龔 瑤,李夢(mèng)園,章 茜

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔頜面外科門診,江蘇 南京 210008)

口腔鱗癌(OSCC)是最常見的頭頸部腫瘤亞型,全球每年有超過35萬新確診病例和18萬死亡病例[1]。盡管在手術(shù)技術(shù)和放化療方面取得了較大進(jìn)展,但OSCC病人總生存率并未得到明顯改善。OSCC具有局部侵襲性強(qiáng)和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移特點(diǎn),深入研究其進(jìn)展和轉(zhuǎn)移分子機(jī)制是開發(fā)新型有效OSCC治療方法的關(guān)鍵。環(huán)狀RNA(circRNA)是由共價(jià)鍵形成的閉合型RNA分子,其包含miRNA特異性結(jié)合位點(diǎn),可通過抑制miRNA的調(diào)控作用來調(diào)節(jié)mRNA表達(dá),廣泛參與細(xì)胞代謝、增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等諸多生物學(xué)過程[2]。circFOXK2在胰管腺癌細(xì)胞和大多數(shù)原發(fā)腫瘤中顯著上調(diào),促進(jìn)細(xì)胞生長和侵襲,參與細(xì)胞周期進(jìn)展[3]。然而目前鮮見circFOXK2和OSCC的相關(guān)報(bào)道。miR-4677-3p是肺癌的抑制因子,上調(diào)其表達(dá)能夠抑制肺癌細(xì)胞增殖和遷移[4]。此外,miR-4677-3p還介導(dǎo)敲減circ_0001421對(duì)肺癌細(xì)胞的惡性行為和糖酵解的抑制作用[5]。靶基因預(yù)測顯示miR-4677-3p是circFOXK2的潛在靶點(diǎn),但circFOXK2靶向miR-4677-3p在OSCC進(jìn)展中的調(diào)控作用并不清楚。為此,本研究重點(diǎn)探討circFOXK2和miR-4677-3p對(duì)OSCC惡性行為的影響和調(diào)控機(jī)制,旨在為OSCC的防治提供重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 OSCC組織 OSCC組織和匹配癌旁組織來源于2017年3月至2020年12月在我院行手術(shù)治療的45例OSCC病人,其中男32例,女13例,年齡48～75歲。所有OSCC病人在手術(shù)前均未接受過輔助放療或化療。所有樣本均由我院2位病理專家證實(shí),然后立即在-80 ℃保存。病人均簽署知情同意書,且該研究獲得了我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞和試劑 OSCC細(xì)胞HSC-3購自美國ATCC;Transwell板購自美國Corning公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購自北京博奧森公司;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)兔多抗(ab9485)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)兔多抗(ab97779)、MMP-9兔多抗(ab38898)購自上海艾博抗公司;重組報(bào)告質(zhì)粒、si-NC、si-circFOXK2、模擬物陰性對(duì)照miR-NC、miR-4677-3p模擬物、pcDNA-circFOXK2、抑制物陰性對(duì)照anti-miR-NC、miR-4677-3p抑制物(anti-miR-4677-3p)、pcDNA購自蘇州鴻迅生物;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生生物公司;Power SYBRTM Green PCR Master Mix購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測circFOXK2和miR-4677-3p表達(dá) 采用Trizol試劑從OSCC組織中分離總RNA,RNA質(zhì)量和濃度通過紫外分光光度法確定。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ進(jìn)行RT-qPCR。用2-ΔΔCt法方法計(jì)算circFOXK2(GAPDH為內(nèi)參)和miR-4677-3p(U6為內(nèi)參)相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 HSC-3細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)箱環(huán)境為37 ℃、含5%CO2。在6孔板中接種5×105個(gè)對(duì)數(shù)期HSC-3細(xì)胞,將Lipo2000與si-NC、si-circFOXK2、miR-NC、miR-4677-3p模擬物、pcDNA、pcDNA-circFOXK2、si-circFOXK2+anti-miR-NC、si-circFOXK2+anti-miR-4677-3p加入到60%融合度的HSC-3細(xì)胞中,培養(yǎng)48 h收獲細(xì)胞,RT-qPCR檢測circFOXK2或miR-4677-3p表達(dá)后用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。根據(jù)轉(zhuǎn)染序列或載體不同共分為si-NC組、si-circFOXK2組、miR-NC組、miR-4677-3p組、pcDNA組、pcDNA-circFOXK2組、si-circFOXK2+anti-miR-NC組、si-circFOXK2+ anti-miR-4677-3p組。

1.2.3 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆數(shù) 轉(zhuǎn)染48 h后,用胰酶消化細(xì)胞,將1×105個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種到6孔板,培養(yǎng)2周后,去除培養(yǎng)基,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞集落10 min,隨后將細(xì)胞用0.5%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 在96孔板中接種1×105個(gè)細(xì)胞,孵育2 d后每孔加入10 μL的CCK-8試劑,繼續(xù)孵育2 h,用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度(OD)值。

1.2.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 用記號(hào)筆在6孔板背面劃一條直線。在6孔板中接種5×105個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,37 ℃培養(yǎng)箱孵育至細(xì)胞基本融合,用200 μL移液管尖端沿6孔板背面直線劃傷單層細(xì)胞,PBS洗滌去除細(xì)胞碎片。繼續(xù)孵育24 h,顯微鏡下拍照,Image J軟件測定劃痕寬度,并計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 用無血清培養(yǎng)基重懸轉(zhuǎn)染48 h的HSC-3細(xì)胞,取200 μL接種在預(yù)包被基質(zhì)膠的上室中。在下室中加入完全培養(yǎng)液作為引誘劑。37 ℃培養(yǎng)24 h,用棉簽輕輕去除留在上表面的HSC-3細(xì)胞,將穿膜細(xì)胞固定,并進(jìn)行結(jié)晶紫染色。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照,以細(xì)胞數(shù)的均值表示侵襲數(shù)。

1.2.7 Western blotting檢測MMP-2和MMP-9蛋白水平 用預(yù)冷RIPA緩沖液提取總蛋白質(zhì),然后在SDS-PAGE上分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。在5%脫脂牛奶中封閉1 h,將膜與適當(dāng)濃度的一抗(包括MMP-2、MMP-9和內(nèi)參GAPDH抗體)在4 ℃孵育過夜。用酶標(biāo)二抗在室溫下與膜結(jié)合2 h。用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測蛋白條帶,并使用Quantity One軟件分析目的蛋白相對(duì)灰度值。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 分別將包含miR-4677-3p結(jié)合位點(diǎn)的circFOXK2野生(WT)序列或突變(MUT)序列分別克隆到psiCHECK-2報(bào)告載體,產(chǎn)生WT-circFOXK2、MUT-circFOXK2。在HSC-3細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染報(bào)告質(zhì)粒與miR-NC或miR-4677-3p模擬物,轉(zhuǎn)染48 h后檢測細(xì)胞裂解物中相對(duì)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用t檢驗(yàn)、方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 circFOXK2和miR-4677-3p在OSCC組織中的表達(dá)

OSCC組織circFOXK2表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.01),miR-4677-3p表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.01)(見表1)。

表1 OSCC組織中circFOXK2和miR-4677-3p表達(dá)

2.2 抑制circFOXK2表達(dá)對(duì)HSC3細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

與轉(zhuǎn)染si-NC相比,轉(zhuǎn)染si-circFOXK2導(dǎo)致HSC3細(xì)胞circFOXK2表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與si-NC組相比,si-circFOXK2組HSC3細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白水平、細(xì)胞OD值、克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表2、圖1)。

表2 抑制circFOXK2表達(dá)對(duì)HSC3細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

2.3 miR-4677-3p過表達(dá)對(duì)HSC3細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

與轉(zhuǎn)染miR-NC比較,轉(zhuǎn)染miR-4677-3p模擬物導(dǎo)致HSC3細(xì)胞miR-4677-3p表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。miR-4677-3p組HSC3細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白水平、細(xì)胞OD值、克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)顯著低于miR-NC組(P<0.01)(見圖2、表3)。

表3 miR-4677-3p過表達(dá)對(duì)HSC3細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

2.4 circFOXK2靶向調(diào)控miR-4677-3p的表達(dá)

StarBase預(yù)測到circFOXK2的序列中含有miR-4677-3p的結(jié)合位點(diǎn)(見圖3)。與WT-circFOXK2共轉(zhuǎn)染時(shí),轉(zhuǎn)染miR-4677-3p模擬物與轉(zhuǎn)染miR-NC相比導(dǎo)致細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表4)。pcDNA-circFOXK2組HSC3細(xì)胞miR-4677-3p表達(dá)水平顯著低于pcDNA組(P<0.05),si-circFOXK2組HSC3細(xì)胞miR-4677-3p表達(dá)水平顯著高于si-NC組(P<0.05)(見表5)。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 circFOXK2調(diào)控miR-4677-3p的表達(dá)

2.5 干擾miR-4677-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制circFOXK2表達(dá)對(duì)HSC3細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用

si-circFOXK2+anti-miR-4677-3p組HSC3細(xì)胞miR-4677-3p表達(dá)水平顯著低于si-circFOXK2+anti-miR-NC組(P<0.01),MMP-2和MMP-9蛋白水平、細(xì)胞OD值、克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)顯著高于si-circFOXK2+anti-miR-NC組(P<0.01)(見圖4、表6)。

表6 干擾miR-4677-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制circFOXK2表達(dá)對(duì)HSC3細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用

3 討論

circRNA是新發(fā)現(xiàn)的功能性調(diào)節(jié)非編碼RNA,特定circRNA差異表達(dá)與各種癌癥的臨床特征顯著相關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)circ_0000140低表達(dá)與OSCC病人預(yù)后不良相關(guān)[6]。circ_101036通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來抑制OSCC細(xì)胞遷移和侵襲[7]。然而circ_002178高表達(dá)OSCC病人晚期病理分期和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高,敲除circ_002178能夠有效抑制OSCC細(xì)胞增殖和侵襲[8]。闡明circRNA在OSCC發(fā)生和發(fā)展機(jī)制中的作用將為OSCC的治療提供新的方向。本研究檢測到OSCC組織中circFOXK2表達(dá)增加,抑制circFOXK2表達(dá)導(dǎo)致HSC3細(xì)胞活力和克隆形成數(shù)降低,遷移和侵襲能力降低,表明抑制circFOXK2表達(dá)具有抗增殖、抗轉(zhuǎn)移作用。腫瘤轉(zhuǎn)移涉及多個(gè)步驟,其中MMPs是腫瘤細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)并向局部或遠(yuǎn)處延伸的必要條件[9]。在包括OSCC在內(nèi)的多種腫瘤中MMP-2和MMP-9異常表達(dá)或激活與腫瘤侵襲或轉(zhuǎn)移有關(guān)[10-11]。本研究檢測轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,抑制circFOXK2表達(dá)導(dǎo)致HSC3細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白下調(diào),transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致。以上研究表明circFOXK2在OSCC進(jìn)展中扮演致癌基因角色。

研究[12-13]顯示circRNA可結(jié)合miRNA調(diào)控腫瘤進(jìn)展。本研究證實(shí)miR-4677-3p是circFOXK2的靶點(diǎn),過表達(dá)circFOXK2可抑制miR-4677-3p表達(dá),而抑制circFOXK2則促進(jìn)miR-4677-3p表達(dá)。miR-4677-3p已被證明在人類癌癥中異常表達(dá)并調(diào)控癌癥進(jìn)展。如在胃癌中miR-4677-3p異常低表達(dá),miR-142-5p的上調(diào)可抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移[14];LINC00313通過下調(diào)miR-4677-3p表達(dá)水平,誘導(dǎo)CDK6表達(dá)上調(diào),從而促進(jìn)宮頸癌進(jìn)展[15];miR-4677-3p還作為TTN-AS1和LINC02418等lncRNA的下游miRNA來抑制肺癌進(jìn)展[16-17]。本研究中,OSCC組織中miR-4677-3p表達(dá)明顯降低,過表達(dá)miR-4677-3p可下調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá),并抑制HSC3細(xì)胞活力、遷移、克隆形成和侵襲能力降低,這與抑制circFOXK2表達(dá)的抗癌作用類似。為證實(shí)抑制circFOXK2的作用是通過上調(diào)miR-4677-3p表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,本研究共轉(zhuǎn)染si-circFOXK2和anti-miR-4677-3p至HSC3細(xì)胞,結(jié)果顯示,下調(diào)miR-4677-3p表達(dá)顯著減弱抑制circFOXK2表達(dá)對(duì)HSC3細(xì)胞惡性行為的影響。這些結(jié)果表明circFOXK2靶向miR-4677-3p調(diào)控OSCC細(xì)胞的惡性行為。然而,本研究并未在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證circFOXK2和miR-4677-3p的功能,這將是下一步研究的重點(diǎn)。

總之,本研究表明抑制circFOXK2可通過促進(jìn)miR-4677-3p表達(dá)來抑制OSCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,這些發(fā)現(xiàn)有助于理解OSCC的發(fā)病機(jī)制,并可能為OSCC的治療提供新靶點(diǎn)。