蔣 明 何佳薇 方宇潔 尹龍飛 張慧娟

（臺州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 椒江 318000）

青花菜（Brassicaoleraceavar.italica）又名西蘭花、木立花椰菜和綠菜花等，為十字花科（Cruciferae）蕓薹屬一、二年生蔬菜，以花球和花莖為主要食用部位，富含維生素A、維生素C、維生素K、蘿卜硫苷（sulforaphane glucosinolate）、抗氧化物質(zhì)和膳食纖維等，是一種深受消費者喜愛的保健蔬菜［1-4］。青花菜原產(chǎn)地中海中部地區(qū)，目前很多國家都有栽培，我國已成為世界最大的青花菜種植國和出口國之一，年栽培面積超過8.6 萬公頃，年產(chǎn)量約400 萬噸，年出口量約13 萬噸［5-6］。菌核病和灰霉病是青花菜的兩種重要病害，分別由核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）和灰霉菌（Botrytiscinerea）引起，它們危害葉片、莖和花球，導(dǎo)致青花菜產(chǎn)量和品質(zhì)下降，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失十分巨大［7-8］。青花菜引入我國的時間較短，雖然引進(jìn)或育成的品種數(shù)量眾多，但主栽品種之間的親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性程度較低，優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源十分匱乏［6］；青花菜抗病材料更為稀缺，通過挖掘抗病相關(guān)基因開展分子育種，是解決這一問題的重要手段。

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控基因表達(dá)方面起著重要作用，其不僅參與細(xì)胞分化、生長、發(fā)育等生物學(xué)過程，還參與生物脅迫和非生物脅迫響應(yīng)［9-12］。AP2/EREBP、MYB、WRKY、NAC、bHLH 和bZIP 等是植物的重要轉(zhuǎn)錄因子，能夠參與多種脅迫反應(yīng)，明確上述轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能，可為后續(xù)的抗逆分子育種提供優(yōu)良的靶標(biāo)基因［13-14］。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與干旱、鹽堿、重金屬、蟲害等逆境響應(yīng)，近年來有不少研究和報道［15-16］。WRKY 在抗病反應(yīng)中的研究也有相關(guān)報道，擬南芥（Arabidopsisthaliana）AtWRKY33的過量表達(dá)，可顯著增強(qiáng)植株對灰霉菌和甘藍(lán)鏈格孢菌（Alternariabrassicicola）的抗性［17］。將來自葡萄（Vitisvinifera）的VvWRKY1基因轉(zhuǎn)入煙草（Nicotianatabacum），轉(zhuǎn)基因植株對煙草霜霉菌（Peronosporatabacina）和二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum）的抗性增加［18］。小麥（Triticumaestivum）TaWRKY62的表達(dá)受條銹菌（Pucciniastriiformisf.sp.tritici）的誘導(dǎo)，該基因的過量表達(dá)增強(qiáng)了對條銹病的抗病能力［19］。目前，有關(guān)WRKY 在青花菜抗病反應(yīng)中的研究較少，因此本研究在克隆BoiWRKY8基因的基礎(chǔ)上，開展序列分析和表達(dá)分析，以期初步明確該基因在菌核病和灰霉病抗病反應(yīng)中的功能，為后續(xù)開展抗病機(jī)理研究和分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青花菜純合材料Bo0113 由臺州學(xué)院分子生物學(xué)創(chuàng)新實驗室構(gòu)建，栽植于人工氣候箱，培養(yǎng)條件為16 h光照/8 h黑暗。核盤菌菌株HP-22和灰霉菌菌株HM-18 均采自臨海青花菜基地，經(jīng)分離、純化、鑒定后備用。大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α 菌株和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株LBA4404 均由實驗室保藏。病原菌的接種在三葉一心期進(jìn)行，分別于0、12、24、48 和72 h 時收集葉片，用液氮速凍后置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA與RNA的提取、cDNA 的合成 葉片用液氮冷凍，再用研棒磨成粉末，DNA 的提取采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltriethylammnonium bromide，CTAB）法。分別以對照及病原菌處理的葉片為材料，經(jīng)液氮冷凍后研成粉末，RNA 提取采用TRIzol 法，操作在超凈工作臺上進(jìn)行；cDNA 的合成采用cDNA 合成試劑盒（TaKaRa，日本），根據(jù)其提供的說明書進(jìn)行。

1.2.2 基因的克隆 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）野甘藍(lán)（B.oleraceavar.oleracea）（登錄號：XP_013596685.1）WRKY8基因序列設(shè)計引物，上游/下游引物分別引入SmaI 和BamH I 酶切位點，引物序列分別為5′-CATCCCGGGATGTCTAATG AAACCAAAGATCTT-3′和5′-TACGGATCCTCAAGGT TCTTGCTTGAGGA-3′。以葉片DNA 和cDNA 為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，反應(yīng)體系共20 μL：2 μL 10×緩沖液，20 μmol·L-1引物各0.35 μL，基因組DNA 或cDNA 30 ng，10 mmol·L-1dNTPs 0.4 μL，2 U·μL-1TaqDNA 聚合酶1.2 U，加ddH2O 至終體積。反應(yīng)程序為：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸2.5 min，33個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收、純化，與T-easy 載體（Promega，美國）連接，反應(yīng)參考說明書進(jìn)行。陽性克隆經(jīng)PCR 檢測后測序，PCR 反應(yīng)體系、程序與基因克隆相同，模板改為菌液。

1.2.3 序列分析 BoiWRKY8 的同源序列下載自NCBI，分別為野甘藍(lán)、蕪菁（B.rapa）（XP_009101520.1）、甘藍(lán)型油菜（B.napus）（XP_013698158.1）、蘿卜（Raphanussativus）（XP_018456683.1）、鹽芥（Eutrema salsugineum）（ESQ39783.1）、擬南芥（Arabidopsisthaliana）（OAO90538.1）、琴葉擬南芥（A.lyratasubsp.lyrata）（EFH39665.1）、亞麻薺（Camelinasativa）（XP_010441593.1）、薺菜（Capsellarubella）（EOA13673.1）和高山南芥（Arabisalpina）（KFK31474.1）。利用在線工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測分子量和等電點；SMART在線工具（http：//smart.emblheidelberg.de）用于預(yù)測編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域；Clustal X 1.81 軟件用于BoiWRKY8 及同源蛋白序列的多重比對；采用Mega 3.1 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹方法為鄰接法（Neighbor-Joining），自舉檢測值為1 000。

1.2.4 表達(dá)分析 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）在LightCycler?96 熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士）上進(jìn)行，引物序列根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計，上下游引物分別為5′-CATCGTATGATCATTACA ACAGCATCAAC-3′和5′-GACACGAGTGTAGATCAGAA CCG-3′；內(nèi)標(biāo)為肌動蛋白基因，引物分別為5′-ACGTG GACATCAGGAAGGAC-3′和5′-GAACCACCGATCCAG ACACT-3′。反應(yīng)體系為20 μL：Master Mix 10 μL，20 μmol·L-1上下游引物各0.2 μL，cDNA 4 μL，ddH2O 5.6 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性15 s，55 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸30 s，40 個循環(huán)。所有試驗重復(fù)3 次，相對表達(dá)量的計算采用2-△△Ct方法［20］。

1.2.5 遺傳轉(zhuǎn)化 PCR 產(chǎn)物、pBI121 載體用SmaI 和BamH I 雙酶切，經(jīng)純化后用T4連接酶連接，經(jīng)測序驗證后獲得重組載體pBI121-BoiWRKY8。利用熱激法將pBI121-BoiWRKY8轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens），菌株為LBA4404，遺傳轉(zhuǎn)化植株的創(chuàng)制采用Jiang等［21］的方法。篩選至T3代，其中的WK02-07-24和WK22-21-04用于后續(xù)試驗。轉(zhuǎn)基因植株的驗證采用PCR法，以重組質(zhì)粒、對照植株、2個株系的DNA為模板，引物分別為5′-CTCCTCGGATTCCATTGCCCAG-3′和5′-TACGGCGACTGGTCGGGATC-3′，程序和體系同1.2.2。標(biāo)志基因的表達(dá)采用qRT-PCR 法，PR1引物為5′-AAAGCTACGCCGACCGACTACGAG-3′和5′-CC AGAAAAGTCGGCGCTACTCCA-3′，而PDF1.2引物為5′-TCCATCATCACCCTTCTCTTCGC-3′和5′-CCATGTT GTGCTCCTTCAAGTCG-3′，程序與反應(yīng)體系同1.2.4。

1.2.6 抗病性鑒定及統(tǒng)計分析 核盤菌和灰霉菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為（22±2） ℃。待菌絲長至培養(yǎng)基邊緣時，用打孔器切割菌餅，把長有菌絲的一側(cè)貼于葉片背面，培養(yǎng)3 d 時測量病斑直徑，試驗重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)處理采用DPS 9.01 軟件，多重比對利用鄧肯氏新復(fù)極差測驗法。

2 結(jié)果與分析

2.1 BoiWRKY8的序列特征

分別以基因組DNA 和cDNA 為模板，擴(kuò)增到各自的全長序列。測序結(jié)果表明，BoiWRKY8的基因組全長為3 170 bp，具2個內(nèi)含子，長度分別為776和1 422 bp，內(nèi)含子遵循GU-AG 規(guī)則，3 個外顯子的長度分別為455、144 和373 bp（圖1）。BoiWRKY8的編碼區(qū)全長為972 bp，編碼323個氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量為36 kDa，等電點為6.70。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，在+179 和+238 之間含1 個長度為60 個氨基酸的WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具1 個WRKYGQK 和1 個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，C2H2可用通式C-X4-C-X23-H-X1-H 表示，其中的X指任何氨基酸（圖2）。

圖1 BoiWRKY8的基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of BoiWRKY8

圖2 BoiWRKY8的編碼區(qū)及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Complete coding sequence of BoiWRKY8 and its deduced amino acids

2.2 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

利用Clustal X 1.81 對BoiWRKY8 及10 條十字花科同源蛋白序列進(jìn)行多重比對，結(jié)果表明，BoiWRKY8與野甘藍(lán)的同源序列最為相似，僅有2 個氨基酸殘基的差異，分別位于+279 和+283 位；與高山南芥的相似性最低，為81%。11 條蛋白序列的WRKY 結(jié)構(gòu)域十分保守，除高山南芥外，其余10 個結(jié)構(gòu)域的序列完全一致，高山南芥與其他WRKY 結(jié)構(gòu)域之間存在1 個氨基酸殘基的差異（圖3）。

圖3 BoiWRKY8及同源序列的多重比對Fig.3 Multiple alignments of BoiWRKY8 and its homologous sequences

利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4 所示。11條WRKY序列在系統(tǒng)發(fā)育樹上可分為5組，用Ⅰ～Ⅴ表示。4種蕓薹屬植物聚于組I，支持率為100%，該組分為2個亞組，BoiWRKY8與野甘藍(lán)聚于一個亞組，蕪菁與甘藍(lán)型油菜聚于另一個亞組，支持率分別為94%和99%。蘿卜、鹽芥和高山南芥各自單獨成組，即組Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ，亞麻薺、薺菜、擬南芥和琴葉南芥聚于組Ⅳ，支持率達(dá)99%（圖4）。

圖4 基于鄰接法構(gòu)建的BoiWRKY8及同源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of BoiWRKY8 and its homologous sequences using Neighbor-Joining method

2.3 BoiWRKY8的表達(dá)

利用qRT-PCR檢測BoiWRKY8在核盤菌和灰霉菌侵染下的表達(dá)，結(jié)果表明，該基因的表達(dá)受這兩種病原真菌的誘導(dǎo)，表達(dá)量隨侵染時間呈先上升后下降的趨勢（圖5）。在核盤菌誘導(dǎo)下，BoiWRKY8的表達(dá)量在6和12 h 時達(dá)到最大值，分別為對照的3.18 和3.22 倍，之后逐漸下降，48 和72 h 時仍顯著高于對照，表達(dá)量分別為對照的1.49 和1.35 倍。在灰霉菌誘導(dǎo)下的表達(dá)量變化與核盤菌相似，BoiWRKY8的表達(dá)量在6 和12 h 達(dá)到最大值，分別為對照的2.68 和2.90 倍，之后逐漸下降，48 h 時的表達(dá)量為對照的1.46 倍，差異達(dá)顯著標(biāo)準(zhǔn)，但72 h時的表達(dá)量與對照沒有顯著差異。

圖5 BoiWRKY8在核盤菌和灰霉菌侵染下的表達(dá)Fig.5 Expression of BoiWRKY8 in response to Sclerotinia sclerotiorum and Botrytis cinerea

2.4 遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果

以T3 株系WK02-07-24 和WK22-21-04 為試驗材料，利用PCR進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陽性植株（圖6-A）。利用qRT-PCR檢測BoiWRKY8的表達(dá)量，結(jié)果顯示，在35S啟動子的驅(qū)動下，該基因的表達(dá)量在兩個過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中顯著提高，分別為對照的8.77和13.84倍（圖6-B）。

圖6 PCR檢測及BoiWRKY8在過量表達(dá)株系中的表達(dá)Fig.6 PCR detection and expression analysis of BoiWRKY8 over-expressing lines

2.5 抗病性鑒定

對照植株、過量表達(dá)株系WK02-07-24 和WK22-21-04 接種病原菌后，均出現(xiàn)病斑，但大小存在一定的差異（圖7-A、B）。在核盤菌侵染下，對照病斑的平均直徑為2.03 cm，而兩個過量表達(dá)株系的病斑大小分別為1.50和1.10 cm，均顯著小于對照（圖7-C）；在灰霉菌侵染下，對照植株的病斑直徑為2.20 cm，而兩個過量表達(dá)株系的病斑大小分別為1.60和1.37 cm，均顯著小于對照（圖7-D）。抗病性鑒定結(jié)果表明，BoiWRKY8的過量表達(dá)可顯著增加青花菜對核盤菌和灰霉菌的抗性。

圖7 BoiWRKY8過量表達(dá)對抗病性的影響Fig.7 BoiWRKY8 overexpression on resistance to diseases

利用qRT-PCR 檢測水楊酸（salicylic acid，SA）途徑標(biāo)志基因PR1和茉莉酸/乙烯（jasmonic acid/ethylene，JA/ET）途徑標(biāo)志基因PDF1.2的表達(dá)，結(jié)果表明，PR1基因表達(dá)量在對照和兩個過量表達(dá)株系間沒有顯著差異，但PDF1.2的表達(dá)量在3 個株系間存在顯著差異（圖8）。在核盤菌侵染下，PDF1.2在WK02-07-24 和WK22-21-04 的表達(dá)量顯著提高，分別為對照的2.30和3.59 倍；在灰霉菌誘導(dǎo)下，WK02-07-24 和WK22-21-04 的表達(dá)量分別為對照的2.11 與2.96 倍，均達(dá)到顯著水平。

圖8 病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)Fig.8 Expression of pathogenesis-related protein genes

3 討論

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長和發(fā)育，涉及種子萌發(fā)、形態(tài)發(fā)生、根系生長、開花時間等的調(diào)控，此外，該類轉(zhuǎn)錄因子在生物脅迫和非生物脅迫方面有諸多報道［16-17，22］。WRKY 因蛋白質(zhì)的N 端含保守的WRKYGQK序列而得名，以家族形式存在，在擬南芥和水稻中分別有72 和100 個成員［23］。根據(jù)WRKY 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及N 端鋅指結(jié)構(gòu)的類型，WRKY 可分為三大類，第一類含2 個WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2，第二類和第三類均只含1 個WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)分別為C2H2和C2HC［23-24］。本研究以青花菜為材料，克隆到BoiWRKY8基因，推導(dǎo)的氨基酸序列含1 個WRKY 結(jié)構(gòu)域，其N 端的鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2，因此BoiWRKY8 屬于第二類。WRKY 結(jié)構(gòu)域通常十分保守，該結(jié)構(gòu)域可特異識別啟動子區(qū)域的TTGACC/T 序列并與之結(jié)合，從而精確調(diào)控基因的表達(dá)［25］。本研究中，BoiWRKY8 與9 條同源序列的WRKY 結(jié)構(gòu)域完全一致，而與高山南芥僅存在一個氨基酸殘基的差異，結(jié)構(gòu)域的保守性與功能穩(wěn)定性密切相關(guān)，以確保WRKY結(jié)構(gòu)域與特定的DNA 序列結(jié)合，從而實現(xiàn)特定的調(diào)控功能。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子參與多種脅迫，在擬南芥中，49 個WRKY成員受丁香假單胞桿菌（Pseudomonas syringae）或水楊酸的誘導(dǎo)［26］。雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）的12 個WRKY基因受鹽脅迫的誘導(dǎo)，同時，這些基因的表達(dá)量在大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae）的侵染下顯著提高［27］。陸地棉（G.hirsutum）GhWRKY15的表達(dá)受棉刺盤孢菌（Colletotrichumgossypii）、棉花枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum）和立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）的誘導(dǎo)［28］。本研究中，BoiWRKY8的表達(dá)受核盤菌和灰霉菌的誘導(dǎo)，表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且兩種病原菌誘導(dǎo)下的表達(dá)模式相似，推測該基因在抗病反應(yīng)中起著一定的作用。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因在植物抗病反應(yīng)中起著重要作用，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）抑制芍藥（Paeonialactiflora）PlWRKY65基因的表達(dá)，結(jié)果表明，葉片對極細(xì)鏈格孢（Alternaria tenuissima）的感病性增加［29］。陸地棉GhWRKY15的過量表達(dá)，顯著增強(qiáng)了煙草對煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、棉刺盤孢菌和寄生疫霉（Phytophthora parasitica）的抵抗能力［28］。水稻OsWRKY4和OsWRKY80受立枯絲核菌的快速誘導(dǎo)，在水稻中過量表達(dá)，能顯著增強(qiáng)其對該病原真菌的抗性［30］。本研究中，BoiWRKY8在青花菜中的過量表達(dá)，可顯著提高核盤菌和灰霉菌的抵御能力。在抗病反應(yīng)中，激素物質(zhì)JA、SA和ET起著十分重要的作用，SA 信號途徑通常與活體寄生的病原菌抗性相關(guān)，而JA、ET 途徑則參與死體寄生病原菌的響應(yīng)［31-33］。PR1和PDF1.2分別為SA 途徑與JA/ET信號途徑的關(guān)鍵基因，可作為兩個抗病途徑的標(biāo)志基因［30］。GhWRKY15在煙草中過量表達(dá)，顯著增強(qiáng)了標(biāo)志基因PR1的表達(dá)［28］；擬南芥WRKY33的突變導(dǎo)致植株對灰霉菌和甘藍(lán)鏈格孢菌這兩種死體營養(yǎng)型真菌的抗性減弱，同時標(biāo)志基因PDF1.2的表達(dá)量顯著降低［17］。將小麥（Triticumaestivum）TaWRKY142基因?qū)霐M南芥，其對希金斯炭疽菌（C.higginsianum）的抗性增加，同時，標(biāo)志基因AtPDF1.2的表達(dá)量顯著提高［34］。核盤菌和灰霉菌均為死體營養(yǎng)型，本研究中，BoiWRKY8的過量表達(dá)對兩種病原真菌的抗性顯著增強(qiáng)，PR1的表達(dá)量與對照沒有顯著差異，而PDF1.2的表達(dá)量顯著提高。JA/ET 標(biāo)志基因PDF1.2編碼一種抗菌肽，被廣泛認(rèn)為是植物對抗病原菌的重要防御因子之一，BoiWRKY8的過量表達(dá)引起B(yǎng)oiPDF1.2表達(dá)量的顯著提高，使植物產(chǎn)生更多的抗菌肽，從而有效抑制核盤菌和灰霉菌的生長和侵染。

4 結(jié)論

本研究以青花菜為材料，在克隆BoiWRKY8基因的基礎(chǔ)上，明確了基因的序列特點和表達(dá)特征，并初步明確了該基因在抗病反應(yīng)中的功能。BoiWRKY8的編碼區(qū)全長為972 bp，編碼323 個氨基酸，WRKY 結(jié)構(gòu)域具一個WRKYGQK 序列和一個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，與來自蕓薹屬植物的同源序列聚為一組。BoiWRKY8的表達(dá)受核盤菌和灰霉菌的誘導(dǎo)，該基因的過量表達(dá)植株對核盤菌、灰霉菌的抗性顯著增強(qiáng)，JA/ET 通路標(biāo)志基因BoPDF1.2的表達(dá)量顯著提高。