李永強(qiáng)，楊小霞，張京萍，楊艷麗，方強(qiáng)恩

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 / 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室 /中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心, 甘肅 蘭州 730070）

淀粉是植物體內(nèi)具有儲(chǔ)存功能的糖類物質(zhì)，在寒冷脅迫下，植物體內(nèi)水解酶活性大幅提升，促使大量的淀粉加速分解成可溶性糖[1]?？扇苄蕴亲鳛闈B透保護(hù)物質(zhì)，可以通過提高細(xì)胞液的濃度、減緩水分散失和降低細(xì)胞質(zhì)的冰點(diǎn)等方式保護(hù)植物器官[2]。因此，淀粉不僅為植物貯能，也是植物應(yīng)對(duì)寒冷逆境的調(diào)節(jié)物質(zhì)。趙鳳軍和張艷紅[3]對(duì)多種杜鵑花屬(Rhododendron)植物研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)淀粉粒在越冬休眠前積累豐富，越冬休眠期充分水解，休眠解除時(shí)又會(huì)重新積累。董麗等[4]對(duì)多種常綠植物越冬特性的研究也同樣發(fā)現(xiàn)，在秋季植物細(xì)胞中都有較多的淀粉粒分布，冬季觀測(cè)時(shí)淀粉粒消失，到了春季又重新開始積累。大量研究數(shù)據(jù)均表明，儲(chǔ)藏組織中淀粉粒的季節(jié)性動(dòng)態(tài)變化與植物抗寒能力及越冬適應(yīng)節(jié)律具有高度一致性[5-6]。這為從組織化學(xué)角度研究植物越冬抗寒機(jī)制提供了依據(jù)。

苜蓿(Medicago)是奶牛等草食動(dòng)物的重要優(yōu)質(zhì)飼草。發(fā)展苜蓿產(chǎn)業(yè)，對(duì)于調(diào)整種植業(yè)結(jié)構(gòu)、提升草產(chǎn)品和畜產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。西北是我國(guó)苜蓿的主產(chǎn)區(qū)，但是西北大部分地區(qū)，尤其是青藏高原區(qū)，因海拔高、氣溫低等因素導(dǎo)致苜蓿產(chǎn)量降低，越冬率下降，嚴(yán)重影響了苜蓿種植的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益[7-8]。因此，苜蓿的安全越冬問題仍然是目前制約我國(guó)北方苜蓿草地建植、生產(chǎn)與可持續(xù)利用的關(guān)鍵問題[9]。研究高寒區(qū)野生苜蓿屬植物抗寒機(jī)理，挖掘適應(yīng)高寒氣候條件的優(yōu)異種質(zhì)，對(duì)苜蓿抗寒品種選育和高寒區(qū)栽培技術(shù)研究具有重要意義。

矩鐮莢苜蓿(M.archiducis-nicolai)是豆科苜蓿屬多年生野生牧草，別名青海苜蓿、青藏扁蓿豆等[10]，廣泛分布在我國(guó)青海、甘肅、四川、西藏等海拔2 500～3 900 m 的高寒地區(qū)[11]。矩鐮莢苜蓿營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，在青藏高原高寒氣候條件下自然生長(zhǎng)，能在極端低溫條件下安全越冬返青[12]，具有極強(qiáng)的抗寒能力。目前，關(guān)于矩鐮莢苜?？购芰Φ南嚓P(guān)研究較少，其抗寒機(jī)理至今還沒有完全揭示。基于此，本研究通過觀測(cè)矩鐮莢苜蓿地下器官越冬期間的解剖結(jié)構(gòu)與淀粉變化特征，探究其越冬期抗寒能力的變化規(guī)律，旨在進(jìn)一步開展矩鐮莢苜蓿越冬抗寒機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于青藏高原東北緣的武威市天祝藏族自治縣抓喜秀龍鎮(zhèn)(102°79′11″ E, 37°19′67″ N)，平均海拔高度3 022 m, 屬于溫帶大陸性高原季風(fēng)氣候區(qū)。試驗(yàn)地年平均氣溫-0.1 ℃，≥ 0 ℃年積溫1 300℃·d，年日照時(shí)間2 500 h，雨季集中在7 月－9 月，年平均降水量400 mm，年平均蒸發(fā)量1 590 mm。早霜9 月下旬，晚霜4 月下旬，無霜期155 d。土壤主要為高山黑鈣土，土壤pH 7.0～8.2，有機(jī)質(zhì)含量10%～16%，土層厚度40～80 cm[13]。

1.2 試驗(yàn)材料

材料為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)天祝高山草原生態(tài)試驗(yàn)站內(nèi)自然生長(zhǎng)的矩鐮莢苜蓿。根據(jù)采樣地的氣溫變化(圖1)及土壤封凍狀況將矩鐮莢苜蓿的越冬過程劃分為3 個(gè)時(shí)期(表1)，分別為越冬前期(9 月－11 月)、越冬中期(11 月－3 月)和越冬后期(3 月－5 月)。

表1 不同取樣時(shí)期氣溫Table 1 Ambient temperatures during the different sampling periods

圖1 試驗(yàn)地氣溫變化Figure 1 Changes in ambient temperature at the test site

低溫變化是影響植物休眠態(tài)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵，因此，在矩鐮莢苜蓿越冬前期設(shè)置2 次取樣(分別為9 月8 日：日均溫度10 ℃以上取樣一次；10 月21 日：溫度0～5 ℃，植物受到冷脅迫時(shí)取樣一次)、越冬中期設(shè)置2 次取樣(分別為11 月25 日：樣地日均溫度降低至0 ℃以下，土壤開始封凍時(shí)取樣一次；12 月27 日：最低氣溫降到-10 ℃以下，植株受到凍脅迫時(shí)取樣一次)、越冬后期設(shè)置2 次取樣(3 月24 日氣溫回升到0 ℃以上時(shí)取樣一次；5 月5 日日均溫度5 ℃以上，植物開始返青時(shí)取樣一次)。對(duì)試驗(yàn)地與材料進(jìn)行調(diào)查與鑒定后，在矩鐮莢苜蓿株叢隨機(jī)選取生長(zhǎng)狀況良好的植株，以單株矩鐮莢苜蓿為中心，在50 cm × 50 cm 的范圍內(nèi)，由外向內(nèi)逐漸剖開、向下直到矩鐮莢苜蓿地下器官分布的最底層，再向一側(cè)跟蹤性挖取地下器官。重復(fù)此操作，挖取10 株完整的矩鐮莢苜蓿。另外，在矩鐮莢苜蓿生長(zhǎng)期(7 月2 日)取樣一次作為對(duì)照。

1.3 試驗(yàn)方法及分析

參考楊小霞等[14]的試驗(yàn)方法，將挖取的材料用蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸干地下部分水分后，分開地下器官的根、根頸和地下莖，分別切取5 mm 左右長(zhǎng)的段各10 段放入FAA 溶液(70%乙醇溶液 ∶ 冰乙酸 ∶ 福爾馬林 = 18 ∶ 1 ∶ 1)中固定，抽真空使試驗(yàn)材料下沉瓶底，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

將材料固定48 h 后，采用常規(guī)的石蠟制片法制片。經(jīng)乙醇梯度脫水、透明、浸蠟、包埋等過程后，使用自動(dòng)切片機(jī)進(jìn)行切片，厚度范圍8～12 μm，粘片后，恒溫37 ℃烘片36 h。使用番紅－固綠法對(duì)矩鐮莢苜蓿地下器官的不同部分組織染色，使用高碘酸－席夫反應(yīng)法(PAS 法)對(duì)地下器官組織淀粉粒進(jìn)行染色，淀粉顆粒在堿性品紅染色下呈紫紅色，最后使用中性樹膠封片。在Motic Panthera U 生物顯微鏡下進(jìn)行觀察，辨別矩鐮莢苜蓿的地下器官淀粉儲(chǔ)存部位，每個(gè)部位隨機(jī)選取5 個(gè)視野，每個(gè)視野選取3 個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)其淀粉顆粒數(shù)量，記錄并拍照。利用SPSS 26.0 對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)計(jì)算處理，Origin 2018 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 矩鐮莢苜蓿地下器官的解剖結(jié)構(gòu)比較

矩鐮莢苜蓿越冬根的解剖結(jié)構(gòu)(圖2A)顯示，根由外向內(nèi)主要由周皮和維管柱構(gòu)成。其中，周皮較厚，木栓層極發(fā)達(dá)。栓內(nèi)層由6～7 層薄壁細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞較薄壁細(xì)胞大且密集。木質(zhì)部占據(jù)維管柱大部分，導(dǎo)管極多，木質(zhì)部極發(fā)達(dá)。導(dǎo)管排列緊密，中部導(dǎo)管直徑較大，木射線明顯。

圖2 矩鐮莢苜蓿根、根頸和地下莖的解剖結(jié)構(gòu)Figure 2 Anatomical structure of the root, crown, and rhizome tissues of Medicago archiducis-nicolai

矩鐮莢苜蓿越冬根頸解剖結(jié)構(gòu)(圖2B)在組成上與根相似，由周皮和維管柱組成，但根頸在維管柱中央具有完整的髓。與根周皮相比，根頸周皮外部的木栓層更加發(fā)達(dá)，且具有栓內(nèi)層薄壁組織。栓內(nèi)層位于周皮和維管柱之間，由多層體積較大的薄壁細(xì)胞組成，整體較厚，細(xì)胞排列疏松，有明顯的細(xì)胞間隙。根頸維管柱內(nèi)木質(zhì)部導(dǎo)管排列較規(guī)則，呈輻射狀向外延伸，導(dǎo)管較小，且數(shù)量少于根木質(zhì)部。木質(zhì)部薄壁細(xì)胞分布在木質(zhì)部導(dǎo)管之間，數(shù)量較多。

矩鐮莢苜蓿越冬地下莖的解剖結(jié)構(gòu)(圖2C)與根頸相同。周皮較厚，木栓層細(xì)胞呈磚形，排列緊密。栓內(nèi)層由3～4 層薄壁細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞排列稀疏，有胞間隙。與根頸不同的是，地下莖木質(zhì)部導(dǎo)管散亂分布，導(dǎo)管大小極不規(guī)則，維管柱內(nèi)髓狹長(zhǎng)，有裂隙。

2.2 矩鐮莢苜蓿越冬時(shí)期根組織結(jié)構(gòu)中的淀粉粒變化

矩鐮莢苜蓿根組織中淀粉粒主要分布在栓內(nèi)層與木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中，淀粉粒數(shù)均在9 月上旬積累至最高，其中栓內(nèi)層細(xì)胞淀粉粒數(shù)較多，且對(duì)低溫變化較敏感(圖3)。11 月下旬，在越冬期開始時(shí)，根栓內(nèi)層淀粉數(shù)驟降至較低水平，并在12 月下旬降至最低(圖3)。木質(zhì)部薄壁細(xì)胞淀粉粒數(shù)也在越冬期開始時(shí)下降，越冬中期降至最低(圖3)。越冬后期，根淀粉粒又逐漸開始積累(圖3)。不同于根頸與地下莖的是(圖3)，根木質(zhì)部薄壁細(xì)胞可以積累更多的淀粉粒數(shù)，且對(duì)溫度的變化更為敏感(圖3)。此外，矩鐮莢苜蓿地下器官細(xì)胞內(nèi)淀粉多為4～8 粒淀粉顆粒聚集在一起，整體集中呈團(tuán)狀(圖4、圖5、圖6)。切片顯示(圖4)，根越冬前期細(xì)胞內(nèi)淀粉粒較大，分布密集，積累成較大的團(tuán)狀。越冬中期前后，淀粉粒較小，分布散亂。

圖3 矩鐮莢苜蓿根、根頸和地下莖組織結(jié)構(gòu)不同部位細(xì)胞淀粉數(shù)量的變化Figure 3 Changes in the number of cell starches in different parts of Medicago archiducis-nicolai root, crown, and rhizome tissue structures

圖4 矩鐮莢苜蓿根組織淀粉積累變化Figure 4 Changes in starch accumulation in Medicago archiducis-nicolai root tissues

圖5 矩鐮莢苜蓿根頸組織淀粉積累變化Figure 5 Changes in starch accumulation in Medicago archiducis-nicolai crown tissues

圖6 矩鐮莢苜蓿地下莖組織淀粉積累變化Figure 6 Changes in starch accumulation in Medicago archiducis-nicolai rhizome tissues

2.3 矩鐮莢苜蓿越冬時(shí)期根頸組織結(jié)構(gòu)中的淀粉粒變化

矩鐮莢苜蓿根頸組織內(nèi)淀粉主要分布于髓與栓內(nèi)層薄壁細(xì)胞中，少量分布于木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中(圖3)。越冬前期，髓與栓內(nèi)層的淀粉粒積累量逐漸下降，在越冬中期達(dá)到最低水平。其中，栓內(nèi)層淀粉粒數(shù)量下降較快，在12 月下旬，先于髓、木質(zhì)部到達(dá)最低點(diǎn)；相比于髓細(xì)胞，栓內(nèi)層對(duì)低溫的變化更敏感。木薄壁細(xì)胞在越冬前期與越冬中期開始時(shí)，對(duì)溫度變化不敏感，淀粉粒數(shù)量無明顯變化。在3 月下旬，越冬中期結(jié)束時(shí)，淀粉粒數(shù)下降至最低水平。根頸髓、木質(zhì)部、栓內(nèi)層均在越冬后期開始積累淀粉粒，淀粉粒數(shù)在5 月上旬顯著增加。切片顯示(圖5)，各地下器官在生長(zhǎng)期、越冬前期及越冬后期結(jié)束時(shí)，均貯存有較大的淀粉顆粒，且分布密集。越冬后期開始時(shí)，淀粉粒數(shù)量總體最少，淀粉顆粒最小。

2.4 矩鐮莢苜蓿越冬時(shí)期地下莖組織結(jié)構(gòu)中的淀粉粒變化

矩鐮莢苜蓿地下莖內(nèi)淀粉粒主要分布在栓內(nèi)層與髓薄壁細(xì)胞中，部分分布于木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中，且其數(shù)量在生長(zhǎng)期維持在較低水平(圖3)。地下莖的淀粉在越冬前期持續(xù)積累，越冬前期開始時(shí)，淀粉數(shù)量明顯提升，10 月下旬達(dá)到最高。越冬中期開始時(shí)，淀粉粒數(shù)驟降至最低點(diǎn)，淀粉幾乎消失，在整個(gè)越冬中期的較長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)，保持在最低水平，持續(xù)至越冬期完全結(jié)束，直到越冬后期，開始少量積累淀粉。與根頸在越冬前期各組織淀粉數(shù)量較多，積累量大，數(shù)量隨溫度變化而變化的狀況不同，地下莖在氣溫未達(dá)到冰點(diǎn)的越冬前期持續(xù)積累淀粉，越冬中期開始之前達(dá)到最高。切片顯示(圖6)，在越冬前期，矩鐮莢苜蓿地下莖內(nèi)淀粉粒最大，生長(zhǎng)期淀粉粒相對(duì)較小，越冬后期細(xì)胞內(nèi)淀粉粒最小，越冬中期幾乎無明顯淀粉粒。

3 討論

3.1 矩鐮莢苜蓿根頸和地下莖的解剖結(jié)構(gòu)與功能

目前，關(guān)于苜蓿根頸的定義及其屬性的說法較多且不一致[15]。通常認(rèn)為，苜蓿近地面上的根冠部稱為根頸，由真葉以下的胚軸發(fā)育而來[16]。張寶田等[17]認(rèn)為紫花苜蓿根頸是聯(lián)系地上部分和根系的關(guān)鍵部位，可能屬于根與莖的過渡區(qū)。杜寶紅[18]研究了花苜蓿(M.ruthenica)根頸形態(tài)解剖特征，認(rèn)為花苜蓿的根頸就是根的最上端部分。本研究通過解剖觀察發(fā)現(xiàn)，矩鐮莢苜蓿根頸組織中，內(nèi)部具有發(fā)達(dá)的髓，外部具有周皮，與根結(jié)構(gòu)不完全相同，應(yīng)該是變態(tài)的地下莖。通常情況下，植物淀粉粒主要貯存于髓、皮層等薄壁組織中[19]。發(fā)達(dá)的髓組織使根頸產(chǎn)生了重要的養(yǎng)分貯備能力。

本研究中，矩鐮莢苜蓿具有發(fā)達(dá)的地下莖，其解剖結(jié)構(gòu)組成與根頸基本相同。前期研究發(fā)現(xiàn)，地下莖是矩鐮莢苜蓿不同于其近緣種的重要的營(yíng)養(yǎng)繁殖器官，具有極強(qiáng)的地下擴(kuò)展能力[20]。為了應(yīng)對(duì)寒冷和干旱環(huán)境，矩鐮莢苜蓿地下莖可以產(chǎn)生內(nèi)、外周皮，在極端寒旱環(huán)境下，地下莖會(huì)通過外周皮內(nèi)卷或內(nèi)周皮外拓發(fā)生分裂[21]。在本研究中，矩鐮莢苜蓿地下莖和根頸相似，與根相比除了具有栓內(nèi)層薄壁組織外，還具有發(fā)達(dá)的髓(圖2C)。在越冬過程，髓與栓內(nèi)層薄壁組織會(huì)貯存大量淀粉(圖5、圖6)，這表明地下莖是矩鐮莢苜蓿兼具擴(kuò)展、繁殖、貯藏等功能的特殊器官。

3.2 矩鐮莢苜蓿越冬時(shí)期地下器官淀粉變化與抗寒性分析

低溫環(huán)境下，植物組織中的可溶性糖含量升高是一個(gè)普遍現(xiàn)象[22]。越冬前后植物細(xì)胞內(nèi)淀粉數(shù)量會(huì)隨溫度變化而變化[23]，淀粉的水解不僅可以為地下器官提供能量和營(yíng)養(yǎng)，且有利于可溶性糖、蛋白質(zhì)等抗寒相關(guān)物質(zhì)的合成，提高植物的抗寒能力[24]?？扇苄蕴桥c淀粉互相轉(zhuǎn)化，二者存在動(dòng)態(tài)平衡[25]。本研究結(jié)果也表現(xiàn)出相同的規(guī)律。在本研究中，矩鐮莢苜蓿根、根頸與地下莖在越冬前后的淀粉數(shù)均呈現(xiàn)出先減少后增加變化趨勢(shì)，其中地下莖淀粉數(shù)在越冬前期仍有一定增加，但各器官淀粉數(shù)量在同一時(shí)期始終維持較為相近的水平，與溫度變化趨勢(shì)基本一致，且不同組織部位淀粉數(shù)的變化趨勢(shì)也基本一致。這表明矩鐮莢苜蓿在寒冷環(huán)境中可以通過轉(zhuǎn)化地下器官各組織中的淀粉來提高自身的抗寒能力，從而安全越冬。

北溫帶多年生植物在冬季越冬過程中通常會(huì)休眠，這是植物為抵抗寒冷等逆境而產(chǎn)生的一種生理現(xiàn)象[26]。前人研究發(fā)現(xiàn)，植物組織中淀粉的變化與休眠狀態(tài)的發(fā)生有關(guān)[3]。植物在秋季感應(yīng)到溫度降低、日照時(shí)長(zhǎng)變短信號(hào)后，會(huì)停止地上部分的生長(zhǎng)，進(jìn)入休眠準(zhǔn)備階段。對(duì)草本植物而言，此時(shí)會(huì)將地上養(yǎng)分向地下轉(zhuǎn)移，以淀粉的形式儲(chǔ)存在地下器官中，為其越冬提供能量?jī)?chǔ)備[27-28]。隨著休眠狀態(tài)的不斷加深，儲(chǔ)藏器官中的大量淀粉會(huì)發(fā)生水解，植物的越冬抗寒能力不斷增強(qiáng)，當(dāng)植物進(jìn)入深度休眠后，淀粉貯存量也達(dá)到最低，大部分淀粉分解為可溶性糖，以積極應(yīng)對(duì)嚴(yán)冬下的寒冷脅迫[24]。從休眠態(tài)變化的角度分析本研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)矩鐮莢苜蓿地下器官根、根頸、地下莖在越冬期都會(huì)發(fā)生休眠，但是不同器官進(jìn)入深度休眠的時(shí)間存在差別(圖3)。地下莖在最低氣溫降至0 ℃時(shí)(圖1)淀粉分解才開始啟動(dòng)，但在之后短短的一個(gè)月內(nèi)淀粉便全部分解，在嚴(yán)冬到來之前很快進(jìn)入深度休眠，而且相比較于根和根頸，地下莖深度休眠持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，休眠解除非常緩慢。根和根頸薄壁組織內(nèi)儲(chǔ)藏的淀粉都是在嚴(yán)冬期才全部分解完，表明二者在冬季溫度最低時(shí)進(jìn)入深度休眠，不同的是，根頸早在7 月之后氣溫下降之初便開始分解淀粉，而根在最低氣溫降至5 ℃時(shí)(圖1、圖3)淀粉才開始分解。三者深度休眠起始時(shí)間的差異表明，地下莖對(duì)冬季低溫脅迫最敏感，抗寒力獲得時(shí)間最早且最持久。地下莖不僅是矩鐮莢苜蓿重要的養(yǎng)分儲(chǔ)藏器官，地下莖中產(chǎn)生的數(shù)量豐富的根莖芽是越冬后再生苗的主要來源[14]，所以地下莖持久的抗寒力是矩鐮莢苜蓿成功越冬和翌年返青更新生長(zhǎng)的重要保障。此外，由于青藏高原海拔高，氣候嚴(yán)酷多變，晝夜溫差大，矩鐮莢苜蓿地下器官抗寒力形成的不同步性，可能也是該植物應(yīng)對(duì)高寒環(huán)境的適應(yīng)性策略。

4 結(jié)論

矩鐮莢苜蓿地下器官的淀粉主要分布在栓內(nèi)層與髓薄壁細(xì)胞中，根頸與根內(nèi)淀粉粒分布較為密集；越冬前期，淀粉粒在各地下器官均有明顯的積累，低溫變化下，淀粉發(fā)生水解，逐漸減少至消失。氣溫回升后，淀粉數(shù)量開始增加。各地下器官中的淀粉數(shù)量在越冬前后的變化與氣溫變化趨勢(shì)基本一致，總體呈現(xiàn)出先減少后增加的變化規(guī)律；矩鐮莢苜蓿地下器官越冬期抗寒力的形成具有不同步性，且根頸對(duì)溫度變化響應(yīng)最快，地下莖對(duì)低溫變化最為敏感；矩鐮莢苜蓿地下莖是兼具擴(kuò)展、繁殖、貯藏與抗寒等能力的特殊器官。