李興梅,賀璞流芳,胡 杰,李 蒙

糖尿病足綜合征(DFS)是糖尿病(DM)最具破壞性的并發(fā)癥之一,其常見(jiàn)臨床特征包括潰瘍、足部畸形、感染、神經(jīng)病變、下肢動(dòng)脈疾病(LEAD)、骨髓炎和壞疽,通常見(jiàn)于中晚期DM患者［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì),DFS約占非創(chuàng)傷性截肢手術(shù)的60%［2］。LEAD是糖尿病足創(chuàng)傷和截肢發(fā)展過(guò)程中最常見(jiàn)的合并癥,高達(dá)50%的DFS患者患有潛在LEAD,因此早期識(shí)別LEAD風(fēng)險(xiǎn),并由多學(xué)科團(tuán)隊(duì)提供適當(dāng)?shù)墓芾?可以降低不良結(jié)局的發(fā)生率［3 - 4］。迄今為止,DFS的發(fā)病機(jī)制尚未明確,通常認(rèn)為它與周圍神經(jīng)病變、血管疾病和足部感染有關(guān)［5］。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是一種轉(zhuǎn)錄因子,在低氧適應(yīng)反應(yīng)的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［6］。缺氧條件下活性氧自由基水平升高可抑制DM患者HIF-1α基因表達(dá)［7］。胎球蛋白-A(Fetuin-A)是一種在胎兒血清中含量較高的載體蛋白,通過(guò)抑制酪氨酸激酶降低胰島素活性［8］。據(jù)報(bào)道,Fetuin-A在調(diào)節(jié)胰島素敏感性、體重增加和脂肪積累方面發(fā)揮著重要作用［9］。最近的研究強(qiáng)調(diào),HIF-1α、Fetuin-A水平與外周動(dòng)脈疾病(PAD)間可能存在關(guān)聯(lián),而DFS是PAD在DM中最嚴(yán)重的后果之一［10 - 12］。盡管血清HIF-1α、Fetuin-A水平已被證明與DM和PAD有關(guān),但關(guān)于血清Fetuin-A、HIF-1α水平與DFS發(fā)展之間的關(guān)系尚未見(jiàn)確切報(bào)道。因此,本研究探討血清Fetuin-A、HIF-1α水平與DFS發(fā)展之間的可能關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選取2020年7月 ～ 2022年2月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院榆林醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的98例2型糖尿病(T2DM)合并DFS患者作為DFS組。其中男性72例;年齡35 ～ 90歲,中位年齡68.5歲;Wagner分級(jí)1級(jí)34例、2級(jí)10例、3級(jí)25例、4級(jí)28例、5級(jí)1例;踝臂指數(shù)(ABI)為1.04(0.62,1.17);趾臂指數(shù)(TBI)為0.58(0.29,0.85)。按照年齡、性別、糖尿病病程相匹配的原則,1∶1比例選取同期本院就診的102例單純T2DM患者作為T2DM對(duì)照組,男性73例;年齡28 ～ 75歲,中位年齡55.0歲;無(wú)任何PAD或周圍神經(jīng)病變證據(jù)。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)成年人群;(2)所有參與者都進(jìn)行75 g口服葡萄糖耐量試驗(yàn),T2DM的診斷依據(jù)《中國(guó)2型糖尿病防治指南2020版》,且糖尿病病程持續(xù)10年以上［13］;(3)DFS的診斷參照最新版《中國(guó)糖尿病足診治指南》,根據(jù)Wagner分級(jí),DFS至少達(dá)到Wagner 1級(jí)的全層皮膚破裂［14］。排除標(biāo)準(zhǔn):患有惡性腫瘤、肝腎功能障礙、自身免疫性疾病、任何其他臨床全身急性或慢性炎癥性疾病、未經(jīng)治療的高血壓、妊娠期糖尿病、1型糖尿病和糖尿病合并其他并發(fā)癥的受試者。

另從本院體檢中心招募100例非糖尿病人群作為健康對(duì)照組,無(wú)糖尿病以及其他任何PAD或周圍神經(jīng)病變證據(jù),男性70例,年齡25 ～ 90歲,中位年齡75歲。

所有受試者均了解研究程序,并提供書(shū)面知情同意書(shū)。根據(jù)《赫爾辛基宣言》,研究由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院榆林醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LL20200530)。

1.2方法 所有研究參與者都要接受完整的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和病史評(píng)估,包括年齡、糖尿病持續(xù)時(shí)間、治療類型、吸煙、高血壓。所有患者均接受完整的體檢,包括身高、體重測(cè)量和體質(zhì)量指數(shù)(BMI)計(jì)算。采用日立7020全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清空腹血糖(FPG)、肌酐(Cr)、總膽固醇(Chol)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。使用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(美國(guó)貝克曼,DxH800)測(cè)定紅細(xì)胞壓積(Hct)。用離子交換-高效液相色譜法(美國(guó)Bio-Rad VariantⅡ分析儀)測(cè)定全血HbA1c水平。對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行全面的糖尿病足檢查,包括足部觸壓覺(jué)(10 g尼龍絲)、涼溫覺(jué)、痛覺(jué)等檢查,并評(píng)估振動(dòng)感知閾值(VPT)、深部肌腱反射。眼底檢查由眼科醫(yī)生完成。

1.3LEAD評(píng)估 由兩名具有5年以上彩色多普勒超聲經(jīng)驗(yàn)的放射科醫(yī)生同時(shí)使用線性探頭(12 MHz Logiq 9,美國(guó)GE Medical Systems)測(cè)量下肢動(dòng)脈(股動(dòng)脈、腘動(dòng)脈、脛前/后動(dòng)脈和足背動(dòng)脈)、趾動(dòng)脈、上臂肱動(dòng)脈收縮壓,計(jì)算踝臂指數(shù)(ABI)和趾臂指數(shù)(TBI)。下肢血管并發(fā)癥包括動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、動(dòng)脈粥樣硬化、斑塊和狹窄。根據(jù)下肢血管病變的嚴(yán)重程度評(píng)估分級(jí):正常0分,50% ～ 75%狹窄計(jì)1分,> 75%狹窄計(jì)2分,彌漫性斑塊或血管完全閉塞計(jì)3分,總分20分［15］。將DFS患者分為下肢血管正常(總分0分)亞組(n=23)和LEAD亞組(n=75)。

1.4血清HIF-1α、Fetuin-A水平檢測(cè) 夜間禁食后,在超聲檢查當(dāng)天收集外周靜脈血5 ml,以3 000 r/min速度,離心半徑10 cm,離心10 min,取血清于-80 ℃低溫保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清HIF-1α、Fetuin-A水平,試劑盒均購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司,批間和批內(nèi)變異系數(shù)均低于9%。ELISA實(shí)驗(yàn)中所繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R值分別為0.997和0.992。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn),偏態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)［四分位值(IQR)］表示,并使用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)和Mann-WhitneyU分析。使用(%)和卡方檢驗(yàn)表示和檢驗(yàn)二分類變量。相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)法分析。單因素及多因素logistic回歸分析血清HIF-1α和Fetuin-A水平與DFS患者LEAD風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.13組受試者臨床資料比較 3組受試者SBP、DBP、吸煙史、HbAlc、FPG、Cr、Chol、TG、HDL、LDL、Hct等比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與健康對(duì)照組相比,DFS組和單純T2DM組患者血清HIF-1α和Fetuin-A水平均顯著升高,其中DFS組水平變化更顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在對(duì)單純T2DM組和DFS組年齡和體重指數(shù)(BMI)進(jìn)行調(diào)整后,進(jìn)行了多變量協(xié)方差分析,3組間血清HIF-1α和Fetuin-A水平差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見(jiàn)表1。

表1 3組受試者一般臨床資料比較［例

2.2DFS患者血清HIF-1α、Fetuin-A水平與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系 經(jīng)Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析,DFS組Wagner分級(jí)與血清Fetuin-A(rs=0.459,P< 0.001)和HIF-1α(rs=0.356,P< 0.001)水平呈正相關(guān)。而且Wagner分級(jí)與和超聲檢查結(jié)果也呈正相關(guān)(rs=0.417,P< 0.001)。

2.3DFS患者血清HIF-1α、Fetuin-A水平與LEAD發(fā)生的關(guān)系 經(jīng)超聲檢查,53例DFS患者存在LEAD,發(fā)病率為54.08%。與下肢血管正常亞組相比,LEAD亞組DFS患者血清Fetuin-A［135.53(100.47,316.38)ng/mlvs. 83.18(55.74,104.40)ng/ml］、HIF-1α［422.67(338.90,561.71)pg/mlvs. 240.07(178.82,328.36)pg/ml］水平均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.899、-5.493,P< 0.001)。經(jīng)單因素和多因素logistic回歸分析,血清HIF-1α和Fetuin-A仍是DFS患者發(fā)生LEAD風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(P< 0.05),見(jiàn)表2。

表2 血清HIF-1α和Fetuin-A水平與DFS患者LEAD風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

2.4DFS患者血清HIF-1α、Fetuin-A水平與超聲結(jié)果的關(guān)系 經(jīng)Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析,DFS組患者血清Fetuin-A、HIF-1α水平與下肢血管病變?cè)u(píng)分呈正相關(guān)(rs=0.533、0.516,P< 0.001)。血清Fetuin-A水平與TBI呈弱的負(fù)相關(guān)(rs=-0.194,P=0.048)。而血清HIF-1α與ABI、TBI均呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.201、-0.347,P< 0.05)。

2.5多元線性回歸分析 校正年齡、性別、BMI、糖尿病史、血糖因素后,經(jīng)多元線性回歸分析,DFS患者血清Fetuin-A水平仍與Wagner分級(jí)、下肢血管病變?cè)u(píng)分呈正相關(guān)性(β=0.004、0.013,t=3.337、3.423,P<0.05)。血清HIF-1α水平仍與Wagner分級(jí)、下肢血管病變?cè)u(píng)分呈正相關(guān)(β=0.002、0.007,t=3.491、3.510,P<0.05);與TBI呈負(fù)相關(guān)(β=0.001,t=-3.837,P< 0.001)。

3 討論

DFS是與神經(jīng)系統(tǒng)疾病和/或PAD相關(guān)的DM患者足部感染、潰瘍或組織破壞,也是DM致殘、致死的主要原因之一［1 - 2］。LEAD存在于約50%的DFS患者中,被認(rèn)為是DFS預(yù)后不良的重要影響因素［3 - 4］。與沒(méi)有LEAD的患者相比,患有LEAD的DFS患者愈合的可能性較小,并且截肢風(fēng)險(xiǎn)更高［4 - 7］。因此,早期識(shí)別下肢血管病變高風(fēng)險(xiǎn)的患者至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組和單純T2DM組相比,DFS組患者血清HIF-1α和Fetuin-A水平顯著升高。而且在DFS患者中,LEAD亞組患者血清HIF-1α和Fetuin-A顯著高于下肢血管正常亞組,提示血清HIF-1α和Fetuin-A水平與DFS患者LEAD風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān),可作為重要生物標(biāo)志物。

HIF-1α是一種氧濃度依賴性關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在缺氧損傷后它可與特定的核輔助因子結(jié)合,調(diào)節(jié)包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在內(nèi)的多個(gè)靶基因,從而調(diào)控各種缺氧誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng),如血管生成、代謝和細(xì)胞凋亡［7］。有研究表明,HIF-1α參與了DFS足潰瘍的愈合和血管生成,在DFS的血管生成中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［16］。同時(shí),HIF-1α已被證明能夠與內(nèi)皮細(xì)胞中的HIF-1β亞基結(jié)合,以增加轉(zhuǎn)錄和與VEGF啟動(dòng)子的結(jié)合,提高VEGF的表達(dá)水平,從而引發(fā)一系列反應(yīng)誘導(dǎo)血管生成并增加局部潰瘍區(qū)的血液供應(yīng),促進(jìn)DFS患者的傷口愈合［17 - 18］。Zhang 等［19］研究發(fā)現(xiàn),20(S)-原人參二醇處理的足潰瘍小鼠可以通過(guò)上調(diào)HIF-1α介導(dǎo)的VEGF的表達(dá)來(lái)刺激血管生成。既往研究還揭示過(guò)度表達(dá)的HIF-1α可以增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,促進(jìn)足潰瘍大鼠的傷口愈合［16］。本研究發(fā)現(xiàn)DFS患者血清HIF-1α明顯上調(diào),而DFS合并LEAD組血清HIF-1α水平升高更顯著,提示高血清HIF-1水平與下肢血管病變高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。從機(jī)制上講,血清HIF-1α高表達(dá)可能是由局部組織的缺氧和缺血引起的,這激活了內(nèi)源性防御和修復(fù)機(jī)制,導(dǎo)致對(duì)缺氧有反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物HIF-1α的增加,從而影響糖代謝并上調(diào)HIF-1α誘導(dǎo)基因的表達(dá),促進(jìn)血管生成。既往研究也證實(shí)LEAD可導(dǎo)致外周組織缺氧,從而觸發(fā)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄［20］。Qin等［11］研究還顯示HIF-1α在股動(dòng)脈閉塞引起的外周動(dòng)脈病變(PAD)大鼠的肌肉感覺(jué)神經(jīng)中增加。這些研究結(jié)果表明HIF-1α表達(dá)與血管病變之間存在直接關(guān)系。

Fetuin-A是由肝細(xì)胞形成的糖蛋白,以高濃度分泌到血清中,它的血清濃度與胰島素抵抗直接相關(guān),因?yàn)镕etuin-A可以抑制胰島素受體酪氨酸激酶的自身磷酸化,影響胰島素信號(hào)傳導(dǎo),誘導(dǎo)胰島素抵抗,其高水平與T2DM高風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)已有較多報(bào)道［9,11,21］。有趣的是,Fetuin-A還可以促進(jìn)血管生成,類似于VEGF［7］。據(jù)報(bào)道,血清Fetuin-A水平升高與DM大血管并發(fā)癥有關(guān),有助于DFS的發(fā)展［22］。與上述研究相一致,本研究也發(fā)現(xiàn)DFS患者血清Fetuin-A水平顯著升高,且與Wagner分級(jí)呈正相關(guān),提示血清Fetuin-A與DFS發(fā)展有關(guān)。而且,本研究發(fā)現(xiàn)合并LEAD的DFS患者血清Fetuin-A進(jìn)一步上調(diào),提示高血清Fetuin-A與下肢血管病變風(fēng)險(xiǎn)的密切關(guān)聯(lián)。Fetuin-A對(duì)血管結(jié)構(gòu)的影響可能由兩種機(jī)制引起。首先,高Fetuin-A水平已被證明會(huì)損害葡萄糖代謝［11,22］。它可能通過(guò)誘導(dǎo)胰島素抵抗等參與DFS和LEAD的發(fā)展。有研究表明,Fetuin-A與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)之間存在顯著關(guān)系,Fetuin-A升高會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病［23］。Ozenc等［22］研究也表明,Fetuin-A水平的升高與PAD風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),這與本研究結(jié)果相似。其次,Fetuin-A可通過(guò)增加血清鈣和磷的溶解度來(lái)調(diào)節(jié)異位鈣磷沉積和血管鈣化［9］。提示Fetuin-A在血管病變的發(fā)展中發(fā)揮重要作用,其高水平可能預(yù)示著下肢血管病變高風(fēng)險(xiǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn),與健康對(duì)照組相比,單純T2DM組和DFS組患者HIF-1α、Fetuin-A均升高,且DFS組患者兩種因子升高更顯著,提示高血糖對(duì)HIF-1α和Fetuin-A有顯著影響,且HIF-1α和Fetuin-A水平在DFS的發(fā)展中起重要作用,與血管病變有關(guān)。在DFS患者中,LEAD亞組患者血清HIF-1α和Fetuin-A顯著高于下肢血管正常亞組。經(jīng)logistic回歸分析,血清HIF-1α和Fetuin-A時(shí)是DFS患者LEAD風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。這些研究結(jié)果提示血清HIF-1α和Fetuin-A高水平與DFS患者下肢血管病變高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。血清HIF-1α和Fetuin-A還與Wagner分級(jí)和下肢血管病變?cè)u(píng)分呈正相關(guān),提示HIF-1α和Fetuin-A過(guò)表達(dá)可能預(yù)示著嚴(yán)重疾病。本研究結(jié)果表明,血清HIF-1α和Fetuin-A表達(dá)在長(zhǎng)期高糖下會(huì)顯著上調(diào),與DFS患者LEAD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述,血清HIF-1α和Fetuin-A水平與DFS患者LEAD風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān),可作為下肢血管病變風(fēng)險(xiǎn)的可靠預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。但是本研究也存在一定的局限性,例如患者人數(shù)較少、HIF-1α和Fetuin-A在下肢血管病變中具體機(jī)制尚未明確。