王光裕，楊靖清，魏長(zhǎng)龍，周澤鑫，楊志行，黃鈺，周勇

1.中國食品藥品檢定研究院藥品監(jiān)管科學(xué)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；2.廣州派真生物技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510670；3.湖州申科生物技術(shù)有限公司，浙江 湖州 313000；4.武昌首義學(xué)院，湖北 武漢 430064

隨著生物醫(yī)藥技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是連續(xù)傳代細(xì)胞系用于生產(chǎn)疫苗和治療性生物制品。常用的生產(chǎn)用細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO 細(xì)胞）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero 細(xì)胞）、小鼠骨髓瘤細(xì)胞（NS0 細(xì)胞）以及HEK293 細(xì)胞等，這些傳代細(xì)胞作為宿主，可能傳遞與腫瘤或病毒相關(guān)的基因，并導(dǎo)致癌變或其他病理變化，存在安全性問題，因此，對(duì)其殘余DNA 含量需進(jìn)行嚴(yán)格控制［1］。前期中國食品藥品檢定研究院已制備并發(fā)布了E.coli、CHO 細(xì)胞、Vero 細(xì)胞以及NS0 細(xì)胞DNA 標(biāo)準(zhǔn)品用于宿主DNA 的含量測(cè)定，為促進(jìn)行業(yè)同類物質(zhì)的定值統(tǒng)一發(fā)揮了積極作用［2-5］。

近年基因治療藥物發(fā)展較快，其中許多以腺相關(guān)病毒（adenovirus-associated virus，AAV）為載體的基因治療藥物所用的宿主細(xì)胞為HEK293細(xì)胞［6］，由于以三質(zhì)粒-HEK293 細(xì)胞系統(tǒng)制備的AAV 產(chǎn)品，其產(chǎn)毒過程并非病毒天然的包裝方式，病毒衣殼會(huì)包裹較多的宿主DNA 片段，因此，對(duì)制品中殘余宿主DNA 進(jìn)行檢測(cè)并制定合理的限度標(biāo)準(zhǔn)顯得格外重要，國家藥品審評(píng)中心與美國FDA 在相關(guān)指南文件中建議將宿主殘留DNA 控制在10 ng／劑以下［7-8］，為了對(duì)殘余HEK293 細(xì)胞DNA 進(jìn)行準(zhǔn)確定量，需建立統(tǒng)一的定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。基于此，市面上已有多個(gè)廠家采用熒光定量PCR 技術(shù)，開發(fā)了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，但由于各試劑盒中所用的DNA 標(biāo)準(zhǔn)品來源不一，采用不同試劑盒對(duì)同一產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，定值結(jié)果差異較大，不同產(chǎn)品以及同一產(chǎn)品不同批次之間的宿主DNA 定量結(jié)果難以比較。為此，本研究研制了1 批HEK293 細(xì)胞DNA 含量測(cè)定用國家標(biāo)準(zhǔn)品，以期為行業(yè)內(nèi)HEK293 細(xì)胞殘余DNA 的測(cè)定提供支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 HEK293細(xì)胞來自ATCC（CRL-1573）。

1.2 主要試劑及儀器 基因組DNA提取試劑購自德國QIAGEN 公司（Genomic-tip 500／G）；TE 緩沖液（pH 8.0，10 mmol／L）由廣州派真生物技術(shù)有限公司配制（000002-02）；Human殘留DNA 檢測(cè)試劑盒購自中國湖州申科生物技術(shù)有限公司（SK030207H100）；CF40 細(xì)胞工廠購自飛凡應(yīng)用生物科技（廣州）有限公司；紫外可見分光光度計(jì)購自日本島津公司（UV-2700）；熒光定量PCR儀分別購自瑞士羅氏公司（Light-Cycler 480）和美國Applied Biosystems 公司（QuantStudio?7 Flex）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 取2 支HEK293 細(xì)胞種子，復(fù)蘇后傳代5次，轉(zhuǎn)移至3個(gè)CF40細(xì)胞工廠，當(dāng)匯合率達(dá)85%以上時(shí)，將細(xì)胞消化并合并到無菌離心杯中。4 ℃，1 500×g離心10 min，棄上清，用預(yù)冷的PBS 以相同條件清洗3次，將細(xì)胞密度調(diào)整為1.1×107個(gè)／mL，按10 mL／管分裝于50 mL離心管中。

采用Genomic-tip 500／G 試劑盒提取每管細(xì)胞DNA，每10 mL 細(xì)胞懸液加入10 mL Buffer C1 和30 mL蒸餾水，上下顛倒混勻后冰上放置10 min；4 ℃，1 300×g離心15 min，棄上清，加入2 mL Buffer C1和6 mL蒸餾水，于混勻儀上渦旋，再次4 ℃，1 300×g離心15 min，棄上清，加入10 mL Buffer G2，渦旋30 s 后至完全混勻；加入0.2 mL蛋白酶K，50 ℃孵育60 min，同時(shí)將純化柱放置在管上，加入10 mL Buffer QBT 進(jìn)行平衡。將孵育結(jié)束的裂解液渦旋10 s后，4 ℃，5 000×g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至純化柱中至液體完全流出，用15 mL Buffer QC 清洗2 次后，將純化柱置于干凈的離心管中，加入50 ℃預(yù)熱的15 mL Bu-ffer QF 洗脫DNA。將洗脫液加入10.5 mL異丙醇，上下顛倒后進(jìn)行DNA沉淀，4 ℃，5 000×g離心15 min，棄上清，加入4 mL 70%乙醇，渦旋后4 ℃，5 000×g離心15 min，棄上清，在潔凈工作臺(tái)中風(fēng)干10 min；加入TE 緩沖液，55 ℃孵育2 h 溶解DNA。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化DNA 的濃度和純度［9］，將其中A260／A280在1.8 ～2.0 之間、DNA 濃度大于200 ng／μL 以及經(jīng)DNA凝膠電泳檢測(cè)電泳條帶單一的管進(jìn)行合并。

將所有符合要求的DNA 母液混合，3 200 ×g離心5 min，取上清，用TE 緩沖液稀釋至濃度約為100 ng／μL，按160 μL／支分裝于0.5 mL 無菌可立螺帽管（帶O 型墊圈）中，分裝量按照2 000 支計(jì)劃。標(biāo)準(zhǔn)品制備完成后按100支／盒包裝，-80 ℃保存。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的檢定 取9 個(gè)分裝盒中各1 支樣品，首先采用紫外分光光度法測(cè)定A260和A280值，其中A260值應(yīng)在0.3 ～0.6 之間；采用A260和A280的比值評(píng)估純度，其比值應(yīng)在1.8 ～2.0 之間；通過A260值計(jì)算含量，依照《中國藥典》三部（2020 版）通則3704“外源性DNA 殘留量測(cè)定法”中公式［10］，即：DNA 濃度（μg／mL）=稀釋倍數(shù)×50×A260，管間濃度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）應(yīng)小于3.00%。隨后進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳，每個(gè)樣品電泳條帶應(yīng)保持單一。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的協(xié)作標(biāo)定 組織5家不同實(shí)驗(yàn)室，采用紫外分光光度法對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定。每家實(shí)驗(yàn)室至少測(cè)定5 份樣品，每個(gè)樣品測(cè)定3 次A260和A280值。其中A260值應(yīng)在0.3 ～0.6 之間；A260／A280應(yīng)在1.8 ～2.0 之間；通過A260值計(jì)算含量，即：DNA濃度（μg／mL）=稀釋倍數(shù)×50×A260。

將每家實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的實(shí)際濃度匯總，結(jié)果統(tǒng)一保留至小數(shù)點(diǎn)后2 位，帶入1.4 項(xiàng)中公式進(jìn)行計(jì)算，將計(jì)算后的原始濃度結(jié)果經(jīng)Jarque-Bera檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并求出加權(quán)均值、RSD、可信區(qū)間、參考值范圍及平均可信限率。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性分析 將制備的標(biāo)準(zhǔn)品分別于不同溫度（-80、-20、4、25、37 ℃）下儲(chǔ)存2、6、8 周后，分別進(jìn)行紫外濃度測(cè)定及DNA凝膠電泳純度分析。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)品的適用性分析 分別使用羅氏和Applied Biosystems 熒光定量PCR 儀對(duì)制備的HEK293細(xì)胞DNA 國家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，確定線性范圍和定量限。用TE 緩沖液將DNA 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至300 pg／μL 作為起始濃度，再進(jìn)行4 次10 倍稀釋至0.03 pg／μL，共5個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以其為模板進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，引物探針及反應(yīng)mix均采用湖州申科生物技術(shù)有限公司試劑盒，反應(yīng)總體積30 μL，其中模板上樣量10 μL。擴(kuò)增程序如下：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)在60 ℃退火時(shí)采集信號(hào)。

1.8 數(shù)據(jù)采集及分析 標(biāo)準(zhǔn)品制備過程中質(zhì)量評(píng)價(jià)、協(xié)作標(biāo)定和適用性驗(yàn)證結(jié)果作圖采用GraphPad Prism 5.01 軟件；協(xié)作標(biāo)定數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用PTP／RMP軟件（版本號(hào)：BMV V1.0；2021-1030）。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量 抽提的110 管HEK293 細(xì)胞基因組DNA 濃度和A260／A280見圖1，篩選DNA 濃度大于200 ng／μL 且A260／A280在1.8 ～2.0 之間的管，共得到104 管。0.7%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，各條帶均一，見圖2。

圖1 紫外分光光度法測(cè)定HEK293細(xì)胞DNA 濃度（A）及A260／A280（B）結(jié)果Fig.1 Determination of DNA concentration（A）and A260／A280（B）in HEK293 cells using UV spectrophotometry

圖2 抽提的HEK293細(xì)胞DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of DNA extracted from HEK293 cells

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的檢定 不同分裝盒中的9 支樣品紫外濃度的RSD為1.6%，純度（A260／A280）的RSD為0.6%，見表1。9支樣品電泳條帶均一，見圖3。

表1 HEK293細(xì)胞DNA濃度與純度檢定結(jié)果Tab.1 HEK293 cell DNA concentration and purity results

圖3 HEK293細(xì)胞DNA瓊脂糖凝膠電泳檢定結(jié)果Fig.3 DNA agarose gel electrophoresis results of HEK293 cells

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的協(xié)作標(biāo)定 共得到78 個(gè)有效濃度結(jié)果，見表2。經(jīng)Jarque-Bera檢驗(yàn)，P＞0.05，具備正態(tài)性，在PTP／RMP 軟件中計(jì)算其加權(quán)平均值為104.8 ng／μL，RSD為4.2%，均數(shù)的95%可信區(qū)間為103.8 ～105.8 ng／μL。單次測(cè)定的95%參考值范圍為96.0 ～113.6 ng／μL，平均可信限率（%）=t（77）0.05× 標(biāo)準(zhǔn)誤／均數(shù)× 100% = 1.0%。5 家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作標(biāo)定結(jié)果分析見圖4。

表2 HEK293 細(xì)胞DNA 含量測(cè)定國家標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定結(jié)果（ng／μL）Tab.2 Collaborative calibration results of national reference standard for HEK293 cell DNA content determination（ng／μL）

圖4 HEK293 細(xì)胞DNA 含量測(cè)定國家標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定結(jié)果分布圖Fig.4 Distribution diagram of collaborative calibration results of national reference standard for HEK293 cell DNA content determination

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性 凝膠電泳法純度檢測(cè)結(jié)果顯示，在4 個(gè)溫度條件下保存8 周，基因組DNA 未發(fā)生明顯降解，見圖5。但隨著溫度升高與保存時(shí)間的延長(zhǎng)，標(biāo)準(zhǔn)品DNA 濃度呈升高趨勢(shì)，即使-20 ℃保存，8 周后測(cè)定結(jié)果也出現(xiàn)偏高的情況，而-80 ℃保存樣品含量測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，見表3。因此推薦保存條件為-80 ℃。

表3 不同溫度保存條件下濃度測(cè)定結(jié)果（ng／μL）Tab.3 Content determination results under different temperature storage conditions（ng／μL）

圖5 不同溫度保存條件下凝膠電泳結(jié)果Fig.5 Results of gel electrophoresis under different temperature storage conditions

2.5 標(biāo)準(zhǔn)品的適用性 分別使用羅氏和Applied Biosystems 熒光定量PCR 儀對(duì)制備的DNA 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定，在0.3 ～3 000 pg／反應(yīng)范圍內(nèi)擴(kuò)增曲線平滑，見圖6。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7，采用羅氏儀器時(shí)，斜率為-3.295，擴(kuò)增效率為101%，R2為0.999 2；采用Applied Biosystems 儀器時(shí)，斜率為-3.439，擴(kuò)增效率為95%，R2為0.999 5。表明標(biāo)準(zhǔn)品適用性良好。

3 討論

宿主細(xì)胞DNA殘留具有生物安全風(fēng)險(xiǎn)，重組AAV制品多采用HEK293 細(xì)胞制備，需對(duì)其定量控制。目前不同實(shí)驗(yàn)室的qPCR 方法結(jié)果差異較大，其中重要原因就是缺少統(tǒng)一的DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)?；谝陨媳尘?，本研究以HEK293 細(xì)胞基因組DNA 為原料，成功制備了我國首批HEK293 細(xì)胞DNA 國家標(biāo)準(zhǔn)品。通過紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳分析，該標(biāo)準(zhǔn)品的純度符合要求。經(jīng)5 家實(shí)驗(yàn)室共同完成協(xié)作標(biāo)定，該標(biāo)準(zhǔn)品的平均含量為104.8 ng／μL，RSD為4.2%，均數(shù)的95%可信區(qū)間為103.8 ～105.8 ng／μL。單次測(cè)定的95%參考值范圍為96.0 ～113.6 ng／μL，平均可信限率為1.0%。該標(biāo)準(zhǔn)品的批號(hào)為270039-202301。加速熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，在-80 ℃條件下，該標(biāo)準(zhǔn)品能夠長(zhǎng)期保持穩(wěn)定性，后續(xù)將繼續(xù)進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。采用熒光定量PCR 法對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行適用性研究，結(jié)果表明，其能夠滿足要求，適用性良好，可用于HEK293細(xì)胞DNA含量的定量檢測(cè)。