趙 欣，錢 程，胡雅飛，李俊霖，蔡思琪，普安德，劉大林，王 琳，李新娥

（1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 江蘇 揚州 225009；2.揚州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院(國際聯(lián)合實驗室), 江蘇 揚州 225009）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一種被廣泛種植的豆科飼料作物，享有“牧草之王”的美譽(yù)，具有產(chǎn)量高、營養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)等特點[1-2]，具有較高的飼用價值和經(jīng)濟(jì)價值[3-4]。紫花苜蓿的主要種植區(qū)在我國北方，近年來畜牧業(yè)開始轉(zhuǎn)型發(fā)展，市場對高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牧草的需求逐年增加，因此紫花苜蓿的種植需要進(jìn)一步擴(kuò)大。但是逐年的高溫氣候不但影響了紫花苜蓿的正常生長，更嚴(yán)重限制了紫花苜蓿的推廣和生產(chǎn)利用[5-6]。因此，開發(fā)實用有效的方法來提高紫花苜蓿對高溫脅迫的抗性，從而提高苜蓿生產(chǎn)力具有重要現(xiàn)實意義。近年來的研究表明硅對于緩解植物的高溫脅迫具有重要作用，但相關(guān)機(jī)制的研究仍值得進(jìn)一步探討。

硅添加對于緩解植物高溫脅迫下的氧化損傷以及提高光合作用效率方面具有非常積極的作用。高溫會使植物細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化損傷，導(dǎo)致植物體細(xì)胞膜的組成成分發(fā)生改變、蛋白質(zhì)變性、膜上離子種類與作用發(fā)生改變，最終會造成細(xì)胞膜選擇性吸收功能損壞，出現(xiàn)電解質(zhì)滲漏、電導(dǎo)率增大等現(xiàn)象[7-10]。這些現(xiàn)象降低了植物的品質(zhì)，并導(dǎo)致植物的生物量和存活率下降。然而，植物受到高溫脅迫后會因為硅的介導(dǎo)而放大發(fā)揮自身的適應(yīng)性反應(yīng)，因此硅在增強(qiáng)植物對高溫脅迫的適應(yīng)性方面起著積極的調(diào)節(jié)作用。硅添加處理后的植物在其體內(nèi)如細(xì)胞壁中表現(xiàn)出高硅沉積，為植物的抗逆性提供了機(jī)械支撐[11-14]，增加表皮蠟的形成，增加細(xì)胞的熱穩(wěn)定性，減少電解質(zhì)泄露；還可以通過增強(qiáng)抗氧化酶的活性和水平來清除ROS，緩解細(xì)胞的氧化損傷，從而增強(qiáng)植物的耐熱性[15-17]；硅還可以作為信號分子上調(diào)部分基因的表達(dá)，使植物合成葉綠素的速度和能力不受脅迫影響，并提高光合性能指數(shù)，例如光下葉片的實際光能轉(zhuǎn)化效率[Y (Ⅱ)]和光系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量 (Fv/Fm)等，從而保證光合作用的正常運行使生物量不受高溫脅迫影響[1,14-15]。而且，由于葉片抗氧化系統(tǒng)的酶活力在硅添加后得到提升，可能從一定程度上保護(hù)葉綠體等器官的形態(tài)和功能的穩(wěn)定性。葉綠體是由外膜(chloroplast envelope)、類囊體(thylakoid)和基質(zhì)(stroma) 3 部分組成，光合作用在此進(jìn)行，因此它的形態(tài)結(jié)構(gòu)在一定程度上可以作為表征植物高溫耐受性的依據(jù)[18-19]。類囊體膜主要是由脂肪酸和不飽和脂肪酸組成，高溫脅迫產(chǎn)生的活性氧會造成這些膜結(jié)構(gòu)損害[20-21]，而硅添加可以改變膜結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比例，維持膜的完整性和穩(wěn)定性[22-23]，緩解葉綠體等細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)畸形等[15,24]。葉綠素合成以及葉綠素a 氧化生成葉綠素b 都在葉綠體膜上進(jìn)行，并且類囊體膜上含有電子傳遞鏈組分[19]。由此可見，硅添加通過對類囊體膜完整性的影響與葉綠素含量及光合電子傳遞存在緊密的聯(lián)系。

然而，就目前硅添加對緩解植物高溫脅迫的研究來看，大多獨立討論硅對抗氧化系統(tǒng)、光合作用效率、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和抗氧化系統(tǒng)綜合探討的研究很少，不能夠反映硅添加對活性氧清理后對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的保護(hù)效果。高溫脅迫使細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生大量的活性氧對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重的損害，超微結(jié)構(gòu)直接反映了細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜的完整性，在一定程度反映抗氧化酶對活性氧的清理效果。研究葉綠體和類囊體等超微結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步印證高溫造成的活性氧積累是否對細(xì)胞膜以及葉綠體結(jié)構(gòu)造成損傷，以及硅添加是否能夠保護(hù)其完整性。因此，以紫花苜蓿為研究對象，比較高溫脅迫下添加硅和不添加硅條件下的葉片抗氧化酶活性、葉綠素特征、葉綠體超微結(jié)構(gòu)等的差異，旨在進(jìn)一步揭示硅添加對紫花苜蓿耐熱性的影響，為開發(fā)提高苜蓿耐熱性的實用有效方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

采用盆栽試驗，供試紫花苜蓿品種為‘WL363’(正道種業(yè)，北京)。試驗于2022 年5 月開始，首先在揚州大學(xué)草學(xué)智能溫室育苗盤中播種充足數(shù)量的紫花苜蓿種子，待其發(fā)芽后約一周后移栽到花盆中?；ㄅ柽x用高23 cm、直徑15 cm 的塑料花盆，每盆裝土2 kg，土壤為揚州大學(xué)試驗田表層土與營養(yǎng)土混合，兩種土重量比1 ∶ 1，共2 kg。移栽時選取大小相近的、2～3 cm 高的幼苗，每個花盆移栽5 株。幼苗移栽后在溫室環(huán)境中生長兩周之后轉(zhuǎn)移到人工氣候箱中(RTOP-400Y，拓普云農(nóng)，浙江)開始高溫脅迫和添加硅處理。試驗設(shè)置兩個溫度和兩個硅濃度水平，即常溫(20 ℃/25 ℃, OT)和高溫(35 ℃/40℃, HT)，0 和2 mmol·L-1硅濃度(分別標(biāo)記為Si0和Si2)。其中硅源為K2SiO3，為平衡K 離子濃度，0 mmol·L-1Si 的處理中加入兩倍濃度的KCl 溶液。因此，共有兩個溫度水平和兩個硅濃度水平，共4 個處理，每個處理4 個重復(fù)，共16 盆。自處理開始，每盆每天澆等量的處理溶液，澆水量視水分蒸發(fā)情況而定，每次澆100 或50 mL；此外，隨機(jī)改變花盆在培養(yǎng)箱中的位置，以消除氣候箱中微環(huán)境的影響。于2022 年8 月初進(jìn)行取樣，隨后即進(jìn)行測定試驗。

1.2 取樣及指標(biāo)測定

1.2.1 株高、根長和生物量

在脅迫處理結(jié)束時，用直尺測量每盆植株的株高取平均值，將植株取出花盆，用自來水沖洗植株，使植株保持完整干凈，然后用吸水紙吸干水分。于掃描儀(HP Desk Jet 2 132，惠普，重慶)中掃描根系圖片，用Image J 軟件(NIH, Bethesda, MD, 美國)測量根系長度。取一整株，將根、莖、葉用剪刀剪下，待各部分鮮重測定完成后置于105 ℃烘箱中殺青15 min，烘箱溫度調(diào)至75 ℃烘干至恒重，用分析天平(CL-J120，上海亞津；精確到0.000 1 g)測定其干重。其余樣品將根、莖、葉分別存放在自封袋中，放-80 ℃冰箱保存，以備后續(xù)試驗采用。共取得并存放根、莖、葉樣品各16 個。

1.2.2 相對電導(dǎo)率和抗氧化酶活性的測定

從各葉片樣品中隨機(jī)稱取約0.1 g 新鮮葉片(5～10 片)用去離子水清洗3 次后放入去離子水清洗過的50 mL 離心管內(nèi)，加入15 mL 去離子水后將離心管放在25 ℃的恒溫?fù)u床上振蕩24 h。取出后用電導(dǎo)率儀(DDS-11A ，上海儀電，上海)測定初始電導(dǎo)率記為EL1，然后用100 ℃的水浴鍋中煮1 h 后取出，冷卻至常溫后測定第二電導(dǎo)率，記為EL2，相對電導(dǎo)率EL 的值為EL = (EL1/EL2) × 100%。

同上，從各樣品中隨機(jī)稱取6 g 新鮮葉片，液氮速凍，添加10 mL pH 為6.0 的磷酸緩沖溶液研磨成液體，4 ℃條件下4 000 離心取上清液。取0.2 mL上清液采用氮藍(lán)四唑顯色法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活 性。取0.05 mL 上 清液用過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒(索萊寶，北京)測定CAT 活性，取0.1 mL 上清液用過氧化物酶(peroxidase，POD)試劑盒(索萊寶，北京)測定POD活性。

1.2.3 葉片超微結(jié)構(gòu)

葉片超微結(jié)構(gòu)的樣品為活體取樣，從每個處理花盆中取3～5 片健康的相同葉位的葉片固定于2.5%戊二醛固定液中，送樣至青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測有限公司，取其中一片使用超薄切片機(jī)(EM KMR3，Leica，德國)進(jìn)行超薄切片，透射電子顯微鏡拍照觀察(Tecnai 12，Philips，荷蘭)其超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 葉綠素含量與葉綠素?zé)晒馓卣?/p>

葉綠素測定方法為從各樣品種稱取0.1 g 紫花苜蓿新鮮葉片，放入10 mL 的離心管中，并且加入5 mL濃度為95%的酒精，避光浸提48 h，用分光光度計測波長665 和649 nm 下的吸光度，同時以95%的酒精作為空白對照組。然后根據(jù)以下公式計算葉綠素a(mg·g-1)、葉綠素b (mg·g-1)和葉綠素總含量(mg·g-1)[3]。

式中：m表示稱取的樣品質(zhì)量，Chla 代表樣品中葉綠素a 的含量，Chlb 代表樣品中葉綠素b 的含量，Chl 代表樣品中葉綠素的總含量，D649為樣品提取液在649 nm 下的吸光度，D665為樣品提取液在665 nm 下的吸光度。

將紫花苜蓿盆栽在黑暗處暗處理30 min 后，使用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(PAM2500，Heinz Walz GmbH，德國)對紫花苜蓿葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行檢測，每盆重復(fù)測量9 次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用 Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理采用，使用R 軟件(R version 4.0.2)進(jìn)行雙因素方差分析和多重比較分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果，并采用R 軟件中g(shù)gplot2 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫下添加硅對紫花苜蓿植株生長特征的影響

為了確定高溫脅迫對紫花苜蓿表型的影響以及硅添加的緩解效果，分別測量紫花苜蓿的株高、根長以及單株生物量。紫花苜蓿的植株形態(tài)受到高溫脅迫的影響(圖1)，在正常溫度下生長的紫花苜蓿株高均值為19.08 (Si0)和20.03 cm (Si2)，而在高溫下平均株高僅為8.63 cm (Si0)，硅添加處理后的平均株高為17.55 cm (Si2)。在正常溫度下，硅添加將根長提高了20%，高溫脅迫時有所降低，硅添加沒有對高溫脅迫下的根長帶來正面的影響(圖2)；單株生物量變化與株高的基本一致，正常溫度下的單株生物量分別為0.77 (Si0)和1.21 g (Si2)，添加硅將單株生物量顯著提高了36.5% (P＜ 0.05)，高溫下硅添加使單株生物量提高了47.0% (圖2)。

圖1 高溫脅迫下硅添加對紫花苜蓿生長情況的影響Figure 1 Effect of silicon addition on alfalfa growth under high-temperature stress

圖2 高溫脅迫下硅添加對紫花苜蓿株高、根長和單株生物量的影響Figure 2 Effect of silicon addition on plant height, root length, and biomass per plant under high-temperature stress

2.2 高溫脅迫下硅添加對紫花苜蓿氧化防御系統(tǒng)的影響

在正常溫度下，硅添加處理對SOD 活性沒有顯著影響(P＞ 0.05)；在高溫條件下，SOD 活性均相對提高，硅添加處理的SOD 活性高于Si0HT，高了約16%，但不顯著。與Si0OT 比較，Si2OT 的POD 活性顯著降低了17% (P＜ 0.05)，Si0HT 和Si2HT 無顯著差異。相較于Si0OT，CAT 活性在Si0HT 時顯著提高了57% (P＜ 0.05)，且Si2HT 較Si0HT 顯著提高了38% (P＜ 0.05) (圖3)。

圖3 高溫脅迫下硅添加對紫花苜蓿超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性的影響Figure 3 Effect of silicon addition on superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), and catalase (CAT)activities of alfalfa under high-temperature stress

2.3 高溫脅迫下硅添加對紫花苜蓿葉片超微結(jié)構(gòu)和相對電導(dǎo)率的影響

通常高溫脅迫會使植物的葉片微觀形態(tài)產(chǎn)生改變。Si0OT 的葉肉細(xì)胞形態(tài)完好，結(jié)構(gòu)完整，Si2OT的葉肉細(xì)胞也是完整且堅固(圖4A)，Si2OT 的處理使細(xì)胞穩(wěn)定性更強(qiáng)，葉綠體數(shù)量增多(圖4B)。Si0HT的葉肉細(xì)胞膜損壞嚴(yán)重，細(xì)胞質(zhì)外滲，葉綠體結(jié)構(gòu)損壞(圖4C)，而Si2HT 的葉肉細(xì)胞膜沒有過度損壞，細(xì)胞形態(tài)比Si0HT 的細(xì)胞完整，但相較于Si0OT 和Si2OT 的葉片細(xì)胞形態(tài)還是有所變形，葉綠體含量減少(圖4D)。正常條件下葉綠體呈規(guī)則橢圓形，其中有組織良好的葉綠體類囊體和平行的薄片(圖5A)，Si2OT 的處理使細(xì)胞穩(wěn)定性強(qiáng)(圖5B)，然而Si0HT 的葉綠體則變得腫脹或損壞，Si0HT 的葉綠體中類囊體薄膜破裂，并出現(xiàn)了大量密集的質(zhì)體球(圖5C)，質(zhì)體球在類囊體分解過程中會增加，其數(shù)量的增加可能與葉綠體的衰老有關(guān)。Si2HT 的葉綠體形態(tài)比Si0HT 的葉綠體形態(tài)完整，質(zhì)體球含量減少(圖5D)。除了在高溫不添加硅的條件下，紫花苜蓿的葉片相對電導(dǎo)率的值都維持在正常的范圍，高溫條件下Si0處理的葉片相對電導(dǎo)率顯著升高(P＜ 0.05)，而Si2處理使同樣在高溫脅迫下的葉片相對電導(dǎo)率降低了41% (圖6)。

圖4 高溫脅迫下硅添加對紫花苜蓿細(xì)胞膜的影響Figure 4 Effect of silicon addition on alfalfa cell membrane under high-temperature stress

圖5 高溫脅迫下硅添加對紫花苜蓿葉綠體的影響Figure 5 Effect of silicon addition on alfalfa ultrastructured chloroplasts under high-temperature stress

圖6 硅添加對高溫脅迫下紫花苜蓿相對電導(dǎo)率的影響Figure 6 Effect of silicon addition on the relative conductivity of alfalfa under high-temperature stress

2.4 高溫脅迫下硅添加對紫花苜蓿葉綠素含量和葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h3>

葉綠素起到了吸收和傳遞光量子的作用，其含量高低直接影響植物光合作用的強(qiáng)弱。與Si0OT 相比，Si2OT 的葉綠素a 和葉綠素b 以及葉綠素總含量分別升高了12%、11%和12% (圖7)，與Si0HT 條件相比，Si2HT 的葉綠素a 和葉綠素總含量分別顯著升高了27%和23%。Fv/Fm值反映了潛在的最大光合作用的能力，硅添加顯著影響了紫花苜蓿Fv/Fm的值，在不同溫度條件下，Si0HT 的Fv/Fm值顯著低于Si0OT (圖8)，低了15%，而在高溫添加硅后，Si2HT 相較于Si0HT 顯著升高了19%。與Si0OT 相比，Si0HT 紫花苜蓿的Y(Ⅱ)顯著降低了23%，但與Si0HT 相比，Si2HT 處理顯著提高了紫花苜蓿的Y(Ⅱ) (P＜ 0.05) (圖8)。

圖7 高溫脅迫下硅添加對紫花苜蓿葉綠素a、葉綠素b 以及葉綠素總含量的影響Figure 7 Effect of silicon addition on the activities of alfalfa chlorophyll a, chlorophyll b,and total chlorophyll content under high-temperature stress

圖8 高溫脅迫下硅添加對紫花苜蓿Fv/Fm 和Y (Ⅱ)的影響Figure 8 Effect of silicon addition on alfalfa Fv/Fm and Y (Ⅱ) under high-temperature stress

3 討論

硅作為外源調(diào)節(jié)劑已被廣泛利用，在植物抵御環(huán)境損害方面發(fā)揮著重要作用。研究顯示，硅添加在高溫脅迫下顯著提高番茄(Solanum lycopersicum)的枝條重量，增加大麥(Hordeum vulgare)的根長和根重，對植株的生長參數(shù)都有積極的影響[12,25-26]。本研究的生長參數(shù)結(jié)果也顯示，高溫脅迫明顯抑制了紫花苜蓿幼苗的生長、養(yǎng)分的吸收和生物量的合成，而在高溫下添加硅，有效緩解了紫花苜蓿在高溫下的生長限制，提高了生物量。

高溫脅迫下植物細(xì)胞內(nèi)大量積累的活性氧對細(xì)胞的膜脂化系統(tǒng)造成嚴(yán)重的傷害，而耐熱性較高的植物在受到脅迫時會提高清除活性氧和氧自由基的抗氧化系統(tǒng)酶的活性。SOD、POD、和CAT 等是植物體內(nèi)的主要抗氧化酶，當(dāng)植物遭受脅迫時，能協(xié)同清除 ROS 的過多積累對細(xì)胞膜系統(tǒng)造成的損傷，降低細(xì)胞膜脂過氧化程度，提高植物的抗逆性[27]。本研究結(jié)果顯示，硅添加使高溫脅迫下紫花苜蓿葉片的過氧化氫酶活性顯著提高(圖3)，這有助于快速清除植物體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成損害的H2O2，與硅添加在高溫脅迫下白菜(Brassica pekinensis)、棗椰樹(Phoenix dactylifera)和草莓(Fragaria ananassa)等植物中的過氧化氫含量顯著降低相一致[14,28-29]。

大量積累的ROS 對細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的完整性帶來負(fù)面影響，硅激發(fā)酶的清除作用以及硅沉積則對超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生保護(hù)效果。根據(jù)對紫花苜蓿葉片透射電鏡影像的觀察，在高溫脅迫下紫花苜蓿葉片細(xì)胞膜和細(xì)胞壁都出現(xiàn)了破損和變形(圖4C)，相對電導(dǎo)率的顯著提高也證明了其細(xì)胞膜在高溫條件下受到損傷，細(xì)胞質(zhì)滲漏；這種變化可能歸因于高溫脅迫引起的水分虧缺[30]，以及高溫誘導(dǎo)的膜蛋白和脂質(zhì)改變[31]。硅添加后細(xì)胞壁和細(xì)胞膜保持了相對完整性(圖4D)，葉片的相對電導(dǎo)率有所下降(圖6)。這種對細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的保護(hù)除了是抗氧化酶對ROS 的清除以外，還有可能是硅在質(zhì)膜與細(xì)胞壁的界面或在細(xì)胞間隙的沉積，這種現(xiàn)象在禾本植物水稻(Oryza sativa)、小麥(Triticum aestivum)中尤為突出[32-34]，也有可能是因為硅通過改變不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比例，來維持質(zhì)膜的完整性和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[35]。

葉綠素合成從起始到中間步驟都在葉綠體膜上進(jìn)行，后期所有步驟以及葉綠素a 氧化生成葉綠素b 都發(fā)生在類囊體膜上，并且類囊體膜上含有電子傳遞鏈組分[18-19,36]，因此硅添加對類囊體膜完整性的保護(hù)也會影響葉綠素合成和光合電子傳遞。在本研究中，高溫脅迫引起了葉綠體基質(zhì)中質(zhì)體球增多(圖5C)，這是由于類囊體膜分解使光合作用的反應(yīng)場所受到損傷所導(dǎo)致[37-40]，繼而造成了葉綠素a、葉綠素b 和葉綠素總量的顯著下降(圖7)，這些與小麥、豌豆(Pisum sativum)以及葡萄(Vitis vinifera)的研究結(jié)果一致[41-43]。而高溫下硅添加處理的紫花苜蓿具有完整的葉綠體和少量的質(zhì)體球、葉綠素a、葉綠素b 和葉綠素總量的值以及熒光參數(shù)Fv/ Fm值和Y(Ⅱ)的值顯著高于高溫脅迫不添加硅的紫花苜蓿(圖8)，這與其他研究中煙草(Nicotiana tabacum)[44]和紫花苜蓿[45]相關(guān)指標(biāo)的反應(yīng)一致。這說明硅添加通過修復(fù)類囊體膜維持葉綠體形態(tài)和功能的途徑有效緩解了高溫脅迫對光系統(tǒng)的傷害[46]。

4 結(jié)論

綜上，高溫脅迫對紫花苜蓿的產(chǎn)量等各方面造成了嚴(yán)重的負(fù)面影響，而添加硅提高了紫花苜蓿的生物量，相關(guān)機(jī)制可能為通過提高紫花苜蓿幼苗抗氧化酶的活性，減輕了氧化損傷，增強(qiáng)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜以及葉綠體類囊體膜的穩(wěn)定性，提高葉綠素含量，保護(hù)紫花苜蓿葉片的光系統(tǒng)反應(yīng)，提高光能利用效率，從而最終提高紫花苜蓿的耐熱性。