王 寧，萬 暢，高 山，閆程銘，李忠和，王俊喬，任 偉，王志鋒

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 / 中國農(nóng)業(yè)科技東北創(chuàng)新中心, 吉林 長春 130124；2.吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 吉林 四平 136000）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是豆科多年生牧草，優(yōu)質(zhì)的飼用作物，被譽(yù)為“牧草之王”[1-2]。但是土壤鹽漬化嚴(yán)重影響紫花苜蓿生長發(fā)育及草地畜牧業(yè)發(fā)展[3]。開展紫花苜蓿耐鹽性研究，培育耐鹽品種，能夠?yàn)闃淞⒋笫澄镉^、構(gòu)建多元供給體系、保障糧食安全、保護(hù)黑土地[4]提供有力科技支撐。

目前關(guān)于紫花苜蓿萌發(fā)期耐鹽性的研究較多，于潔等[5]為探究5 份紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐鹽性強(qiáng)弱，測定紫花苜蓿發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)與幼苗干重等萌發(fā)指標(biāo)，采用主成分分析法、隸屬函數(shù)法等進(jìn)行耐鹽性評價，結(jié)果表明，發(fā)芽率與幼苗干重作為紫花苜蓿萌發(fā)期耐鹽性評價的主要參考指標(biāo)。李雪等[6]對59 份紫花苜蓿種質(zhì)資源進(jìn)行萌發(fā)期耐鹽性篩選評價，篩選出5 份耐鹽性強(qiáng)的紫花苜蓿種質(zhì)，確定了發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)為主要耐鹽評價指標(biāo)。張喜斌等[7]對60 份紫花苜蓿品種進(jìn)行苗期耐鹽性評價，利用主成分分析和隸屬函數(shù)法對過氧化氫酶、過氧化物酶、丙二醛含量等生理指標(biāo)進(jìn)行評價，并依據(jù)耐鹽性度量值篩選出耐鹽與敏鹽品種。江超[8]通過測定‘印第安苜?！熊? 號’‘三得利’和‘敖漢苜?！? 個紫花苜蓿品種苗期的保護(hù)酶活性、離子含量等生理生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)丙二醛和保護(hù)酶系統(tǒng)對紫花苜蓿耐鹽強(qiáng)弱影響較大。但是關(guān)于紫花苜蓿苗期表型生物學(xué)特征的研究較少。此外，在我國現(xiàn)階段苜蓿實(shí)際產(chǎn)業(yè)發(fā)展進(jìn)程中，國外引進(jìn)品種占比較大，目前對這些國外主推苜蓿品種的耐鹽評價研究較少。

因此，本研究采用室內(nèi)水培鹽脅迫的方法，通過測定國外80 份紫花苜蓿品種苗期9 個指標(biāo)，利用差異性分析、相關(guān)性分析、主成分分析、回歸分析、聚類分析等方法，開展不同紫花苜蓿品種苗期耐鹽性評價，確定主要耐鹽指標(biāo)，劃分耐鹽等級，篩選耐鹽品種，以期為選育耐鹽紫花苜蓿新品種及解析耐鹽分子調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

80 份引進(jìn)的紫花苜蓿品種中，包含吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院保存的9 份，北京正道生態(tài)科技有限公司的14 份，百綠(天津)國際草業(yè)有限公司的17 份，丹麥丹農(nóng)種子集團(tuán)的12 份，克勞沃(北京)生態(tài)科技有限公司的28 份(表1)。

表1 80 份紫花苜蓿品種來源Table 1 Sources of 80 alfalfa varieties

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將80 份紫花苜蓿種子用0.1%升汞消毒10 min，蒸餾水沖洗2～3 次后，分別置于5 層濾紙的培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件：光照14 h，光照強(qiáng)度5 000 lx，黑暗10 h，相對濕度60%。發(fā)芽7 d 后，采用水培法，將每個品種挑選長勢一致的10 株幼苗，置于660 mm × 330 mm × 30 mm(長 × 寬 × 高)長方形無孔塑料水培箱中，然后添加Hoagland 營養(yǎng)液(PytoTech，H353)培養(yǎng)，每個水培箱放置10 個品種。試驗(yàn)在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草地所氣候室進(jìn)行，溫度為22 ℃，每5 d 更換一次營養(yǎng)液。生長35 d 后進(jìn)行鹽脅迫處理，根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果共設(shè)置2 個處理：無NaCl 的Hoagland 營養(yǎng)液處理(對照，CK)和含1.2% NaCl 濃度的Hoagland營養(yǎng)液處理(T)，每個處理3 個重復(fù)。脅迫處理12d 后取樣測量，每次取樣3 次重復(fù)。

1.3 指標(biāo)測定及方法

參照《牧草種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[9]，分別測量株高(mm)、根長(mm)、葉片寬度(mm)、葉片厚度(mm)、莖粗(mm)、鮮重(g)、干重(g)，并計(jì)算相對組織含水量。

干重：先將鮮樣在烘箱中110 ℃殺青20 min后，再將烘箱溫度調(diào)至80 ℃烘干至恒重。

葉綠素含量：使用葉綠素儀(SPAD-502 Plus，KON-ICA MINOLTA，Japan)測定紫花苜蓿葉片相對葉綠素含量SPAD 值[10]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；使用SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別對不同紫花苜蓿品種兩種處理第8 天的9 個指標(biāo)進(jìn)行差異性分析、相關(guān)性分析、主成分分析、回歸分析及聚類分析。

單項(xiàng)耐鹽系數(shù)(a) = 鹽脅迫處理值(T) / 正常苗期處理值(CK)。

綜合耐鹽系數(shù)(B) ：

因子權(quán)重系數(shù)：

式中：Ci是第i綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值[11]：

并將其轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的形式；Xi表示i指標(biāo)的平均值；Xmax為所有品種的平均數(shù)據(jù)的最高值；Xmin包 含 多 個 不 同 的 品 種 平 均 最 低 值；i= 1，2，3，…，n。

耐鹽性度量值[11](D)：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同紫花苜蓿品種的耐鹽指標(biāo)測定值分析

對鹽脅迫條件下，80 份紫花苜蓿品種的9 個指標(biāo)進(jìn)行了測定分析(表2)，正常條件下，80 份紫花苜蓿品種變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)介于0.064～0.591，說明試驗(yàn)選用的紫花苜蓿品種遺傳資源豐富，有良好的代表性，能夠滿足試驗(yàn)要求。鹽脅迫條件下，不同紫花苜蓿品種各指標(biāo)的變異系數(shù)范圍介于0.119～0.604，表明鹽處理對紫花苜蓿的這些指標(biāo)產(chǎn)生影響，在不同品種間存在明顯差異。不同紫花苜蓿品種的根長、鮮重、干重和相對組織含水量達(dá)到極顯著差異(P＜ 0.01)，葉寬達(dá)顯著差異(P＜ 0.05)，說明試驗(yàn)中選取的指標(biāo)對鹽脅迫反應(yīng)敏感，滿足試驗(yàn)要求(表2)。此外，不同紫花苜蓿品種9 個指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)在0.027～0.840，說明不同指標(biāo)對鹽脅迫的敏感程度不盡相同，采用單一性狀指標(biāo)評價紫花苜蓿的耐鹽性缺乏可靠性。

表2 80 份紫花苜蓿品種各指標(biāo)測量值及差異分析Table 2 Measurement and difference analysis of various indexes of 80 alfalfa varieties

2.2 單項(xiàng)耐鹽系數(shù)與相關(guān)性分析

同一指標(biāo)的單項(xiàng)耐鹽系數(shù)(a)值在80 份紫花苜蓿品種間存在明顯差異，變異系數(shù)介于0.221～0.834 (表3)。同一品種在9 個指標(biāo)間的a值變化較大，說明各個指標(biāo)的響應(yīng)程度不同(表3)。

表3 紫花苜蓿品種萌發(fā)指標(biāo)單項(xiàng)耐鹽系數(shù)Table 3 Single salt tolerance coefficient for germination indicators of alfalfa varieties

80 份紫花苜蓿品種中，株高與根長、莖粗、鮮重及干重呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜ 0.05)；葉寬與葉厚呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜ 0.01)，系數(shù)為0.392；葉厚與鮮重呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜ 0.05)，葉厚與相對組織含水量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜ 0.01)，系數(shù)為0.295；莖粗與鮮重呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜ 0.05)，與干重呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜ 0.01)，系數(shù)為0.302；鮮重與葉綠素含量、相對組織含水量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜ 0.01)，系數(shù)分別為0.518 和0.347；干重與葉綠素含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜ 0.01)，系數(shù)為0.361 (表4)。結(jié)果表明，不同指標(biāo)間存在一定的相關(guān)性，不能準(zhǔn)確反映紫花苜蓿品種的耐鹽性。

表4 紫花苜蓿品種各指標(biāo)單項(xiàng)耐鹽系數(shù)相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of individual salt tolerance coefficients and various indicators of alfalfa varieties

2.3 主成分分析

由80 份紫花苜蓿品種9 個指標(biāo)的主成分分析結(jié)果可知，各因子特征值中前4 個因子(用F1、F2、F3、F4 表示)的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到68.545%，且特征根值大于1，分別為2.398、1.540、1.182、1.049 (表5)。9 個指標(biāo)轉(zhuǎn)換成4 個相對獨(dú)立的耐鹽指標(biāo)(用F1、F2、F3、F4 表示)，作為紫花苜蓿鹽脅迫的有效成分(表5)。其中，鮮重在F1 主成分中占有較高負(fù)荷；相對組織含水量和根長在F2 主成分中占有較高負(fù)荷；根長在F3 主成分中占有較高負(fù)荷；葉寬在F4 主成分中占有較高負(fù)荷(表5)。由此可見，鮮重、相對組織含水量、根長與葉寬可以作為紫花苜蓿苗期耐鹽評價的主要指標(biāo)。

表5 80 份紫花苜蓿品種各指標(biāo)主成分的特征向量及貢獻(xiàn)率Table 5 Characteristic vector and contribution rate of the main components of each index of 80 alfalfa varieties

2.4 不同紫花苜蓿品種苗期的耐鹽性評價

80 份紫花苜蓿品種的綜合耐鹽系數(shù)(B)介于0.386～1.343，平均值為0.852，變異系數(shù)為0.297 (表6)。依據(jù)B 值結(jié)果排名，耐鹽強(qiáng)的前10 份品種為‘皇后’‘SR4030’ ‘WL168HQ’ ‘WL354HQ’ ‘WL343HQ’ ‘巨能801’ ‘阿迪納’ ‘阿羅拉’ ‘310SC’ ‘游客’。通過隸屬函數(shù)計(jì)算80 份紫花苜蓿品種的耐鹽性度量值(D)得出，D值的范圍在0.336～0.639，平均值為0.506，變異系數(shù)為0.243。依據(jù)D 值結(jié)果排名，耐鹽強(qiáng)的前10 個品種為‘WL354HQ’ ‘阿羅拉’ ‘巨能801’‘WL343HQ’ ‘CENTRAL’ ‘要 塞’ ‘GIBRALTAR’ ‘巨能7’ ‘皇后’ ‘BLUE MOON’。綜合兩種評價方法的排序結(jié)果可見，耐鹽品種為‘WL354HQ’ ‘WL343HQ’‘皇后’ ‘阿羅拉’ ‘巨能801’，兩種方法排序結(jié)果相一致(表6)。

表6 80 份紫花苜蓿耐鹽性隸屬函數(shù)分析Table 6 Membership function analysis of salt tolerance of 80 alfalfa varieties

2.5 回歸分析

根據(jù)B值和D值分析結(jié)果，對80 份紫花苜蓿品種的耐鹽值開展進(jìn)一步的回歸分析。B值各變量的 共 線 性 診 斷 的 膨 脹 因 子(variance inflation factor，VIF)小于5，決定系數(shù)R2值在相對組織含水量處達(dá)到1.000，9 個指標(biāo)間沒有多重共線性，說明在B值水平上，各變量間不失真。D值各變量的共線性診斷的VIF 值小于5，決定系數(shù)R2值在鮮重和相對組織含水量處均達(dá)到1.000，表明D值的回歸分析中，選取的指標(biāo)樣本優(yōu)度更高，數(shù)據(jù)更理想。9 個指標(biāo)間沒有多重共線性，說明在D值水平上，各變量間亦不失真(表7)。進(jìn)一步結(jié)合隸屬函數(shù)法的分析結(jié)果(表6)，B均值變異系數(shù)為0.297，D均值變異系數(shù)為0.243，變異系數(shù)越小，說明代表性越好。綜合來看，耐鹽性度量值(D)可作為紫花苜蓿耐鹽鑒定的適宜方法。

表7 80 份紫花苜蓿品種耐鹽性指標(biāo)的B 值與D 值回歸分析Table 7 Regression analysis of B and D values of salt tolerance indicators in 80 alfalfa varieties

2.6 聚類分析與耐鹽級別的劃分

通過系統(tǒng)聚類分析方法，在歐式平方根距離4.5 處，可以將80 份紫花苜蓿品種分為4 個耐鹽級別(圖1)。結(jié)合耐鹽性度量值排序結(jié)果，可見，第1 級別為強(qiáng)耐鹽級別，包括3 份品種，編號分別為54、83 與136，品 種 為‘WL354HQ’ ‘阿 羅 拉’ ‘巨 能801’，這3 份品種的B值和D值排名也較高(表6)，與上述耐鹽性綜合評價的結(jié)果相一致；第2 級別為較強(qiáng)耐鹽級別，包括28 份品種，編號53 與79 的品種為較強(qiáng)耐鹽級別；第3 級別為較弱耐鹽級別，包括36 份品種；第4 級別為弱鹽級別，共13 份品種。

圖1 基于80 份紫花苜蓿苜蓿品種耐鹽性系統(tǒng)聚類圖Figure 1 Family tree based on salt tolerance of 80 alfalfa varieties

3 討論與結(jié)論

3.1 紫花苜蓿品種耐鹽指標(biāo)篩選

植物耐鹽強(qiáng)弱是受多重因素控制的綜合反應(yīng)的結(jié)果，不同品種間的耐鹽機(jī)制不同，表型也存在較大差異[12]。因而，用單項(xiàng)指標(biāo)難以全面準(zhǔn)確地反映植物品種的耐鹽能力，應(yīng)用多項(xiàng)指標(biāo)綜合評價植物的耐鹽性[13]。張則宇等[4]通過隸屬函數(shù)和相關(guān)性分析、聚類分析對59 份苜蓿種質(zhì)進(jìn)行耐鹽評價及指標(biāo)篩選，認(rèn)為根冠比、葉面積、葉長、莖粗、葉寬、株高、地上生物量、地下生物量和葉綠素含量皆可作為苜蓿耐鹽適宜性評價指標(biāo)。胡亮亮等[14]采用隸屬函數(shù)分析、綜合評價分析與聚類分析對346 份綠豆樣本的耐鹽性進(jìn)行了綜合評價，表明地上部鮮重、根鮮重、根干重、根長、根體積和根分枝數(shù)可以作為綠豆苗期耐鹽性評價指標(biāo)。本研究通過選用株高、葉寬、葉厚、莖粗、根長、鮮重、干重、相對組織含水量及葉綠素含量9 個指標(biāo)評價紫花苜蓿苗期的耐鹽性，結(jié)果表明，鹽脅迫處理對所有紫花苜蓿品種都有脅迫危害，但不同紫花苜蓿品種間的脅迫抗性存在差異。主成分分析結(jié)果將9 個指標(biāo)轉(zhuǎn)換成4 個彼此獨(dú)立的綜合指標(biāo)變量，根據(jù)各指標(biāo)占比系數(shù)可得，鮮重、根長與葉寬可以作為紫花苜蓿苗期耐鹽的主要評價指標(biāo)，與已有研究結(jié)果相一致。

3.2 紫花苜蓿耐鹽性評價分析方法的選用

采用多種統(tǒng)計(jì)分析方法對植物耐鹽性進(jìn)行評價，是構(gòu)建更系統(tǒng)、便捷、科學(xué)的耐鹽評價系統(tǒng)的有效途徑。已有研究選用多種分析方法對大豆(Glycine max)[15]、高 粱(Sorghum bicolor)[16]、水 稻(Oryza sativa)[17]、燕麥(Avena sativa)[18]等資源進(jìn)行了耐鹽性評價，發(fā)現(xiàn)耐鹽性度量值(D)為抗逆性評價的優(yōu)選指標(biāo)。劉彤彤等[19]探究40 份小麥品種芽期和苗期的耐鹽性，利用D值進(jìn)行評價，篩選出芽期耐鹽型品種9 份，苗期耐鹽型品種11 份；芽期和苗期皆耐鹽的品種5 份。李雪等[6]探究59 份紫花苜蓿種質(zhì)萌發(fā)期的耐鹽性，通過綜合耐鹽系數(shù)(B)和D值進(jìn)行耐鹽性評價，并篩選出5 份耐鹽性強(qiáng)的紫花苜蓿種質(zhì)資源。本研究采用B值、D值對80 份紫花苜蓿品種進(jìn)行耐鹽性排序。其中，根據(jù)B值排名結(jié)果，耐鹽性強(qiáng)的前10 個品種依次為‘皇后’ ‘SR4030’ ‘WL168HQ’ ‘WL354HQ’ ‘WL343HQ’‘巨能801’ ‘阿迪納’ ‘阿羅拉’ ‘310SC’ ‘游客’。根據(jù)D值排名結(jié)果，耐鹽性強(qiáng)的前10 個品種依次為‘WL354HQ’ ‘阿 羅 拉’ ‘巨 能 801’ ‘WL343HQ’‘CENTRAL’ ‘要 塞’‘GIBRALTAR’ ‘巨 能7’ ‘皇 后’‘BLUE MOON’。兩種評價方法中均耐鹽的品種為‘WL354HQ’ ‘WL343HQ’ ‘皇 后’ ‘阿 羅 拉’ ‘巨 能801’，結(jié)果吻合。通過回歸分析結(jié)果可知，耐鹽性度量值與綜合耐鹽系數(shù)各指標(biāo)變量間自相關(guān)性不明顯，說明選取指標(biāo)合理，結(jié)合隸屬函數(shù)法的分析結(jié)果(表6)，耐鹽性度量值均值變異系數(shù)更小，說明均值對總體的代表性越好，表明耐鹽性度量值作為紫花苜蓿苗期耐鹽性評價方法更客觀、更可靠。

3.3 紫花苜蓿耐鹽性篩選與評價

紫花苜蓿耐鹽性評價需選擇適宜的鑒定指標(biāo)，耐鹽等級劃分需選用適宜的評價方法，才能正確客觀地反映紫花苜蓿品種的耐鹽能力。本研究通過聚類分析，將80 份紫花苜蓿品種劃分為4 個耐鹽級別，分別為強(qiáng)耐鹽級別、較強(qiáng)耐鹽級別、較弱耐鹽級別和弱耐鹽級別，其中編號為54、83 與136 的品種為強(qiáng)耐鹽級別，分別為‘WL354HQ’ ‘阿羅拉’ ‘巨能801’。與上述B值和D值的排名結(jié)果一致。

綜上，鹽脅迫顯著影響紫花苜蓿苗期的生長。耐鹽性度量值為紫花苜蓿耐鹽評價的適宜方法。鮮重、相對組織含水量、根長與葉寬可作為紫花苜蓿苗期耐鹽評價的主要指標(biāo)。80 份材料中篩選出苗期耐鹽性強(qiáng)的紫花苜蓿品種分別為‘WL354HQ’、‘阿羅拉’與‘巨能801’。