孫銹銹，徐逸夢(mèng)，周宇荀，李凱，肖君華

東華大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，上海 201620

細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)代分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)常用的一種技術(shù)，但在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，易出現(xiàn)細(xì)胞污染現(xiàn)象，主要為細(xì)菌和真菌污染［1-2］，因此，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中對(duì)細(xì)菌和真菌的檢測(cè)成為現(xiàn)代檢測(cè)開發(fā)技術(shù)的主要研究?jī)?nèi)容，是確保細(xì)胞正常生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［3］。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的細(xì)菌污染是金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）和生孢梭菌（Clostridium spore，C.spore），常見真菌是白色念珠菌（Candida albicans，C.albicans）［4］。傳統(tǒng)的細(xì)菌、真菌檢測(cè)方法主要為培養(yǎng)法［5-6］，該方法周期長(zhǎng)、效率低、過程復(fù)雜，且僅能用于定性［7-8］。菌種的檢測(cè)還可采用Sanger 測(cè)序法［9-10］，即針對(duì)目的菌種的特異性基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，并進(jìn)行Sanger測(cè)序，通過序列比對(duì)確定污染菌株種類。該方法步驟繁瑣，測(cè)序周期較長(zhǎng)［11］，不能及時(shí)有效解決細(xì)胞污染問題。與傳統(tǒng)方法比較，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、用時(shí)短，能同時(shí)實(shí)現(xiàn)定性和定量檢測(cè)［12-17］，在菌種檢測(cè)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。

本研究基于多重?zé)晒舛縋CR 技術(shù)，建立細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)菌、真菌的快速檢測(cè)方法，并引入辣椒UBI3基因作為外標(biāo)基因，與金黃色葡萄球菌、生孢梭菌基因組混合進(jìn)行細(xì)菌三重檢測(cè)；與白色念珠菌基因組混合進(jìn)行真菌兩重檢測(cè)，并對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，以期建立一種針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中金黃色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌的快速定量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 樣本 100 份293T 細(xì)胞培養(yǎng)液上清樣本由上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 基因、菌株、細(xì)胞及質(zhì)粒 金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA（BNCC186335）及其定量菌液（BNCC-186335，108CFU／mL）、生孢梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA（BNCC104015）及其定量菌液（BNCC-104015，108CFU／mL）、白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA（BNCC186382）及其定量菌液（BNCC299343，108CFU／mL）、大腸埃希菌菌株（BNCC336902）、酵母菌菌株（BNCC185724）均購自蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；支原體基因組DNA（51-0112）購自北京締一生物科技有限公司；人源293T細(xì)胞（CL-0003）購自武漢普諾賽生物科技有限公司；辣椒基因組DNA（含UBI3基因）購自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司；含有目的序列NUC的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒pUC19（NC_007795.1，853～971 位，119 bp）、含有目的序列COLA的生孢梭菌標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒pUC19（NC_CP011663.1，2 199 501～2 199 615位，115 bp）、含有目的序列ITS-2區(qū)段的白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒pUC19（NC_032096.1，1 893 355～1 893 472 位，118 bp）由通用生物（安徽）股份有限公司合成。

1.3 主要試劑及儀器溶菌酶（A694342-0001）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×NovoStart?Probe qPCR Super Mix（E091-01A）購自蘇州近岸蛋白科技有限公司；快速磁珠法大體積基因組DNA 抽提試劑盒（M104T）及Purifier HT 全自動(dòng)核酸提取純化儀均購自濟(jì)凡生物科技（北京）有限公司；7500 Real Time PCR System 購自美國Applied Biosystems 公司；Nano-Drop2000C 微量分光光度計(jì)購自美國Thermo Fisher公司；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海復(fù)日科技有限公司。

1.4 引物、探針設(shè)計(jì)及合成選取金黃色葡萄球菌NUC基因、生孢梭菌COLA基因、白色念珠菌ITS-2區(qū)段基因和外標(biāo)基因（植物辣椒UBI3基因）的編碼序列（coding sequence，CDS），應(yīng)用Oligo 7 軟件設(shè)計(jì)特異性引物和探針，引物和探針序列見表1，均由通用生物（安徽）股份有限公司合成。

表1 特異性引物和探針序列Tab.1 Specific sequences of primers and probes

1.5 多重?zé)晒舛縋CR 反應(yīng)體系的建立 以金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA（105copies／μL）為模板，相應(yīng)引物及探針濃度均稀釋為10 μmol／L，進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR 擴(kuò)增。金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、外標(biāo)基因的三重PCR反應(yīng)體系為：2×NovoStart?Probe qPCR Super Mix 15 μL，Rox 0.6μL，上、下游引物各0.7 μL，探針0.5 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水補(bǔ)足至30 μL；白色念珠菌、外標(biāo)基因的兩重PCR 檢測(cè)體系為：2×NovoStart?Probe qPCR Super Mix 15 μL，Rox 0.6 μL，上、下游引物各0.7 μL，探針0.5 μL，DNA 模板2 μL，雙蒸水補(bǔ)足至30 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸時(shí)收集熒光。

1.6 方法的驗(yàn)證

1.6.1 引物特異性 以金黃色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA 為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系為：2×PCR mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol／L）各2 μL，基因組DNA 模板2 μL，加4 μL 無菌水補(bǔ)至20 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，分別于56、57、58、59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6.2 線性范圍 用ddH2O 將金黃色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒pUC19 稀釋為105、104、103、102、101copies／μL，采用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3 次，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)、Ct為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線由7500 Real Time PCR System自動(dòng)生成，R2應(yīng)＞0.99，擴(kuò)增效率范圍應(yīng)為90%～110%。

1.6.3 檢測(cè)限 使用ddH2O 將PUC19 質(zhì)粒稀釋為102copies／μL，采用建立的方法重復(fù)檢測(cè)3次。為與“金標(biāo)準(zhǔn)”培養(yǎng)法比較，需確定購買菌液的檢測(cè)限。將3種菌的定量菌液10倍系列稀釋（105～101cfu／mL），以1 ng 辣椒基因組DNA 作為Carry DNA，與各稀釋梯度的菌液混合，用Purifier HT 全自動(dòng)核酸提取純化儀提取基因組DNA，以辣椒基因組DNA 為內(nèi)參基因，將各濃度的3 種菌液基因組DNA 進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)，確定3種菌液的檢測(cè)限。

1.6.4 專屬性 用含1 ng 外標(biāo)基因組DNA 稀釋液將金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、白色念珠菌、大腸埃希菌、酵母菌、293T 細(xì)胞和支原體基因組DNA 分別稀釋至105copies／μL，采用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，觀察針對(duì)金黃色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌分別設(shè)計(jì)的3 組特異性引物及探針在其他6 種基因組DNA 上的非特異性擴(kuò)增情況，每種探針共檢測(cè)7 次。

1.6.5 抗干擾性 將293T細(xì)胞、大腸埃希菌、酵母菌及支原體4種干擾基因組DNA（終濃度100 pg／μL）分別加至108和102CFU／mL的金黃色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌菌液中，同時(shí)設(shè)對(duì)照組（不含干擾基因組DNA 的待測(cè)菌基因組），以這5 組基因組DNA為模板，采用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.6 精密性

1.6.6.1 重復(fù)性 將金黃色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌菌液用1×PBS溶液分別稀釋至105、104、103CFU／mL，以其為模板，采用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)稀釋度重復(fù)檢測(cè)5次。

1.6.6.2 中間精密性 將金黃色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌菌液用1 × PBS 溶液分別稀釋至105、104、103CFU／mL，并以其為模板，由3 名實(shí)驗(yàn)員采用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品獨(dú)立重復(fù)檢測(cè)5次。計(jì)算均值（x），標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV），CV應(yīng)＜15%。

1.7 方法的應(yīng)用 100 份293T 細(xì)胞培養(yǎng)液上清樣本各取1 mL，用Purifier HT 全自動(dòng)核酸提取純化儀提取基因組DNA，以其為模板，采用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)金黃色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌污染情況。從檢測(cè)樣本中隨機(jī)挑選3 個(gè)陽性樣本和2個(gè)陰性樣本，再采用普通PCR 法進(jìn)行檢測(cè)（同1.6.1項(xiàng)），并將PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.8 數(shù)據(jù)采集及分析 應(yīng)用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析。

2 結(jié)果

2.1 多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系的建立 金黃色葡萄球菌、生孢梭菌和外標(biāo)基因的三重反應(yīng)及白色念珠菌和外標(biāo)基因的兩重反應(yīng)均顯示出良好的擴(kuò)增曲線，見圖1。

圖1 細(xì)菌三重（A）和真菌兩重（B）熒光定量PCR 反應(yīng)的擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curves of bacteria triple reaction（A）and fungi double reaction（B）of fluorescent quantitative PCR

2.2 方法的驗(yàn)證

2.2.1 引物特異性 3 對(duì)引物于不同退火溫度（56、57、58、59 ℃）下均可擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)3 種菌約100 bp 的特異性基因條帶，大小與預(yù)期相符，見圖2。外標(biāo)基因辣椒基因組DNA 設(shè)計(jì)引物及探針的最佳退火溫度為58 ℃，因此，選擇58 ℃作為多重?zé)晒舛縋CR的最適退火溫度。

圖2 引物特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 Verification for primer specificity

2.2.2 線性范圍 金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒在5.80×106～5.80×102copies／μL范圍內(nèi)，與Ct均呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：Y= -3.373X+ 37.48、Y= -3.557X+ 36.59、Y=-3.536X+39.78，R2分別為0.996、0.992、0.995，擴(kuò)增效率分別為0.912、0.979、0.917。見圖3。

圖3 線性范圍的確定Fig.3 Determination of linear range

2.2.3 檢測(cè)限 3次重復(fù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒Ct均值分別為32.27、33.4、33.18，均為陽性，CV分別為1.07%、0.98%、0.35%。因此，確定該方法對(duì)3種菌的檢測(cè)限均為102copies／μL。加入外標(biāo)基因菌液的多重?zé)晒舛縋CR 反應(yīng)檢測(cè)的檢測(cè)限為101CFU／mL，從而計(jì)算獲得金黃色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌的檢測(cè)限分別為40、10 和20 CFU／mL。見表2。

2.2.4 專屬性 3 種菌的引物探針均僅對(duì)相應(yīng)的目的菌株產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，對(duì)其他種類細(xì)胞基因組DNA均未產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，見圖4。表明該方法具有良好的專屬性。

圖4 專屬性的驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Verification for specificity

2.2.5 抗干擾性 較高濃度（108CFU／mL）或較低濃度（102CFU／mL）的菌液中，對(duì)照組與其他4 組間Ct差異較小，見圖5。表明其他細(xì)胞基因組DNA 對(duì)目的菌株擴(kuò)增無明顯干擾。

圖5 抗干擾性驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 Verification for anti-interference performance

2.2.6 精密性 3 種菌株重復(fù)性和中間精密性驗(yàn)證結(jié)果CV均＜15%，見表3。表明該方法具有良好的精密性。

表3 精密性驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 Verification for precision

2.3 方法的應(yīng)用 100 份293T 細(xì)胞培養(yǎng)液上清樣本中，14份呈陽性，86份呈陰性。隨機(jī)挑選3個(gè)陽性樣本和2 個(gè)陰性樣本進(jìn)行普通PCR 檢測(cè)，結(jié)果與建立的方法相符（電泳圖略），測(cè)序結(jié)果與目的擴(kuò)增序列結(jié)果一致。

3 討論

為實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒舛縋CR法能夠同時(shí)檢測(cè)細(xì)菌和真菌污染，本研究選取金黃色葡萄球菌的NUC基因、生孢梭菌的COLA基因和白色念珠菌的ITS-2區(qū)段序列，用辣椒UBI3基因作為外標(biāo)設(shè)計(jì)特異性引物及探針，建立了細(xì)菌的三重檢測(cè)體系和真菌的兩重檢測(cè)體系，并對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果表明，建立的金黃色葡萄球菌、生孢梭菌和外標(biāo)基因的三重?zé)晒舛縋CR 檢測(cè)體系及白色念珠菌和外標(biāo)基因的雙重?zé)晒舛縋CR 檢測(cè)體系可對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中的3 種菌進(jìn)行準(zhǔn)確定性及定量。檢測(cè)限結(jié)果表明，3種菌液檢測(cè)限達(dá)101CFU／mL，其原因?yàn)椋涸诰夯蚪MDNA 抽提前，使用溶菌酶溶解細(xì)菌和真菌的細(xì)胞壁，提高了基因組DNA 得率；在基因組DNA 抽提反應(yīng)中加入1 ng辣椒基因組DNA，一方面可作為多重反應(yīng)體系的外標(biāo)基因，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系，另一方面可作為外標(biāo)基因，提高菌液基因組DNA得率；通過加大模板上樣量，將模板基因組DNA 的上樣量增加至10 μL，也可提高檢測(cè)反應(yīng)的檢測(cè)限。文獻(xiàn)報(bào)道表明，細(xì)菌、真菌檢測(cè)的靈敏度普遍在50～100 CFU／mL，本研究建立的細(xì)菌、真菌反應(yīng)體系的檢測(cè)限達(dá)101CFU／mL，金黃色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌的檢測(cè)限分別為40、10和20 CFU／mL，均低于50 CFU／mL，檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性顯著提高［13，18-20］。

本研究建立的方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)定量檢測(cè)方法比較［21-22］，更快速、更全面、更節(jié)約時(shí)間。目前已有多項(xiàng)研究采用多重定量PCR快速檢測(cè)細(xì)菌或真菌［23-25］，但針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中易感染的主要細(xì)菌、真菌采用快速檢測(cè)的報(bào)道較少。本研究建立的細(xì)胞培養(yǎng)液中常見細(xì)菌、真菌的定量快檢方法，具有良好的專屬性、抗干擾性及重復(fù)性，可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)過程中污染監(jiān)控。