ubiquitin-specific protease 7；AngiotensinⅡ；FT671；Hypertrophy；Oxidative stress

心力衰竭是各種心臟疾病發(fā)展的終末階段，以心肌肥厚和纖維化為特征的心肌重構(gòu)已被確定為心力衰竭病程進展中的決定性因素[1]。生理性心肌肥厚在刺激消失后可以逆轉(zhuǎn)，而心肌梗死、高血壓等長期慢性刺激導(dǎo)致的病理性心肌肥厚往往會導(dǎo)致心肌重構(gòu)，產(chǎn)生不良后果，如心律失常、心力衰竭等[2]。心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機制比較復(fù)雜，至今尚未完全闡明。因此，探討心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機制，從而尋找更有效的作用靶點，抑制甚至逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)的發(fā)生是針對心力衰竭的重要策略。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，通過對底物蛋白的泛素化降解，參與包括細胞周期調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)、細胞受體功能及腫瘤生長等在內(nèi)的多種細胞活動[3]。去泛素化酶（deubiquitinating enzyme，DUB）家族可將泛素分子從泛素化標記的蛋白質(zhì)或者前體蛋白上水解下來，起到去泛素化的作用，對蛋白降解進行反向調(diào)節(jié)[4-5]。既往研究[6-8]顯示，DUB在心肌肥厚、心肌梗死、心房顫動等心血管疾病中起著至關(guān)重要的作用。泛素特異性蛋白酶7（ubiquitin-specific protease 7，USP7）是第一個被發(fā)現(xiàn)的DUB，主要位于細胞核中，參與細胞增殖、DNA損傷反應(yīng)、腫瘤發(fā)生、炎癥和細胞凋亡等過程[9-10]，在神經(jīng)退行性疾病和癌癥中被廣泛研究，USP7的抑制劑也常作為抗腫瘤藥物被廣泛研究[11-12]，但是在心血管系統(tǒng)疾病中研究較少。最近研究[13]發(fā)現(xiàn)USP7在心肌細胞缺氧條件下的表達顯著增加，可能參與心肌梗死和心肌缺血再灌注損傷過程。然而，關(guān)于USP7在心肌肥厚中的作用和分子機制知之甚少。在本研究中，應(yīng)用USP7特異性抑制劑FT671干預(yù)血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）誘導(dǎo)的H9C2心肌細胞肥大，探討USP7在心肌細胞病理性肥大中的作用和作用機制。

1??材料和方法

1.1??實驗材料

試劑：H9C2心肌細胞購自中國科學(xué)院細胞庫（上海，中國）。FT671（HY-107985）?購自美國MedChemexpress（MCE）公司，AngⅡ（美國Sig-maAldrich公司），胎牛血清和F12培養(yǎng)液（美國Gibco公司），USP7抗體（ABclonal，A3448），α-actinin、心房鈉尿肽（ANP）、腦尿鈉肽（BNP），B細胞淋巴瘤2（BCL-2）、B細胞淋巴瘤2相關(guān)蛋白X（Bax）抗體（美國abcam公司），核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3），羊抗兔二抗（美國Cell Signaling Technology公司），NADPH氧化酶4（Nox4）（Proteintech）。TUNEL染色試劑盒，細胞計數(shù)試劑盒8（CCK8）試劑盒，活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（Beyotime Biotechnology）。Trizol（Invitrogen），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（瑞士Roche公司），Radioimmunoprecipitation Assay Buffer（RIPA）裂解液（美國賽默飛世爾公司）。

儀器：凝膠電泳系統(tǒng)（北京六一儀器廠），凝膠電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（BIO-RAD），聚偏二氟乙烯膜（美國Milipore），化學(xué)發(fā)光蛋白檢測顯影儀（美國Borad），熒光顯微鏡（OLYMPUS DX51），SYBRGreen I Master（瑞士Roche公司，4707516001），LightCycler480 SYBRGreen熒光定量儀（瑞士Roche公司，型號：LC480），酶標儀（美國伯騰儀器有限公司，Synergy HT）。

1.2??方法

1.2.1??細胞培養(yǎng)與分組

使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37?°C、95%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H9C2心肌細胞，待細胞貼壁之后長至90%密度左右，用0.25% 胰蛋白酶消化傳代，待細胞長至培養(yǎng)皿面積的70%～80%時，進行以下實驗：

將H9C2心肌細胞隨機分為4組（n=6）：空白對照組，F(xiàn)T671（10 μmol/L）組，AngⅡ（1 μmol/L）組，F(xiàn)T671（10 μmol/L）+?AngⅡ（1 μmol/L）組。待細胞長至培養(yǎng)皿面積的70%～80%，換液之后根據(jù)分組加入生理鹽水或AngⅡ和/或FT671，培養(yǎng)24?h之后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2??細胞免疫熒光檢測細胞面積

采用細胞爬片，用4%多聚甲醛固定細胞，0.2%Triton-X-100通透細胞，10% 羊血清室溫孵育60?min進行封閉。α-actinin一抗（1﹕200）4?°C 孵育過夜，綠色熒光標記的二抗（1﹕100）濕盒中37?°C 孵育60?min。滴加封片劑封片，放置10?min左右后，在熒光顯微鏡下觀察、拍照，并使用Image J軟件分析，計算各組心肌細胞肥大面積。

1.2.3??免疫印跡法western blot檢測目的蛋白表達

提取各組心肌細胞蛋白，采用BCA法進行定量，制備上樣蛋白，使用10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂牛奶封閉1?h后，孵育一抗置于4?°C過夜。用Tris緩沖液加Tween 20液洗膜3次后，二抗室溫孵育1?h，使用化學(xué)發(fā)光后成像系統(tǒng)進行圖像采集，Image J軟件對蛋白表達水平進行定量，β-tubulin作為內(nèi)參蛋白。

1.2.4??實時定量PT-PCR法檢測目的基因mRNA表達

按照 Trizol （Invitrogen）法提取細胞總mRNA，紫外分光光度計檢測RNA含量及純度。每個樣本取2?μg總mRNA，使用Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒（20?μL反應(yīng)體系）反轉(zhuǎn)錄，之后進行PCR擴增，以GAPDH作為內(nèi)參基因，計算各組相較于對照組的相對表達量，計算公式為2-ΔΔCt（表1）。

1.2.5??TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡

處理后的細胞用4%多聚甲醛固定細胞30?min，0.2%Triton-X-100通透細胞，每組加50?μL TUNEL檢測液，37?℃避光孵育60?min。滴加含有DAPI的封片劑封片，放置10?min左右后，在熒光顯微鏡下觀察、拍照，并使用Image?J軟件分析，計算各組每個視野TUNEL陽性細胞占總細胞的比率即凋亡率。

1.2.6??CCK8檢測心肌細胞活性

使用CCK8試劑盒檢測細胞活性。于96 孔板中每孔加入100?μL（約4?000個細胞）H9C2細胞懸液，置于37?℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12?h，待細胞貼壁后根據(jù)分組進行處理，培養(yǎng)24?h后每孔加入10?μL CCK8試劑，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2?h。用酶標儀檢測，分別于450?nm波長處測定光密度（optical density，OD）值，計算細胞活性。實驗結(jié)果以細胞存活率表示，細胞存活率=（實驗組OD值－空白對照組OD 值）/（對照組OD 值－空白對照組OD值）× 100%。

1.2.7??ROS實驗檢測氧化損傷

使用熒光探針DCFH-DA測量細胞內(nèi)ROS的形成。用10 μmol/L DCFH-DA處理細胞爬片并置于37?℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20?min，用無血清培養(yǎng)液洗滌三次。用倒置顯微鏡記錄心肌細胞中ROS的熒光，并用Image J軟件進行分析。

1.3??統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用Graph Pad Prism 9.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，Image J軟件分析條帶灰度值，Adobe Illustrator軟件進行圖形繪制。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間比較采用成對t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??FT671作用驗證及對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大面積的影響

western blot檢測顯示AngⅡ刺激的心肌細胞中USP7蛋白表達明顯增加，在應(yīng)用USP7抑制劑FT671后，F(xiàn)T671組和FT671+AngⅡ組USP7表達明顯減少（圖1A、B）。對不同組H9C2細胞進行α-actinin免疫熒光染色后，與空白對照組比，AngⅡ組和FT671+AngⅡ組心肌細胞面積增加，而相比于AngⅡ組，應(yīng)用FT671后心肌細胞面積明顯減少（圖1C、D），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

注：A、B為western blot檢測H9C2心肌細胞內(nèi)USP7蛋白表達的電泳圖及蛋白相對定量（n=6）；C、D為心肌細胞α-actinin免疫熒光圖及熒光定量（n=3），倍數(shù)400。ns表示兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；****表示P<0.000?1。

圖1?FT671作用驗證及對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大面積的影響

2.2??FT671對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大分子標志物的影響

應(yīng)用western blot檢測各組心肌細胞ANP、BNP的蛋白表達變化，real time-PCR檢測各組心肌細胞ANP、BNP、β-MHC的mRNA表達變化。結(jié)果顯示，AngⅡ干預(yù)組H9C2心肌細胞ANP、BNP蛋白（圖2A、B、C）以及ANP、BNP、β-MHC的mRNA（圖2D、E、F）的表達較對照組明顯增高（P<0.05），而FT671能降低AngⅡ誘導(dǎo)的ANP、BNP、β-MHC的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

注：A、B、C為western blot檢測H9C2心肌細胞內(nèi)ANP、BNP蛋白表達以及蛋白定量（n=6）；D、E、F為real time-PCR檢測心肌細胞ANP、BNP、β-MHC的mRNA表達變化（n=6）。ns表示兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；****表示P<0.000?1，***表示P<0.001，**表示P<0.01。

圖2 FT671對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大分子標志物的影響

2.3??FT671對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡指標的影響

應(yīng)用western blot檢測各組心肌細胞BCL-2和Bax的蛋白表達變化，結(jié)果顯示，與空白對照組比，AngⅡ組心肌細胞Bax表達增加，BCL-2表達降低，而相比于AngⅡ組，F(xiàn)T671+AngⅡ組心肌細胞Bax下調(diào)，BCL-2表達上調(diào)（圖3A、B、C），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。TUNEL染色顯示相比于AngⅡ組，F(xiàn)T671組TUNEL陽性細胞數(shù)明顯減少，心肌細胞凋亡率下降（圖3D、E），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。應(yīng)用CCK8法檢測各組心肌細胞活性的變化，與空白對照組相比，F(xiàn)T671對H9C2心肌細胞活性的影響無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；而相比于AngⅡ組，F(xiàn)T671能明顯提高AngⅡ刺激后的細胞存活率（圖3F），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

注：A、B、C為western blot檢測H9C2心肌細胞內(nèi)Bax、BCL-2蛋白表達以及蛋白定量（n=6）；D、E為TUNEL染色檢測TUNEL陽性凋亡細胞以及凋亡率（n=6），倍數(shù)200。F為CCK8法檢測心肌細胞活性（n=6）。 ns表示兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；****表示P<0.0001；**表示P<0.01。

圖3?FT671對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡指標的影響

2.4??FT671對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大的作用機制

既往研究表明，AngⅡ促進心肌細胞內(nèi)ROS生成是其誘導(dǎo)心肌肥大的重要機制，因此筆者檢測了FT671對AngⅡ刺激的細胞內(nèi)ROS生成的影響，發(fā)現(xiàn) AngⅡ干預(yù)組ROS水平較對照組明顯升高，F(xiàn)T671干預(yù)可以明顯降低AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生（P<0.05）（圖4A）。另外，筆者檢測了炎癥通路分子NLRP3[14]和ROS生成相關(guān)的關(guān)鍵酶Nox4[15]的蛋白表達水平。結(jié)果顯示，相比于AngⅡ組，F(xiàn)T671可以降低心肌細胞內(nèi)NLRP3和Nox4的蛋白表達水平（圖4B、C、D）。real time-PCR檢測顯示FT671干預(yù)可以降低AngⅡ誘導(dǎo)的IL-6、MCP-1、TNF-α炎性因子的表達（圖4E、F、G）。這些實驗表明FT671通過抑制ROS介導(dǎo)的Nox4/NLRP3炎癥通路改善AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大。

注：A為ROS染色檢測心肌細胞內(nèi)ROS含量（n=6），倍數(shù)200；B、C、D為western blot檢測心肌細胞內(nèi)Nox4、NLRP3蛋白表達及蛋白定量（n=6）；E、F、G為real time-PCR檢測心肌細胞IL-6、MCP-1、TNF-α的mRNA表達變化（n=6）；?ns表示兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；****表示P<0.000?1；***表示P<0.001；**表示P<0.01。

圖4?FT671對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大的作用機制

3??討論

在本研究中，證明了USP7抑制劑FT671在調(diào)節(jié)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大中起著重要作用。本研究利用USP7抑制劑FT671從形態(tài)學(xué)和分子標志物兩方面進行了驗證，發(fā)現(xiàn)USP7在AngⅡ刺激后的心肌細胞中表達顯著增加。FT671抑制USP7顯著減輕了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞內(nèi)肥大、凋亡、炎性反應(yīng)和ROS的產(chǎn)生。機制上，F(xiàn)T671可能是通過抑制Nox4相關(guān)的氧化應(yīng)激和NLRP3炎性小體的活化，改善心肌細胞肥大?？偟膩碚f，本研究發(fā)現(xiàn)USP7參與AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大過程，并提示抑制USP7可能是治療心肌肥厚的一種潛在新靶點。

泛素化和去泛素化過程是一個動態(tài)過程，調(diào)節(jié)特定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。USP7是一種DUB，通過催化泛素分子與底物之間酰胺鍵的水解將泛素分子從標記蛋白上水解下來，阻止目標蛋白被降解，從而調(diào)節(jié)細胞生理過程[16]。已知USP7可以調(diào)節(jié)MDM2/p53[17-18]、磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）[19]、NLRP3[20]等靶蛋白的降解，在病毒復(fù)制、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA損傷修復(fù)、表觀遺傳調(diào)控和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[21]。近年來，USP7在心血管領(lǐng)域的研究逐漸增多，既往研究發(fā)現(xiàn)，USP7在缺血再灌注損傷小鼠模型中可促進心肌細胞炎癥和凋亡[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ刺激的心肌細胞中USP7表達增加（圖1），表明 USP7 可能參與AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大過程。AngⅡ刺激后心肌細胞表面積明顯增加，肥厚標志物ANP、BNP、β-MHC表達增加，而FT671可緩解上述肥厚基因的表達（圖1、2）。這表明靶向抑制USP7可能有助于減輕AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚。之前的研究[22-24]已經(jīng)證實，凋亡，炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激在心肌梗死后心肌重構(gòu)中起著關(guān)鍵作用。因此筆者檢測并發(fā)現(xiàn)應(yīng)用FT671后AngⅡ刺激的心肌細胞中促凋亡因子Bax的增加減少，而抗凋亡因子BCL2表達明顯增加。除此之外，CCK8和TUNEL染色的結(jié)果也證明應(yīng)用FT671可以改善心肌細胞的存活率，減少細胞凋亡（圖3）。這些結(jié)果提示USP7參與調(diào)節(jié)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡過程。ROS生成過多會加劇心肌細胞內(nèi)的氧化損傷，推動心肌細胞損傷和凋亡進程[25]。Nox4是催化ROS生成的關(guān)鍵酶，下調(diào)Nox4的水平可以減少ROS的產(chǎn)生，減輕心肌細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，改善心肌肥大[26]。本研究顯示FT671的使用降低了Ang Ⅱ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，這體現(xiàn)在其抑制ROS產(chǎn)生和Nox4的表達上（圖4）。更進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T671抑制USP7后下調(diào)了NLRP3水平，減少了炎性因子IL-6、MCP-1、TNF-α的表達（圖4），這可能與NLRP3炎性小體受抑制有關(guān)系。

USP7在小鼠心肌缺血再灌注損傷過程中表達增加，抑制USP7表達可抑制氧自由基的生成和心肌細胞凋亡，減輕心肌組織損傷，改善心功能[27]。本研究證實抑制USP7可以減輕AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞內(nèi)的凋亡和炎性反應(yīng)，降低ROS的生成。Liu等[20]發(fā)現(xiàn)USP7可以靶向并去泛素化Nox4，從而導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加。本研究也證實了抑制USP7可以降低AngⅡ誘導(dǎo)的Nox4水平。另外。有研究[28]證明USP7可以調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體的泛素化狀態(tài)。本研究也發(fā)現(xiàn)抑制USP7可以下調(diào)心肌細胞中NLRP3的水平。因此，USP7可能通過靶向Nox4和NLRP3蛋白發(fā)揮去泛素化作用，從而參與AngⅡ誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激過程，調(diào)節(jié)心肌肥厚和心肌重構(gòu)。本研究仍存在一些局限性。目前，AngⅡ誘導(dǎo)USP7表達增加的具體機制尚不清楚，需要在未來進一步探索。

總之，本研究表明，在AngⅡ刺激的心肌細胞中，USP7表達增加，并且通過靶向Nox4和NLRP3的去泛素化來調(diào)節(jié)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)從而參與心肌肥厚的形成，而抑制USP7或可成為治療心肌重構(gòu)中心肌肥厚的新靶點。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

參考文獻

[1]??McDonagh TA，Metra M，Adamo M，et al.2021 ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure[J].Eur Heart J，2021，42（36）：3599-3726.

[2] Xie S，Chen M，F(xiàn)ang W，et al. Diminished arachidonate 5-lipoxygenase perturbs phase separation and transcriptional response of Runx2 to reverse pathological ventricular remodeling[J].EBioMedicine，2022，86：104359.

[3] Swatek KN，Komander D. Ubiquitin modifications[J].Cell Res，2016，26（4）：399-422.

[4] Zheng J，Chen C，Guo C，et al.The pleiotropic ubiquitin-specific peptidase 16 and its many substrates[J].Cells，2023，12（6）：886.

[5] Clague MJ，Urbé S，Komander D. Breaking the chains： deubiquitylating enzyme specificity begets function[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2019，20（6）：338-352.

[6] Hu Y，Ma Z，Chen Z，et al.USP47 promotes apoptosis in rat myocardial cells after ischemia/reperfusion injury via NF-kappaB activation[J].Biotechnol Appl Biochem，2021，68（4）：841-848.

[7] Han X，Zhang YL，F(xiàn)u TT，et al.Blockage of UCHL1 activity attenuates cardiac remodeling in spontaneously hypertensive rats[J].Hypertens Res，2020，43（10）：1089-1098.

[8] Bi HL，Zhang YL，Yang J，et al. Inhibition of UCHL1 by LDN-57444 attenuates Ang II-Induced atrial fibrillation in mice[J].Hypertens Res，2020，43（3）：168-177.

[9] Pozhidaeva A，Bezsonova I. USP7： structure，substrate specificity，and inhibition[J].DNA Repair （Amst），2019，76：30-39.

[10] Fountain MD，Oleson DS，Rech ME，et al. Pathogenic variants in USP7 cause a neurodevelopmental disorder with speech delays，altered behavior，and neurologic anomalies[J].Genet Med，2019，21（8）：1797-1807.

[11] Zhang XW，F(xiàn)eng N，Liu YC，et al. Neuroinflammation inhibition by small-molecule targeting USP7 noncatalytic domain for neurodegenerative disease therapy[J].Sci Adv，2022，8（32）：eabo0789.

[12] Galarreta A，Valledor P，Ubieto-Capella P，et al. USP7 limits CDK1 activity throughout the cell cycle[J].EMBO J，2021，40（11）：e99692.

[13] Xue Q，Yang D，Zhang J，et al. USP7，negatively regulated by miR-409-5p，aggravates hypoxia-induced cardiomyocyte injury[J].APMIS，2021，129（3）：152-162.

[14] Suetomi T，Willeford A，Brand CS，et al. Inflammation and NLRP3 inflammasome activation initiated in response to pressure overload by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ delta signaling in cardiomyocytes are essential for adverse cardiac remodeling[J].Circulation，2018，138（22）：2530-2544.

[15] Bedard K，Krause KH. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases： physiology and pathophysiology[J].Physiol Rev，2007，87（1）：245-313.

[16] Nie L，Wang C，Liu X，et al. USP7 substrates identified by proteomics analysis reveal the specificity of USP7[J].Genes Dev，2022，36（17-18）：1016-1030.

[17] Meulmeester E，Maurice MM，Boutell C，et al.Loss of HAUSP-mediated deubiquitination contributes to DNA damage-induced destabilization of Hdmx and Hdm2[J].Mol Cell，2005，18（5）：565-276.

[18] Cummins JM，Rago C，Kohli M，et al.Tumour suppression： disruption of HAUSP gene stabilizes p53[J].Nature，2004，428（6982）：1 p following 486.

[19] Song MS，Salmena L，Carracedo A，et al. The deubiquitinylation and localization of PTEN are regulated by a HAUSP-PML network[J].Nature，2008，455（7214）：813-817.

[20] Liu G，Liu Q，Yan B，et al.USP7 inhibition alleviates H2O2-induced injury in chondrocytes via inhibiting NOX4/NLRP3 pathway[J].Front Pharmacol，2020，11：617270.

[21] Ji L，Lu B，Zamponi R，et al. USP7 inhibits Wnt/beta-catenin signaling through promoting stabilization of Axin[J].Nat Commun，2019，10（1）：4184.

[22] Sanz RL，Inserra F，García Menéndez S，et al.Metabolic syndrome and cardiac remodeling due to mitochondrial oxidative stress involving gliflozins and sirtuins[J].Curr Hypertens Rep，2023;25（6）：91-106.

[23] Daou D，Gillette TG，Hill JA. Inflammatory mechanisms in heart failure with preserved ejection fraction[J].Physiology （Bethesda），2023，38（5）：0.

[24] Hu C，Zhang X，Wei W，et al. Matrine attenuates oxidative stress and cardiomyocyte apoptosis in doxorubicin-induced cardiotoxicity via maintaining AMPKalpha/UCP2 pathway[J].Acta Pharm Sin B，2019，9（4）：690-701.

[25] Werbner B，Tavakoli-Rouzbehani OM，F(xiàn)atahian AN，et al.The dynamic interplay between cardiac mitochondrial health and myocardial structural remodeling in metabolic heart disease，aging，and heart failure[J].J Cardiovasc Aging，2023，3（1）：9.

[26] Guo S，Chen X. The human Nox4：gene，structure，physiological function and pathological significance[J].J Drug Target，2015，23（10）：888-896.

[27] Xu Q，Liu M，Gu J，et al. Ubiquitin-specific protease 7 regulates myocardial ischemia/reperfusion injury by stabilizing Keap1[J].Cell Death Discov，2022，8（1）：291.

[28] Palazón-Riquelme P，Worboys JD，Green J，et al. USP7 and USP47 deubiquitinases regulate NLRP3 inflammasome activation[J].EMBO Rep，2018，19（10）：e44766.

收稿日期：2023-05-04