徐敏,周金,范冶,徐飛

(湖南省腦科醫(yī)院:1病理科,2檢驗(yàn)科,長(zhǎng)沙 410007)

鼻咽癌即發(fā)生于鼻咽腔頂部及側(cè)壁的惡性腫瘤,具有較高的發(fā)生率[1]。目前放療是治療鼻咽癌的首選方式,伴隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步,患者的臨床癥狀及預(yù)后均有較好的改善,但治療后仍具有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[2,3]。Kruppel樣因子5(Kruppel-like factor 5,KLF5)、Kruppel樣因子9(Kruppel-like factor 9,KLF9)屬于Kruppel樣因子家族成員,屬于鋅指型轉(zhuǎn)錄因子的一種,可參與至多種生物學(xué)過(guò)程中,如細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移以及胚胎發(fā)育等過(guò)程中,目前已證實(shí)KLF5、KLF9在食管癌[4]、子宮內(nèi)膜癌[5]、肺癌[6]等惡性腫瘤中均有表達(dá)。同時(shí)亦有證據(jù)指出喉癌患者癌組織中KLF5表達(dá)與喉癌的病情、復(fù)發(fā)等關(guān)系密切[7]。然而關(guān)于癌組織中KLF5、KLF9表達(dá)與老年鼻咽癌患者復(fù)發(fā)間的關(guān)系尚不清晰。本研究對(duì)老年鼻咽癌患者癌組織中KLF5、KLF9進(jìn)行檢測(cè),并分析KLF5、KLF9與患者治療后復(fù)發(fā)間的關(guān)系,期望為此類(lèi)患者的治療及預(yù)后改善提供幫助。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2016年5月至2018年5月湖南省腦科醫(yī)院收治的263例老年鼻咽癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理檢查證實(shí)為鼻咽癌;(2)年齡≥60歲;(3)各項(xiàng)臨床資料信息完善。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往有治療史,如放療、化療、靶向治療等;(2)存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;(3)治療前經(jīng)評(píng)估存活時(shí)間不足3個(gè)月;(4)近期有重大外科手術(shù)治療史或未得到控制的全身感染;(5)合并血液系統(tǒng)疾病或自身免疫性疾病;(6)入院時(shí)存在嚴(yán)重的心、肝、腎功能異常。

1.2 方法

1.2.1 信息收集 所有患者均在入院3d內(nèi)及治療結(jié)束后收集基礎(chǔ)資料信息,包括性別、年齡、國(guó)際抗癌聯(lián)盟(union for international cancer control,UICC)分期、病理類(lèi)型、療程延長(zhǎng)時(shí)間、放療劑量、是否放療聯(lián)合化療、是否鼻腔受侵、是否口咽受侵、是否顱底骨質(zhì)受侵、是否顱內(nèi)受損、是否顱神經(jīng)損傷。

1.2.2 治療方法 患者入院后均接受放射治療,完成定位后常規(guī)行外照射,劑量63～88Gy,頸部預(yù)防照射劑量50～54Gy。其中T3～4、N2～3、M0期患者接受4個(gè)周期的化療治療,順鉑(生產(chǎn)單位:山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,國(guó)準(zhǔn)藥字:H20046375,規(guī)格:10mg)75mg/m2,靜脈滴入,1次/d,5-氟尿嘧啶(生產(chǎn)單位:西安海欣制藥有限公司,國(guó)準(zhǔn)藥字:H20050511,規(guī)格:0.25g)500mg/m2,靜脈滴入,1次/d。

1.2.3 Western blotting 待檢瘤體經(jīng)勻漿機(jī)處理后離心,棄上清,加人含有1%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的放射免疫共沉淀試劑(radio immunoprecipitation assay, RIPA;上海碧云天生物技術(shù)有限公司)1000μl,二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)法檢測(cè)蛋白含量。蛋白變性后每孔上樣30μg,經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì),隨后在300mA的恒定電流下將蛋白電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluoride, PVDF)膜(Millipore, Bedford, MA, USA)上。用5%脫脂奶粉將膜封閉1h后,加入一抗KLF5(1∶1000, ab137676,Abcam,MA,USA),抗KLF9(1∶1000,ab313447,Abcam,MA,USA),抗β-actin(1∶1000,ab6276,Abcam,MA,USA)于4℃孵育過(guò)夜,常規(guī)洗滌,加二抗室溫孵育60min,再用含Tween的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液(tris-buffered saline with Tween, TBST)洗膜4次,每次8min。采用Thermo公司的增強(qiáng)型底物化學(xué)發(fā)光(enhancedchemiluminescence, ECL) Western blotting Substrate試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)進(jìn)行X光顯影。

1.2.4 院外隨訪 所有患者治療結(jié)束后均行5年院外隨訪,均通過(guò)電話或門(mén)診復(fù)查的方式隨訪,若電話無(wú)法接通則1周后再次隨訪。第1年每3個(gè)月隨訪1次,后續(xù)每6個(gè)月隨訪1次,

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組老年鼻咽癌患者基礎(chǔ)資料信息比較

263例老年鼻咽癌患者治療結(jié)束后行5年院外隨訪,復(fù)發(fā)患者共27例(10.27%)。與非復(fù)發(fā)組患者相比,復(fù)發(fā)組患者UICC分期Ⅲ～Ⅳ期、未行放療聯(lián)合化療、顱底骨質(zhì)受侵、顱神經(jīng)損傷占比較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);其他指標(biāo)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 兩組老年鼻咽癌患者基礎(chǔ)資料信息比較Table 1 Comparison of basic data of elderly patients with nasopharyngeal carcinoma between two groups

2.2 兩組老年鼻咽癌患者KLF5、KLF9相對(duì)蛋白表達(dá)量比較

表2 量化賦值表Table 2 Quantization assignment table

與非復(fù)發(fā)組患者相比,復(fù)發(fā)組患者KLF5、KLF9相對(duì)蛋白表達(dá)量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;圖1)。

圖1 Western blotting檢測(cè)老年鼻咽患者KLF5、KLF9表達(dá)Figure 1 Western blotting image of KLF5 and KLF9 expression in elderly nasopharyngeal carcinoma tissues KLF5: Kruppel-like factor 5; KLF9: Kruppel-like factor 9.

2.3 KLF5、KLF9對(duì)老年鼻咽癌患者復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值

對(duì)KLF5、KLF9進(jìn)行ROC曲線分析,其對(duì)老年鼻咽癌患者復(fù)發(fā)有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值,且聯(lián)合預(yù)測(cè)價(jià)值更高,曲線下面積分別為0.800、0.790、0.894,靈敏度分別為0.704、0.704、0.815,特異度為0.949、0.881、0.962,其中KLF5、KLF9的最佳截?cái)帱c(diǎn)分別為2.495、0.305,且均P<0.05(圖2)。

圖2 KLF5、KLF9預(yù)測(cè)老年鼻咽癌患者復(fù)發(fā)的ROC曲線Figure 2 ROC curve of KLF5 and KLF9 in predicting recurrence of elderly patients with nasopharyngeal carcinoma ROC: receiver operating characteristic; KLF5: Kruppel-like factor 5; KLF9: Kruppel-like factor 9; AUC: area under the curve.

2.4 多因素logistic回歸分析老年鼻咽癌患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素

以P<0.05的變量為自變量,以是否發(fā)生復(fù)發(fā)為因變量(表2),進(jìn)行多變量logistic回歸分析,結(jié)果顯示UICC分期Ⅲ～Ⅳ期、未行放療聯(lián)合化療、顱底骨質(zhì)受侵、顱神經(jīng)損傷、KLF5<2.495、KLF9<0.305是老年鼻咽癌患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素(P<0.05;表3)。

表3 多因素logistic回歸分析老年鼻咽癌患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素Table 3 Multivariate logistic regression analysis of risk factors for recurrence in elderly patients with nasopharyngeal carcinoma

3 討 論

鼻咽癌的致病因素較多,包括遺傳、病毒感染、環(huán)境等,近年來(lái)隨著人們生活方式的改善及致病因素的增多,此類(lèi)患病群體呈現(xiàn)出明顯增加的趨勢(shì),故如何積極有效地治療該疾病受到眾多臨床醫(yī)師及患者的關(guān)注[8]。鼻咽癌對(duì)于放射治療具有較高的靈敏性,可較好的改善患者預(yù)后,然而患者治療后復(fù)發(fā)仍是臨床亟需解決的難題。

本研究結(jié)果顯示,263例老年鼻咽癌患者5年復(fù)發(fā)率為10.27%,與既往吳曉峰等[9]報(bào)道的10.61%相接近。本研究結(jié)果顯示UICC分期Ⅲ～Ⅳ期、未行放療聯(lián)合化療、顱底骨質(zhì)受侵、顱神經(jīng)損傷為患者治療后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。同時(shí)吳曉峰等[9]、林燦峰等[10]在研究中亦指出未行化療、顱底受侵、顱神經(jīng)損傷為鼻咽癌治療后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素,可與本研究結(jié)果佐證。

Kruppel樣因子是一種可參與至細(xì)胞增殖、分化中的高度保守鋅指蛋白家族,KLF5、KLF9均廣泛存在于人體各組織中,可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因?qū)?xì)胞的增殖與凋亡發(fā)揮作用,其中KLF5具有致癌與抑癌的雙重作用,可對(duì)下游的靶基因細(xì)胞周期蛋白D1、整合素亞單位α3等進(jìn)行調(diào)節(jié),周期蛋白D1高表達(dá)時(shí)可造成細(xì)胞增殖失控、惡性成長(zhǎng),進(jìn)而形成惡性腫瘤[11]。孟聰聰?shù)萚12]在研究中指出KLF5的高表達(dá)與甲狀腺乳頭癌患者出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腺外侵犯的發(fā)生關(guān)聯(lián)密切,可能會(huì)促使甲狀腺乳頭癌患者腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,從而導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腺外侵犯等惡性表型的形成。同時(shí)孫振層等[13]也指出KLF5高表達(dá)可導(dǎo)致前列腺癌患者的存活期縮短,影響預(yù)后。但趙影穎等[7]亦指出KLF5低表達(dá)與喉癌患者的復(fù)發(fā)及病情進(jìn)展有關(guān)。由此可見(jiàn)不同惡性腫瘤中KLF5呈現(xiàn)出不同表達(dá),本研究中復(fù)發(fā)患者KLF5呈低表達(dá),可能是KLF5低表達(dá)后調(diào)控了周期蛋白D1的上調(diào)。KLF9則能與基質(zhì)金屬蛋白酶28的啟動(dòng)子區(qū)域產(chǎn)生特異性結(jié)合,通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶28的表達(dá)可達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的作用,同時(shí)KLF9通過(guò)對(duì)氧化應(yīng)激進(jìn)行調(diào)節(jié)可促使腫瘤細(xì)胞凋亡,KLF9表達(dá)降低則可能導(dǎo)致其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用減弱[14,15]。最后為明確老年鼻咽癌患者復(fù)發(fā)的影響因素,本研究開(kāi)展多因素logistic回歸分析,證實(shí)UICC分期Ⅲ～Ⅳ期、未行放療聯(lián)合化療、顱底骨質(zhì)受侵、顱神經(jīng)損傷、KLF5、KLF9是老年鼻咽癌患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素,同時(shí)ROC分析證實(shí)KLF5<2.495、KLF9<0.305時(shí)可用于老年鼻咽癌患者治療后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè),且兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)價(jià)值更高。因此后續(xù)在老年鼻咽癌的治療中或可對(duì)上述因素予以積極的關(guān)注,或可為疾病的治療提供新的思路、為預(yù)后的改善提供積極幫助。

綜上,老年鼻咽癌患者復(fù)發(fā)受到諸多因素的影響,其中KLF5、KLF9與患者治療后復(fù)發(fā)關(guān)系密切,患者治療過(guò)程中積極檢測(cè)KLF5、KLF9表達(dá)或可為疾病的治療及預(yù)后改善提供幫助。