凌 玲，周 雨，袁 媛，安 娜

北京市石景山區(qū)疾病預(yù)防控制中心理化科，北京 100043

0 引言

酸奶以牛奶為原料，經(jīng)過(guò)殺菌、接種、發(fā)酵、包裝等工藝加工而成，因其加工過(guò)程添加有益菌，部分乳糖被分解，不但保留了牛奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還可減輕乳糖不適癥狀，適合更多消費(fèi)群體。乙?；前匪徕浻置操惷?，是一種食品添加劑，具有強(qiáng)烈甜味。糖精鈉也是食品工業(yè)中常用的合成甜味劑，因其價(jià)格低廉被部分生產(chǎn)企業(yè)使用。酸奶中添加乙?；前匪徕洝⑻蔷c等甜味劑可有效緩解發(fā)酵產(chǎn)生酸味，既滿足口感，又解決糖尿病人以及老年人和肥胖患者等特殊人群控制糖攝入量的困難。如今越來(lái)越多年輕人也更注重低糖低脂食品攝入，使添加乙酰磺胺酸鉀和糖精鈉等甜味劑的無(wú)糖酸奶越來(lái)越受消費(fèi)者喜愛(ài)。乙?；前匪徕洝⒈郊姿?、山梨酸和糖精鈉等添加劑的長(zhǎng)期超量使用會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不同程度危害，但部分酸奶生產(chǎn)廠家為降低生產(chǎn)成本，獲取更大利益，濫用或超標(biāo)使用食品添加劑。我國(guó)目前實(shí)施的乙?；前匪徕泧?guó)標(biāo)檢測(cè)方法只檢測(cè)單一成分，為同時(shí)檢測(cè)酸奶中更多食品添加劑，本文通過(guò)高效液相色譜儀，同時(shí)檢測(cè)酸奶中甜味劑乙酰磺胺酸鉀、糖精鈉，以及防腐劑苯甲酸、山梨酸4 種添加劑的方法。通過(guò)檢測(cè)過(guò)程中可能影響檢測(cè)結(jié)果的有關(guān)因素進(jìn)行不確定度分析，為檢測(cè)方法可行性、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UltiMate 3000（DAD）高效液相色譜儀，Thermo Fisher公司；BS 224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司； KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司； 3-30KS高速冷凍離心機(jī)，SIGMA公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)；一次性針頭過(guò)濾器；0.22 μm水相微孔濾膜；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；乙酸銨（分析純，西亞試劑公司）；亞鐵氰化鉀（分析純，北京化學(xué)試劑公司）；乙酸鋅（分析純，北京化學(xué)試劑公司）；冰乙酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙?；前匪徕浫芤簶?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW（E）100171，1 000 μg/mL，北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司；苯甲酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW（E）100006，1.00 mg/mL，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；山梨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW（E）100007，1.00 mg/mL，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；糖精鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW（E）100008，1 000 mg/L，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取5 g（精確至0.001 g）酸奶樣品于50 mL容量瓶中，加純水40 mL，混勻，超聲20 min后分別加入蛋白沉淀劑亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）、乙酸鋅溶液（183 g/L）各1 mL，混勻后用純水定容至刻度。經(jīng)冷凍離心機(jī)13 000 r/min 離心15 min，將上清液過(guò)0.22 μm水相濾膜后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2 混合4 種添加劑標(biāo)準(zhǔn)使用液及標(biāo)準(zhǔn)系列的配制

分別取乙酰磺胺酸鉀、苯甲酸、山梨酸和糖精鈉4 種添加劑標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.00 mL至10 mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，得到濃度為100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別吸取適量濃度為100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，加水稀釋并定容，配制成4 種添加劑混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，濃度分別為1.00 mg/L、5.00 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：C18柱（柱長(zhǎng)250 mm、內(nèi)徑4.6 mm、粒徑5 μm）。

流動(dòng)相：等度洗脫甲醇與乙酸銨溶液（0.02 mol/L）比例為10∶90。

運(yùn)行時(shí)間：10 min。

流速：1.0 mL/min。

柱溫：40 ℃。

檢測(cè)波長(zhǎng)：227 nm。

進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)量模型

試樣中每種添加劑含量按如下公式計(jì)算：

其中，X—試樣中每種添加劑的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

c—試樣溶液中添加劑的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升（mg/L）；

V—被測(cè)試樣總體積，單位為毫升（mL）；

m—稱取試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；

1 000—換算系數(shù)。

2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)

以乙?；前匪徕?、苯甲酸、糖精鈉和山梨酸4 種混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以測(cè)得4 種添加劑相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表1可知，濃度1.00～50.0 mg/L范圍內(nèi)4 種添加劑相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9。

2.3 檢出限與定量限

對(duì)濃度1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖分析可得，該濃度進(jìn)樣時(shí)各添加劑峰高與基線噪聲的比值（信噪比）。計(jì)算信噪比（S/N）=3時(shí)對(duì)應(yīng)各添加劑進(jìn)樣濃度，結(jié)合酸奶取樣量和定容體積可確定酸奶中4 種添加劑含量，得到檢出限。計(jì)算信噪比（S/N）=10時(shí)對(duì)應(yīng)各添加劑進(jìn)樣濃度，結(jié)合酸奶取樣量和定容體積可確定酸奶中4 種添加劑含量，得到定量限。本試驗(yàn)結(jié)果4 種添加劑的檢出限與定量限見(jiàn)表1。

2.4 回收率與精密度

向酸奶樣品中分別加入4 種添加劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到5 mg/L、10 mg/L、15mg/L3 個(gè)濃度的加標(biāo)量，每個(gè)濃度分別取6 個(gè)平行樣共18 份酸奶樣品進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果4 種添加劑的回收率平均值為91.2%～104.8%，精密度均小于2%，試驗(yàn)結(jié)果滿意（表2）。

表2 加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

乙?；前匪徕浀膰?guó)標(biāo)檢測(cè)方法GB/T 5009.140—2003中流動(dòng)相為：0.02 mol/L硫酸銨溶液+甲醇+乙腈+10 %H2SO4溶液[1]，2024年3月6日實(shí)施的新版國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法GB 5009.140—2023中流動(dòng)相為：0.02 mol/L硫酸銨溶液+甲醇+乙腈[2]，配制都較復(fù)雜，且時(shí)間較長(zhǎng)。本文以甲醇和乙酸銨溶液（0.02 mol/L）為流動(dòng)相，配制簡(jiǎn)單，不需加入甲酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，只調(diào)整流動(dòng)相的速度和比例就能使4 種添加劑完全分離。與加入甲酸的流動(dòng)相相比，只是4 種添加劑出峰先后順序不同，并不影響分離效果[3]?？紤]盡可能縮短試驗(yàn)時(shí)間，經(jīng)過(guò)多次不同比例的流動(dòng)相試驗(yàn)后，最終確定甲醇與乙酸銨溶液比例10∶90。4 種添加劑標(biāo)準(zhǔn)溶液分離效果及出峰順序見(jiàn)圖1。

圖1 10 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

3.2 波長(zhǎng)選擇

通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)4 種添加劑在波長(zhǎng)190～300 nm的特征吸收光譜圖。波長(zhǎng)200～260 nm每種添加劑響應(yīng)峰值不同，4 種添加劑最大吸收波長(zhǎng)分別為乙?；前匪徕?24 nm、苯甲酸227 nm、糖精鈉200 nm、山梨酸255 nm。波長(zhǎng)200 nm時(shí)山梨酸響應(yīng)較差，波長(zhǎng)255 nm時(shí)糖精鈉響應(yīng)較差，波長(zhǎng)227 nm時(shí)4 種添加劑同時(shí)響應(yīng)很好且出峰面積較均衡（圖1），最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm（圖3） 。

圖3 4 種食品添加劑特征吸收光譜圖

3.3 樣品處理方法

4種添加劑的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法中，一般樣品都經(jīng)過(guò)2 次提取[1～3]，再合并離心后的上清液定容。本方法在檢測(cè)酸奶樣品，樣品經(jīng)過(guò)稀釋混勻并超聲20 min的前處理方法一次提取4 種添加劑即可達(dá)滿意效果，通過(guò)加標(biāo)回收率證明能滿足要求，縮減步驟，減少時(shí)間。

3.4 蛋白沉淀方法

不同樣品待測(cè)組份不同時(shí)，沉淀蛋白的方法不同。本方法處理酸奶樣品，采用蛋白沉淀劑亞鐵氰化鉀和乙酸鋅。通過(guò)多次試驗(yàn)，調(diào)整2 種試劑用量，最終確定取樣量5.0 g時(shí)2 種試劑各加入1 mL沉淀蛋白效果最好，樣品加標(biāo)回收率滿意。

3.5 不確定度分析

分析本方法建立的測(cè)量模型，可總結(jié)試驗(yàn)結(jié)果的不確定度來(lái)源，主要包括進(jìn)樣液濃度檢測(cè)過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度、樣品定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度、樣品的質(zhì)量測(cè)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度等。以乙?；前匪徕浐繛槔M(jìn)行分析。

3.5.1 測(cè)量模型中進(jìn)樣液濃度檢測(cè)過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本試驗(yàn)中乙?；前匪徕洏?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書標(biāo)明相對(duì)擴(kuò)展不確定度為1%，k=2，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

本試驗(yàn)使用10 mL容量瓶的允許誤差為±0.020 mL，按均勻分布計(jì)算，k=，由容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

本試驗(yàn)使用10 mL容量瓶已在20 ℃校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室溫度（20±4） ℃，水的體積膨脹系數(shù)（2.1×10-4）℃-1，假設(shè)溫度變化是矩形分布，k=，由實(shí)驗(yàn)室溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

本試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)系列取5 個(gè)濃度，采用線性擬合，得到乙?；前匪徕洕舛群晚憫?yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.3812x，對(duì)加標(biāo)（10 mg/L）樣品進(jìn)行6 次測(cè)定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算加標(biāo)樣品濃度，可求出加標(biāo)樣品濃度的平均值為x=9.828 mg/L，由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：s—標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差；x—樣品測(cè)定液平均濃度；b—標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；m—樣品測(cè)定次數(shù)；n—繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)個(gè)數(shù)；—繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的平均濃度；xi—繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)濃度；yi—各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)峰面積實(shí)際測(cè)得值（表3）。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合數(shù)據(jù)計(jì)算表

由上述4 個(gè)分量合成進(jìn)樣液濃度檢測(cè)過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.5.2 樣品定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本試驗(yàn)樣品處理時(shí)定容于50 mL容量瓶，該容量瓶允許誤差為±0.050 mL，按均勻分布計(jì)算，k=，由容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

原理同3.5.1，此處略。計(jì)算可得由實(shí)驗(yàn)室溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

上述兩個(gè)分量可合成樣品定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.5.3 樣品的質(zhì)量測(cè)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本試驗(yàn)的樣品取樣量5.023 g，電子天平分辨力為0.001 g，則區(qū)間半寬度可假設(shè)為均勻分布，k=，由分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

上述兩個(gè)不確定度分量不相關(guān)，所以合成樣品質(zhì)量測(cè)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.5.4 合成不確定度

由測(cè)量模型以及各不確定度分量的分析，合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

高效液相色譜儀測(cè)得進(jìn)樣液濃度9.828 mg/L，由測(cè)量模型計(jì)算樣品中乙?；前匪徕浐縳=9 7.8 3 mg/kg，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uc（x）=0.006 817×97.83=0.67 mg/kg。

3.5.5 擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2，由合成不確定度計(jì)算擴(kuò)展不確定度U=2×0.67=1.34 mg/kg。樣品中乙酰磺胺酸鉀含量97.83 mg/kg時(shí)，結(jié)果表示為X=（97.83±1.34）mg/kg，k=2。

由不確定度分析和評(píng)定可知，采用高效液相色譜儀同時(shí)檢測(cè)酸奶中的4 種添加劑含量時(shí)，最主要的不確定度來(lái)源于進(jìn)樣液濃度檢測(cè)過(guò)程。在實(shí)際檢測(cè)工作中，可通過(guò)選擇高純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，嚴(yán)格控制標(biāo)準(zhǔn)曲線配制，定期檢定儀器設(shè)備等來(lái)提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，降低檢測(cè)結(jié)果的不確定度。

4 結(jié)論

本文建立采用高效液相色譜儀同時(shí)檢測(cè)酸奶中的4 種添加劑含量的方法。通過(guò)亞鐵氰化鉀與乙酸鋅試劑沉淀蛋白的方法處理酸奶樣品，操作簡(jiǎn)單。通過(guò)優(yōu)化高效液相色譜儀的流動(dòng)相比例及相關(guān)儀器參數(shù)，使酸奶樣品中的乙?；前匪徕浀? 種添加劑色譜峰良好分離，檢測(cè)速度快，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)目的。