肖凡凱,王琳,楊帆

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院:1腫瘤科,2互聯(lián)網(wǎng)醫(yī)療系統(tǒng)與應(yīng)用國家工程實(shí)驗(yàn)室,3心血管內(nèi)科,鄭州 450052)

食管癌是全球第八最常見的癌癥,在腫瘤引發(fā)死亡率中居世界第六位[1]。食管鱗狀細(xì)胞癌是食管癌最常見的組織學(xué)類型,約占所有食管癌的90%[2]。中國食管癌發(fā)病率高,且人口眾多,世界范圍內(nèi)約有一半的新增食管癌病例發(fā)生在我國[3]。盡管治療方法在不斷更新,但食管癌患者5年生存較差,分子機(jī)制病因尚不清楚,從以往的流行病學(xué)研究來看,基因?qū)κ彻馨┑陌l(fā)展有重要影響。為了提高食管癌患者的總生存率,驗(yàn)證預(yù)后因素和評(píng)估新的診斷生物標(biāo)志物是非常必要的。近年來,單克隆抗體特別是免疫調(diào)節(jié)劑在各種癌癥治療和生存分析中發(fā)揮了潛在的作用。CD27是記憶B細(xì)胞的標(biāo)志物,是腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)超家族之一[4]。CD27和CD70之間的相互作用,可以共同刺激T細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。根據(jù)最近學(xué)術(shù)研究,骨髓瘤細(xì)胞中CD27的異常表達(dá)可能與腫瘤的生存階段有關(guān)[5]。與此類似,急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)和慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)患者也表現(xiàn)出CD27的組成性表達(dá)[6,7]。然而,CD27在實(shí)體瘤的研究報(bào)道較少,關(guān)于食管癌患者CD27表達(dá)水平的研究更是十分有限。因此,本研究旨在探討CD27在食管癌中表達(dá)及其潛在的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),研究CD27作為預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的相關(guān)性,為食管癌的診斷和治療提供新的生物標(biāo)志物及診斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 CD27的mRNA表達(dá)分析

基于基因表達(dá)水平值的交互式分析平臺(tái)(gene expression profiling interactive analysis, GEPIA)使用來自基因型組織表達(dá)和癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)項(xiàng)目的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行各種腫瘤類型的預(yù)后分析、單基因分析、多基因分析和可視化分析。GEPIA根據(jù)用戶定義的樣本選擇和方法動(dòng)態(tài)繪制給定基因的表達(dá)譜。結(jié)果可以以點(diǎn)圖(在“profile”選項(xiàng)卡中)或框圖(在“Boxplot”選項(xiàng)卡中)的形式呈現(xiàn)。此外,GEPIA在TCGA臨床注釋的基礎(chǔ)上按病理分期繪制基因表達(dá)。利用GEPIA的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)進(jìn)一步分析CD27 mRNA在GEPIA中的表達(dá)模式。

1.2 CD27與食管癌相關(guān)生存分析

GEPIA基于基因表達(dá)水平進(jìn)行生存分析。該功能允許用戶選擇他們自定義的癌癥類型進(jìn)行總體或無病生存分析?；赥CGA數(shù)據(jù)庫,利用GEPIA分析CD27在食管癌和頭頸部鱗癌預(yù)后中的相關(guān)性,總生存期為評(píng)估指標(biāo),做Kaplan-Meier曲線,P<0.05,則認(rèn)為其具有預(yù)后價(jià)值。

1.3 CD27通路富集及相關(guān)激酶分析

利用cBioportal(https://www.cbioportal.org/)一個(gè)開放公共的資源,用于研究、可視化和分析多維腫瘤基因組數(shù)據(jù),目前包含225項(xiàng)腫瘤研究。Linkedomics(http://www.linkedomics.org/)是用Linked Omics的Link Finder模塊研究TCGA食管癌隊(duì)列中與CD27相關(guān)的表達(dá)差異基因,結(jié)果采用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有的結(jié)果都在火山圖、熱圖或散點(diǎn)圖中以圖形形式表現(xiàn)出來。并進(jìn)行基因本體(細(xì)胞組分、通路分析、分子功能)、京都基因與基因組百科全書通路分析。

2 結(jié) 果

2.1 CD27表達(dá)差異的比較

在GEPIA數(shù)據(jù)庫分析中,為了探討食管癌中CD27表達(dá)情況,本研究分析了CD27在癌與癌旁及不同分期的表達(dá),結(jié)果顯示CD27在食管癌組織中的表達(dá)明顯高于鄰近正常組織(圖1A),CD27在食管癌不同分期表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)。

圖1 CD27在食管癌與癌旁組織表達(dá)情況及在食管癌不同分期的表達(dá)情況Figure 1 Expression of CD27 cancer in different stages of esophageal cancer and adjacent tissuesA: cancer and adjacent tissues; B: different stages. ESCA: esophageal carcinoma.

2.2 CD27突變及其相關(guān)基因熱圖

為了研究CD27在食管癌中的突變,本課題通過cBio-Portal依據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫食管癌患者的RNA測(cè)序情況,發(fā)現(xiàn)1915例食管癌患者中有40例(2.1%)患者的CD27發(fā)生了突變,其中包含錯(cuò)義突變、擴(kuò)增和深度缺失,擴(kuò)增在所有突變中所占比例較大,是最常見的突變類型(圖2A)。同時(shí)使用Pearson相關(guān)性分析列出了食管癌中CD27共表達(dá)基因情況,與CD27正相關(guān)基因標(biāo)記為紅色,負(fù)相關(guān)基因標(biāo)記為綠色,這些基因參與多種信號(hào)通路(圖2B)。為了進(jìn)一步明確基因與CD27共表達(dá)的正負(fù)相關(guān)性,依據(jù)熱圖顯示前50例與CD27正負(fù)相關(guān)基因(圖3A,B)。3A與3B的基因排名依據(jù)的是標(biāo)準(zhǔn)分?jǐn)?shù)(Z-score),分?jǐn)?shù)范圍-3～+3。

圖2 CD27在食管癌中的突變及相關(guān)基因Figure 2 Genetic alteration of CD27 and its related genes in esophageal cancerA: CD27 alteration in esophageal cancer B: CD 27 and its related genes.

圖3 CD27在食管癌的Go功能富集分析與相關(guān)酶分析Figure 3 CD27 functional enrichment analysis and related enzyme analysis in esophageal cancerA: CD27 pathway enrichment; B: CD27 and its related enzyme.

2.3 CD27在食管癌功能和通路分析

在linkedomics數(shù)據(jù)庫中,對(duì)篩選到的CD27的功能進(jìn)行了評(píng)估(圖4A,B)。在參與的生物學(xué)過程分析中,這些通路主要富集于雷帕霉素復(fù)合物(target of rapamycin complex 1,TORC1)信號(hào)通路、細(xì)胞對(duì)亮氨酸的反應(yīng)和雷帕霉素(target of rapamycin,TOR)信號(hào)通路調(diào)節(jié)(圖4A)。通過激酶分析,主要富集途徑為KIT原癌基因受體酪氨酸激酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體1和G蛋白偶聯(lián)受體激酶3(圖4B)。

圖4 CD27在食管癌的相關(guān)性基因熱圖Figure 4 Hallmark gene set activity changes across the TCGA esophageal cancer patients with low or high expressionA: heat maps showing genes positively related with CD27 in esophageal cancer; B: CD27 and its negative correlated genes in esophageal caner. TCGA: the cancer genome atlas.

2.4 CD27與食管鱗癌及頭頸部鱗癌生存分析

為了進(jìn)一步研究TCGA數(shù)據(jù)庫中CD27與食管鱗癌與頭頸部鱗癌生存關(guān)系,本課題通過GEPIA中TCGA數(shù)據(jù)做出CD27在食管癌中與頭頸部鱗癌的預(yù)后分析。結(jié)果顯示,雖然食管癌組CD27對(duì)總生存沒有顯著影響,但高表達(dá)組的總生存較好(圖5A),頭頸部鱗癌組中CD27低表達(dá)與總生存時(shí)間縮短顯著相關(guān)(P<0.05;圖5B)。

圖5 CD27表達(dá)高低與食管癌及頭頸部鱗癌的生存關(guān)系Figure 5 Relationship between CD27 expression and 2 types of cancer survivalA: CD27 and esophageal cancer; B: CD27 and head ,neck squamous cell carcinoma.

3 討 論

食管癌是最常見的癌癥之一,在世界范圍內(nèi)的5年生存率很低。免疫療法是一種增強(qiáng)或再生免疫系統(tǒng)以發(fā)現(xiàn)并摧毀腫瘤細(xì)胞的治療方法。最近,對(duì)可能用于癌癥免疫治療的生物標(biāo)志物的研究有所增加[8]。根據(jù)早期的研究,CD27可能會(huì)成為癌癥免疫治療中最可選的新靶點(diǎn)之一[9,10]。基于TCGA數(shù)據(jù)庫,本研究發(fā)現(xiàn),CD27在食管癌中突變率為2.1%(40/1915),在食管癌和鄰近正常組織mRNA表達(dá)評(píng)估中,CD27在食管癌組織中顯著高表達(dá)。本研究的相關(guān)熱圖基因與CD27相互作用可能與不同腫瘤相關(guān),例如有研究顯示,LAX1與CD27被列入與乳腺癌HER2陽性預(yù)后相關(guān)基因[11]。TOR復(fù)合物在CD27及其相關(guān)基因通路富集中具有重要功能。近年來,TOR信號(hào)通路的靶點(diǎn)已發(fā)展到將營(yíng)養(yǎng)感知與細(xì)胞發(fā)育聯(lián)系起來,并且在真核生物中高度保守。在細(xì)胞中,TOR存在于TORC1和TORC2中,這是兩種不同的信號(hào)復(fù)合物[12]。這些復(fù)合物受到多種調(diào)控,并作為多種細(xì)胞功能的信號(hào)效應(yīng)器,包括蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞骨架重組、自噬、代謝和存活。哺乳動(dòng)物雷帕霉素(mammalian target of rapamycin,mTOR)在胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用,并與成年物種的衰老和長(zhǎng)壽效應(yīng)有關(guān)。mTOR通路參與了人類幾種不同癌癥類型的發(fā)展,其失調(diào)與家族性癌癥綜合征有關(guān)[13,14]。

在人類中,CD27僅在淋巴系中通過T、B和NK細(xì)胞及其直接前體表達(dá)。重要的是,CD27已經(jīng)存在于初始CD4+和CD8+T細(xì)胞中,大多數(shù)其他共刺激腫瘤壞死因子僅在T細(xì)胞激活后合成。激活后,初始CD4+和CD8+T細(xì)胞會(huì)短暫上調(diào)CD27的表達(dá)[15]。活化的T細(xì)胞以蛋白水解的方式從細(xì)胞表面脫落CD27,從而產(chǎn)生循環(huán)可溶性CD27,可作為T細(xì)胞活化的診斷標(biāo)記物[16]。終末分化效應(yīng)CD8+T細(xì)胞丟失CD27,而長(zhǎng)壽的中樞記憶細(xì)胞保留CD27。在小鼠模型中,已經(jīng)通過多種研究評(píng)估了CD27激動(dòng)劑促進(jìn)癌癥免疫的功效。在B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞上轉(zhuǎn)基因表達(dá)CD27的小鼠中,針對(duì)攜帶外源抗原的EL-4淋巴瘤[17]和B16黑色素瘤[18],以及親代腫瘤的抗腫瘤免疫功能均得到提高[19]。用小鼠CD27的激動(dòng)性單抗治療小鼠,同樣提高了對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤和B細(xì)胞淋巴瘤以及黑色素瘤的抗腫瘤免疫[20]。近年來,許多學(xué)者對(duì)CD70-CD27信號(hào)軸產(chǎn)生了興趣,早期報(bào)道發(fā)現(xiàn),盡管在正常漿細(xì)胞中可以看到CD27的表達(dá),但隨著多發(fā)性骨髓瘤的進(jìn)展,CD27的表達(dá)會(huì)急劇下降,但CD27和CD70轉(zhuǎn)染物共培養(yǎng)并不會(huì)通過CD27-CD70信號(hào)軸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。一項(xiàng)研究顯示,在TCGA數(shù)據(jù)庫中,CD27表達(dá)下調(diào)與頭頸部鱗癌預(yù)后不良相關(guān)[22]。通過TCGA數(shù)據(jù)庫檢測(cè)CD27與食管癌患者總生存率的關(guān)系,結(jié)果顯示,雖然差異不顯著,但CD27低表達(dá)的患者預(yù)后比CD27高表達(dá)的患者差,與先前報(bào)道相似[22],CD27低表達(dá)與頭頸部鱗癌總生存期降低顯著相關(guān)。

本研究結(jié)果表明,不同水平的CD27在食管癌中的表達(dá)對(duì)TOR復(fù)合物、多種激酶(KIT原癌基因受體酪氨酸激酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體1和G蛋白偶聯(lián)受體激酶3)以及細(xì)胞膜有一定影響,未來應(yīng)注重研究CD27在食管癌表達(dá)中對(duì)原癌基因受體的影響,并探討潛在機(jī)制。本研究局限性如下:TCGA有關(guān)食管癌總生存和CD27測(cè)序的樣本量較小,需要在人群中擴(kuò)大樣本量,減小誤差,以確認(rèn)這些生物標(biāo)志物的可行性。

綜上,本研究通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)CD27在食管癌中差異表達(dá)與通路和激酶密切相關(guān),發(fā)現(xiàn)CD27可能被認(rèn)為是一種新的潛在生物標(biāo)志物,未來有望投入食管癌靶向治療的臨床應(yīng)用。