蔡麗星，李翱翔，張琳，沈培玉，張坤明，邱建華

上海生物制品研究所有限責(zé)任公司，上海 200051

在單克隆抗體生產(chǎn)過程中，翻譯后修飾可導(dǎo)致電荷缺失或增加，產(chǎn)生不均一的電荷異構(gòu)體。翻譯后修飾主要包括C-末端賴氨酸截除、糖基化修飾、氧化、脫酰胺基、異構(gòu)化、氧化、聚集等［1-5］。其中酸性異構(gòu)體主要是由抗體發(fā)生N-末端谷氨酰胺／谷氨酸環(huán)化、唾液酸修飾、半胱氨酸殘基修飾等產(chǎn)生的［6-7］；堿性異構(gòu)體主要是由抗體發(fā)生C-末端賴氨酸截除、氧化、天冬酰胺脫氨基／天冬氨酸異構(gòu)體修飾等產(chǎn)生的［8-9］。電荷異構(gòu)體的產(chǎn)生與抗體穩(wěn)定性及生物學(xué)活性密切相關(guān)，因此，在抗體生產(chǎn)過程中監(jiān)控其電荷異構(gòu)體的含量對(duì)生產(chǎn)工藝及抗體功能的穩(wěn)定性具有重要作用［10-11］。目前，常用于檢測(cè)抗體電荷異構(gòu)體的方法主要有等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）電泳法和離子交換色譜（ion-exchange chromatography，IEX）法［12-15］，其中IEF電泳法的原理是基于整個(gè)抗體的電荷量，對(duì)抗體局部電荷分布差異的檢測(cè)靈敏度較低；IEX 法是根據(jù)抗體表面電荷的差異分離抗體的電荷異構(gòu)體，具有較高的靈敏度，常用于抗體電荷異構(gòu)體檢測(cè)，該方法是電荷異構(gòu)體分析的金標(biāo)準(zhǔn)［16］。基于IEX法的陽離子交換高效液相色譜（cation exchange chromatography high performance liquid chromatography，CEX-HPLC）法是根據(jù)分子所帶電荷的不同來分離化合物。由于抗體在低于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境下帶有正電荷，因此能夠與陽離子交換柱基質(zhì)上的負(fù)電荷相互吸引而結(jié)合至離子交換柱上，通過逐漸增加流動(dòng)相中的鹽濃度洗脫帶有不同電荷性質(zhì)的化合物。

免疫細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（programmed death receptor 1，PD1）與腫瘤細(xì)胞表面的細(xì)胞程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PDL1）介導(dǎo)的免疫逃逸在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮了重要作用［17-19］，可通過制備PD1單抗與腫瘤細(xì)胞表面的PDL1結(jié)合，從而抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。帕博利珠單抗是人源化抗PD1 的單抗，美國FDA 已批準(zhǔn)其用于治療晚期黑色素瘤及非小細(xì)胞肺癌［21-23］。為監(jiān)控帕博利珠單抗生產(chǎn)過程中電荷異構(gòu)體的含量，本研究建立了用于檢測(cè)帕博利珠單抗電荷異構(gòu)體含量的CEXHPLC 法，驗(yàn)證其專屬性、精密性、線性、準(zhǔn)確性及耐用性，并采用該方法檢測(cè)3 批帕博利珠單抗成品的電荷異構(gòu)體含量。

1 材料與方法

1.1 樣品 帕博利珠單抗標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：RS-PE-002）、成品（批號(hào)：S20210501、S20210502、S20210603）及制劑緩沖液均由上海生物制品研究所有限責(zé)任公司第一研究室制備。

1.2 主要試劑及儀器 二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鈉、氫氧化鈉及磷酸均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；高效液相色譜儀（9-126、9-084）及樣品瓶均購自美國Waters公司；MabPac SCX-10色譜柱購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 溶液的制備 流動(dòng)相A：將1.209 g 二水合磷酸二氫鈉和0.806 g 十二水合磷酸氫二鈉加至900 mL超純水中，混勻，至完全溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH至6.30±0.05，超純水定容至1 L，經(jīng)0.2 μm 濾膜抽濾，超聲10 min 脫氣。流動(dòng)相B：將1.209 g 二水合磷酸二氫鈉、0.806 g 十二水合磷酸氫二鈉、5.850 g 氯化鈉加至900 mL 超純水中，混勻，至完全溶解，用5 mol／L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至6.30±0.05，混勻，超純水定容至1 L，經(jīng)0.2 μm濾膜抽濾，超聲10 min脫氣。

1.4 色譜條件 色譜柱為MabPac SCX-10。紫外檢測(cè)器波長為280 nm，柱溫箱溫度為35 ℃，樣品盤溫度10 ℃，進(jìn)樣體積40 μL，流速0.5 mL／min。采用梯度洗脫（0～1 min：流動(dòng)相B 從0升至5%；1～30 min：流動(dòng)相B從5%升至35%；30～32 min：流動(dòng)相B從35%升至100%；32～33 min：流動(dòng)相B為100%等度洗脫；33.00～33.01 min：流動(dòng)相B 從100%降至0；33.01～43 min：流動(dòng)相B為0等度洗脫）。

1.5 方法的驗(yàn)證

1.5.1 專屬性 取1 mL 流動(dòng)相A 置于樣品瓶，命名為MPA；用流動(dòng)相A 將帕博利珠單抗標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為1.00 mg／mL，置于樣品瓶，命名為1.00 mg／mL RSPE-002；用流動(dòng)相A 按標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)稀釋制劑緩沖液，置于樣品瓶，命名為制劑緩沖液。按1.4項(xiàng)方法依次進(jìn)樣1 針MPA、1 針制劑緩沖液、3 針1.00 mg／mL RS-PE-002和1針MPA。計(jì)算最后1針流動(dòng)相A 總峰面積與3 針標(biāo)準(zhǔn)品總峰面積平均值的比值。

1.5.2 精密性

1.5.2.1 重復(fù)性用流動(dòng)相A 將帕博利珠單抗標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.50、1.00 和1.50 mg／mL，置樣品瓶，按1.4項(xiàng)方法進(jìn)樣1次，重復(fù)檢測(cè)3次。計(jì)算總峰面積、主峰面積、主峰保留時(shí)間和主峰面積百分比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.5.2.2 中間精密性 用流動(dòng)相A 將帕博利珠單抗標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.50、1.00和1.50 mg／mL，置于樣品瓶，由2名實(shí)驗(yàn)員分別用兩臺(tái)不同的儀器按1.4項(xiàng)方法進(jìn)樣1次，重復(fù)檢測(cè)3次。計(jì)算主峰面積百分比和主峰保留時(shí)間的RSD。另由1 名實(shí)驗(yàn)人員分別在2個(gè)不同時(shí)間用流動(dòng)相A 將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.50、1.00和1.50 mg／mL，置于樣品瓶，按1.4項(xiàng)方法進(jìn)樣1次，重復(fù)檢測(cè)3次。

1.5.3 線性范圍用流動(dòng)相A 將帕博利珠單抗標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.50、0.75、1.00、1.25 和1.50 mg／mL，置樣品瓶，按1.4 項(xiàng)方法進(jìn)樣1 次，重復(fù)檢測(cè)3 次。以標(biāo)準(zhǔn)品理論稀釋濃度為橫坐標(biāo)，分別以總峰面積、主峰面積、酸性異構(gòu)體峰面積和堿性異構(gòu)體峰面積為縱坐標(biāo)，繪制回歸曲線，獲得回歸方程，計(jì)算R2。

1.5.4 準(zhǔn)確性用流動(dòng)相A 將帕博利珠單抗標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0.50、1.00和1.50 mg／mL，置樣品瓶，按1.4項(xiàng)方法進(jìn)樣1次，重復(fù)檢測(cè)3次。將總峰面積和主峰面積數(shù)據(jù)分別代入線性驗(yàn)證的回歸曲線中，獲得實(shí)際濃度值，并計(jì)算回收率。

1.5.5 耐用性 配制pH分別為6.20、6.30和6.40的流動(dòng)相A，用其將帕博利珠單抗標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋為1.00 mg／mL，置樣品瓶，按1.4 項(xiàng)方法進(jìn)樣3 次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品的總峰面積和主峰面積百分比的RSD。用流動(dòng)相A 將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為1.00 mg／mL，置樣品瓶，將色譜柱溫度分別設(shè)為31、33、35、37和39 ℃，按1.4項(xiàng)方法進(jìn)樣3 次，計(jì)算總峰面積和主峰面積百分比的RSD。

1.6 方法的應(yīng)用 用流動(dòng)相A 將3 批帕博利珠單抗成品分別稀釋為1.00 mg／mL，置樣品瓶。按1.4項(xiàng)方法進(jìn)樣1次，計(jì)算3批成品酸性異構(gòu)體、主峰、堿性異構(gòu)體面積百分比及主峰保留時(shí)間的RSD。

1.7 數(shù)據(jù)采集及分析 應(yīng)用Empower 3 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的CEX-HPLC分析 帕博利珠單抗標(biāo)準(zhǔn)品酸性異構(gòu)體的洗脫時(shí)間為18～24 min，堿性異構(gòu)體的洗脫時(shí)間為26～32 min。最后1 個(gè)酸性異構(gòu)體峰及第1 個(gè)堿性異構(gòu)體峰與主峰的分離度分別為1.28 和1.42。酸性異構(gòu)體峰、主峰及堿性異構(gòu)體峰面積百分比分別為17.9%、65.1%、17.0%。見圖1。

圖1 帕博利珠單抗標(biāo)準(zhǔn)品的CEX-HPLC檢測(cè)色譜圖Fig.1 CEX-HPLC chromatogram of pembrolizumab standard

2.2 方法的驗(yàn)證

2.2.1 專屬性 流動(dòng)相A（MPA）和制劑緩沖液圖譜在樣品出峰處無明顯干擾峰出現(xiàn)，最后1針流動(dòng)相A樣品殘留為0.1%，＜5%，見圖2。表明該方法具有良好的專屬性。

圖2 專屬性驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 Verification for specificity

2.2.2 精密性

2.2.2.1 重復(fù)性 3針濃度為0.50 mg／mL標(biāo)準(zhǔn)品總峰面積、主峰面積、主峰面積百分比及主峰保留時(shí)間的RSD分別為0.7%、0.6%、0.2%和0.1%。3 針濃度為1.00 mg／mL 樣品總峰面積、主峰面積、主峰面積百分比及主峰保留時(shí)間的RSD分別為0.2%、0.2%、0.1%和0。3針濃度為1.50 mg／mL樣品總峰面積、主峰面積、主峰面積百分比及主峰保留時(shí)間的RSD分別為0.2%、0.2%、0.1%和0。RSD均＜2%，見表1。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

表1 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果Tab.1 Verification for repeatability

2.2.2.2 中間精密性 2名檢測(cè)人員分別在2臺(tái)不同的儀器上檢測(cè)時(shí)，不同濃度樣品主峰面積百分比RSD分別為0.7%、0.3%和0.2%，不同濃度樣品主峰保留時(shí)間RSD分別為1.2%、1.1%和1.2%，RSD均＜2%，見表2。同一名檢測(cè)人員在不同日期檢測(cè)樣品時(shí)，不同濃度樣品主峰面積百分比RSD分別為0.2%、0.2%和0.1%，主峰保留時(shí)間RSD分別為0.1%、0.1%和0.04%，RSD均＜2%。見表3。表明該方法具有良好的中間精密性。

表3 不同日期中間精密性驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 Verification for intermediate precision between different dates

2.2.3 線性范圍 總峰面積及異構(gòu)體峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品理論濃度回歸曲線見圖3?？偡迕娣e及異構(gòu)體主峰、酸性峰及堿性峰面積均與標(biāo)準(zhǔn)品理論稀釋濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為y=6 736 055.13x-108 727.22、y= 4 369 142.40x- 26 238.60、y =1 291 858.13 x - 120 546.93 和y = 1 075 055.20 x +38 057.73，R2均為1.00。

圖3 總峰面積（A）及異構(gòu)體峰面積（B）與標(biāo)準(zhǔn)品理論濃度的回歸曲線Fig.3 Regression curves of total peak area（A）and isomer peak area（B）with theoretical concentration of standard

2.2.4 準(zhǔn)確性 3 個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的總峰和主峰面積回收率為96.81%～106.07%，均在90.0%～108.0%范圍內(nèi)，見表4。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性。

表4 準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Verification for accuracy

2.2.5 耐用性 3種pH流動(dòng)相A標(biāo)準(zhǔn)品的總峰及主峰面積百分比RSD分別為1.5%和1.9%，不同色譜柱溫度條件下標(biāo)準(zhǔn)品總峰和主峰百分比RSD分別為0.4%、0.3%，RSD均＜2%，見表5。表明pH在6.30±0.10及溫度在31～39 ℃范圍內(nèi)波動(dòng)時(shí)，不影響樣品檢測(cè)結(jié)果，該方法具有良好的耐用性。

表5 耐用性驗(yàn)證結(jié)果Tab.5 Verification for durability

2.3 方法的應(yīng)用 S20210501、S20210502、S20210603批帕博利珠單抗成品的酸性異構(gòu)體面積百分比分別為17.4%、18.5%、17.2%，主峰面積百分比分別為68.4%、64.9%、66.2%，堿性異構(gòu)體面積百分比分別為14.2%、16.6%、16.6%。見圖4。3 批成品主峰保留時(shí)間RSD為0，表明該方法對(duì)不同批樣品的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。

圖4 3批帕博利珠單抗成品的CEX-HPLC色譜圖Fig.4 CEX-HPLC chromatogram of three batches of pembrolizumab finished products

3 討論

目前，單抗大多采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)，因此在生產(chǎn)的過程中常發(fā)生翻譯后修飾或降解，從而產(chǎn)生不同的電荷異構(gòu)體。單抗翻譯后修飾主要包括C-末端賴氨酸截除、糖基化修飾、氧化、脫酰胺基、異構(gòu)化、氧化、聚集等。這些修飾可改變蛋白表面的電荷狀態(tài)，從而直接或間接影響蛋白的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性。研究發(fā)現(xiàn)，單抗唾液酸化修飾可降低抗體與NK 細(xì)胞FcγRⅢa的親和力，從而降低抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）［24］；單抗Fc 端蛋氨酸氧化可降低其與新生兒Fc受體（neonatal Fc receptor for IgG,FcRn)的結(jié)合，從而降低抗體在血液中的半衰期［25］。同時(shí)，在生產(chǎn)過程中對(duì)單抗電荷異構(gòu)體的監(jiān)測(cè)，也是確保生產(chǎn)批次一致性的重要質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此，構(gòu)建帕博利珠單抗電荷異構(gòu)體的檢測(cè)方法對(duì)確保產(chǎn)品的穩(wěn)定性、有效性及批間一致性具有重要作用。

基于帕博利珠單抗的等電點(diǎn)偏弱堿性，本研究建立了用于檢測(cè)其電荷異構(gòu)體的CEX-HPLC 法，并對(duì)該方法進(jìn)行專屬性、精密性、線性范圍、準(zhǔn)確性、耐用性驗(yàn)證。專屬性驗(yàn)證結(jié)果表明，空白對(duì)照樣品中無干擾峰且能夠特異性檢定目的蛋白；精密性驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法在不同人員、不同時(shí)間和不同機(jī)器間是可重現(xiàn)的；線性驗(yàn)證結(jié)果表明，總峰面積、主峰面積、酸性異構(gòu)體峰面積及堿性異構(gòu)體峰面積均與樣品的理論稀釋濃度呈良好的線性關(guān)系；準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果表明，樣品回收率在96.81%～106.07%之間，該方法具有良好的準(zhǔn)確性；耐用性驗(yàn)證結(jié)果表明，流動(dòng)相pH在6.30±0.10及色譜柱溫度在（35±4）℃范圍內(nèi)波動(dòng)均不影響檢測(cè)結(jié)果。3批帕博利珠單抗成品主峰保留時(shí)間RSD為0，表明該方法在不同批次間檢測(cè)的重復(fù)性及穩(wěn)定性良好。因此，該方法可用于后續(xù)研發(fā)工作、擴(kuò)大生產(chǎn)的工藝檢定及穩(wěn)定性研究。但帕博利珠單抗酸性異構(gòu)體及堿性異構(gòu)體的具體修飾類型還需后續(xù)通過液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步分析鑒定。