冷冬月,李旭峰,方興剛

(1.湖北省十堰市太和醫(yī)院 中西醫(yī)結合科,442000;2.湖北省十堰市人民醫(yī)院 中醫(yī)科,442000)

骨質疏松癥(OP)是一種骨代謝疾病,其特征在于骨量下降,伴隨著骨組織和微結構的惡化以及骨礦物質密度的下降[1]。在OP中,骨形成與吸收之間的不平衡最終導致了骨的變性和易骨折[2]。成骨細胞(osteoblasts,OB)是一類特殊的具有成骨潛能的細胞,在骨重建及骨穩(wěn)態(tài)維持中都發(fā)揮著重要的作用[3];OB活性下降是OP的主要原因[4]。Y-box蛋白5(SOX5)是SOX家族SoxD組的成員,編碼控制細胞命運的各種轉錄因子并在許多譜系中進行分化,包括神經元、軟骨細胞和B細胞[5-7]。研究[8-9]表明SOX5與類風濕關節(jié)炎和軟骨形成密切相關,是治療絕經后OP的有希望的分子靶標。已經在卵巢切除小鼠的骨髓細胞中發(fā)現了差異表達的SOX5;且與絕經前健康女性的骨髓樣本相比,絕經后OP病人骨髓中SOX5的mRNA和蛋白表達水平顯著上調;SOX5過表達可抑制人間充質干細胞的成骨分化[10]。而SOX5對OB增殖的分子功能及作用機制尚不明確;因此,本研究以大鼠OB為對象,探討SOX5對OB增殖的影響及其潛在的作用機制,為OP的治療及藥物開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

出生24 h的SPF級SD乳鼠10只,雌雄不限,質量(10±3)g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,許可證為SCXK(京)2019-0009。飼養(yǎng)溫度(20±2)℃,相對濕度為45%～60%。胎牛血清、胰蛋白酶、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自美國GIBCO公司;TRIzol RNA分離試劑及SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒均購買于日本TaKaRa公司;LipofectamineTM2000 轉染試劑盒購自美國Thermo公司;pcDNA-SOX5和pcDNA3.1載體、siRNA-SOX5和其陰性對照(si-NC)以及PCR引物序列由上海GenePharma公司設計合成;氯化十六烷基吡啶鎓(美國Sigma-Aldrich,貨號:C9002);堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)檢測試劑盒(P0321S)、MTT試劑盒(C0009S)購自碧云天生物科技公司;茜素紅染色試劑(北京索萊寶科技有限公司,貨號:G8550);兔抗大鼠Runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)(ab236639)、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)(ab270993)、核因子-κB p65(nuclear factor kappa-B p65,NF-κB p65)(ab16502)、p-NF-κB p65(ab76302)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)(ab205587)、KB抑制蛋白激酶α(KB inhibits protein kinase α,IκBα)(ab109300)、山羊抗兔IgG H&L (HRP)(ab205718)、β-actin(ab8227)均購自英國abcam公司。

細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司);ABI Prism?7300型熒光定量PCR系統(tǒng)(美國);倒置熒光顯微鏡(IX73,購自日本Olympus公司);iMark680多功能酶標儀、蛋白轉膜裝置購自美國Bio-Rad公司。

1.2 成骨細胞的分離、鑒定

應用酶消化法分離大鼠顱骨成骨細胞[11]。取新生24 h內SD乳鼠,處死后,乙醇浸泡5 min,在無菌條件下,取出頭蓋骨,PBS沖洗后切成1 mm3的骨顆粒,37 ℃水浴中用0.1%的膠原酶以1∶10的比例將骨顆粒消化分離20 min,然后再次用膠原酶分離約1 h。將分離獲得的懸浮液以1 200 r/min離心,去上清液,用PBS漂洗3次,并加入含有15%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 U/mL)的培養(yǎng)液。在37 ℃、5% CO2下孵育,1周換液2次,待細胞融合約80%時傳代,換用成骨誘導培養(yǎng)基(基礎培養(yǎng)基+50 μg/mL維生素C+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+10 nmol/L地塞米松)。取第3代細胞通過ALP染色和形態(tài)觀察行成骨細胞鑒定,取生長良好的第4代細胞用于實驗。

鑒定成骨細胞:

(1)形態(tài)學觀察:在倒置相差顯微鏡下觀察原代和繼代培養(yǎng)成骨細胞的生長和形態(tài)變化,并在隨機選擇的視野中拍照。(2)ALP染色:將第3代的成骨細胞培養(yǎng)7 d,并參照ALP染色試劑盒的說明進行ALP染色。去除成骨細胞的培養(yǎng)基,PBS清洗細胞2～3次,并用4%多聚甲醛固定10 min。清洗后加入300 μL顯色液,避光于37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育2 h,顯微鏡下觀察。

1.3 分組及轉染

取生長良好的第4代成骨細胞,按每孔2×106個接種于24孔板,分成5個處理組:(1)空白對照組,不進行任何轉染;(2)pcDNA3.1組,用Lipofectamine 2000按照說明書將100 nmol/L pcDNA3.1轉染至成骨細胞;(3)pcDNA-SOX5組,用Lipofectamine 2000按照說明書將100 nmol/L pcDNA-SOX5轉染至成骨細胞;(4)si-NC組,將si-NC轉染至成骨細胞;(5)siRNA-SOX5組,將siRNA-SOX5轉染至成骨細胞。轉染48 h后收獲細胞以進行后續(xù)實驗。

1.4 qRT-PCR檢測細胞中SOX5 mRNA的表達

使用TRIzol試劑提取細胞總RNA,使用分光光度計測量總RNA的濃度。按照試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA,進行PCR擴增(見表1)。反應體系(20 μL):cDNA(200 ng/μL) 2 μL,SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)10 μL,上下游引物各0.4 μL,ddH2O 7.2 μL。循環(huán)條件:94 ℃持續(xù)10 min,然后在94 ℃持續(xù)10 s,60 ℃持續(xù)20 s和72 ℃持續(xù)1 min進行40個循環(huán)。用β-actin作為對照,相對SOX5 mRNA的表達量采用2-ΔΔCt方法計算。

表1 RT-PCR引物序列

1.5 MTT法檢測細胞增殖活力

轉染48 h后將成骨細胞以2×103細胞/孔的濃度接種到96孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后每孔中加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL),于培養(yǎng)箱中孵育4 h,吸去上層清液后加入150 μL的DMSO,490 nm波長處測定各孔吸光度值(OD),計算細胞增殖率。細胞增殖率=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)×100%。

1.6 ALP活性測定

ALP是成骨細胞分化的早期標志。將轉染的成骨細胞用成骨培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d。然后,除去OM培養(yǎng)基,并使用0.1%TritonX-100裂解細胞獲得細胞裂解液,然后12 000 g離心10 min,取上清液為樣品。使用ALP活性檢測試劑盒測量上清液中ALP活性。于405 nm處測定各組OD值,使用對硝基苯酚繪制標準曲線;另用BCA法測定每個樣品的總蛋白濃度。并將每個樣品的ALP活性標準化為相應的總蛋白含量。

1.7 茜素紅染色

采用茜素紅染色觀察鈣結節(jié)的形成數量,評估成骨細胞的礦化能力。成骨細胞按1.3方法進行分組處理,轉染后將細胞培養(yǎng)2周,棄去培養(yǎng)液,細胞用PBS洗滌2次,并在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min。棄去多聚甲醛,PBS洗滌后在37 ℃下用0.1%茜素紅染液染色1 h。倒置光學顯微鏡下觀察圖像并拍照,并使用Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計鈣化結節(jié)染色陽性區(qū)域的面積和數量。

1.8 Western blotting檢測成骨細胞NF-κB信號通路相關蛋白的表達

使用RIPA裂解液提取細胞中蛋白質。使用BCA試劑盒對蛋白質濃度進行定量。取等量蛋白質樣品上樣(每泳道30 μg),10% SDS-PAGE分離蛋白質,并通過半干轉移將其轉移到PVDF膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉,并在4 ℃下與一抗(Runx2、Collagen Ⅰ、NF-κB p65、p-NF-κB p65、TNF-α、IκBα、β-actin,1∶1 000)孵育過夜。第2天,將膜與偶聯(lián)辣根過氧化物酶的二抗孵育(1∶2 000)2 h,然后使用化學發(fā)光試劑盒(ECL)進行顯色。以β-actin為內參,分析結果。

1.9 統(tǒng)計學方法

以上所有實驗均重復3次。采用單因素方差分析(One-way ANOVA),Tukey的事后檢驗用于單因素方差分析后的成對比較。

2 結果

2.1 成骨細胞原代培養(yǎng)和鑒定

原代培養(yǎng)第3天,倒置相差顯微鏡下見成骨細胞從碎骨塊周圍爬出,呈放射狀貼壁生長,形態(tài)不規(guī)則,呈多邊形或三角形,有較多突起,單核卵圓形,1～2個核仁,胞質豐富清晰,ALP染色呈陽性,藍黑色顆粒沉積在細胞質及細胞核ALP活性部位(見圖1)。

2.2 各組成骨細胞中SOX5 mRNA的表達

與空白對照組相比,pcDNA-SOX5組大鼠OB中SOX5 mRNA水平顯著升高(P<0.05),siRNA-SOX5組大鼠OB中SOX5 mRNA水平明顯降低(P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠OB中SOX5 mRNA水平比較

2.3 各組成骨細胞增殖活力

與空白對照組相比,pcDNA-SOX5組大鼠OB增殖活力顯著降低(P<0.05),siRNA-SOX5組大鼠OB增殖活力明顯升高(P<0.05)(見表3)。

表3 各組大鼠OB增殖活力比較

2.4 各組成骨細胞ALP活性

與空白對照組相比,pcDNA-SOX5組大鼠OB中ALP活性顯著降低(P<0.05),siRNA-SOX5組大鼠OB中ALP活性明顯升高(P<0.05)(見表4)。

表4 各組大鼠OB中ALP活性比較

2.5 各組成骨細胞鈣結節(jié)形成情況

倒置顯微鏡下觀察可見細胞呈多層重疊生長,各組細胞間均可見橘紅色鈣化結節(jié);與空白對照組相比,pcDNA-SOX5組大鼠OB鈣化結節(jié)數量和面積顯著降低(P<0.05),siRNA-SOX5組大鼠OB鈣化結節(jié)數量和面積明顯增加(P<0.05)(見圖2、表5)。

表5 各組大鼠OB鈣結節(jié)形成情況

2.6 各組成骨細胞分化及NF-κB信號通路相關蛋白的表達

與空白對照組相比,pcDNA-SOX5組大鼠OB中p-NF-κB p65/NF-κB p65、TNF-α蛋白表達顯著升高,Runx2、Collagen Ⅰ、IκBα表達顯著降低(P<0.05),siRNA-SOX5組大鼠OB中p-NF-κB p65/NF-κB p65、TNF-α蛋白表達明顯降低,Runx2、Collagen Ⅰ、IκBα表達明顯增加(P<0.05)(見圖3、表6)。

表6 各組大鼠OB分化及NF-κB信號通路相關蛋白的表達

3 討論

OB是骨形成的主要功能單位,負責骨骼重塑過程中骨骼基質的合成、分泌和礦化。OB在維持骨量和減少骨質流失中起關鍵作用。刺激OB增殖并促進其分化成熟是調節(jié)骨代謝、促進新骨形成、修復骨缺損的重要方法[12]。MTT法是檢測細胞增殖的指標,可以反映生活細胞的代謝水平。本研究采用MTT法檢測SOX5對OB增殖活性的影響,結果顯示SOX5 mRNA過表達后,對體外培養(yǎng)的OB增殖有明顯的抑制作用,而采用siRNA技術干擾SOX5的表達后,OB增殖率明顯增加;表明沉默SOX5具有促進OB增殖的作用。

OB的增殖通常通過測量細胞總蛋白、ALP活性和Collagen Ⅰ分泌來評估。ALP是OB分泌的一組膜結合糖蛋白,是OB早期分化的特異性標志,ALP活性的高低,能較客觀地反映OB分化成熟的程度[13]。Runx2、Collagen Ⅰ是OB相關的蛋白,在成骨分化活動中起重要的促進作用[4],在增殖階段,OB分泌Collagen I以幫助礦化并減少骨質流失。OB分化成熟后多層重疊生長形成結節(jié)樣結構,并不斷分泌基質和礦物質,形成礦化結節(jié)。茜素紅染色可以評估成骨分化晚期細胞外基質礦化情況鈣化結節(jié)的形成情況[14]。本實驗中,將轉染的OB用成骨培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后,通過ALP活性檢測了SOX5對OB分化的影響,結果顯示SOX5過表達后,ALP活性值較低,OB鈣化結節(jié)數量和面積降低,且Runx2、Collagen Ⅰ表達減少,分析可能與細胞增殖、分化受到抑制有關;而SOX5 mRNA表達下調時,ALP活性、細胞鈣化程度及Runx2、Collagen Ⅰ表達增加。分析沉默SOX5促進成骨細胞ALP活性的原因可能是:(1)與促進細胞增殖有關,OB數量的增加,分泌的ALP也隨之增加;(2)上調ALP mRNA表達水平,促進ALP的分泌,調節(jié)OB的分化。

NF-κB控制主要骨骼細胞類型(破骨細胞[15]、成骨細胞[16]和軟骨細胞[17])的分化或活性。生理和病理性骨重塑的刺激都會影響NF-κB信號轉導[18];NF-κB的啟動子活性主要是由核移位和NF-κB磷酸化引起[19]。在靜息細胞中,NF-κB以NF?κB/IκBα復合物的形式存在于細胞質;在病理條件下,刺激激活核因子抑制劑IκB激酶(IκB kinases,IKKs),該激酶通過靶向將IκBα蛋白降解,釋放NF-κB并允許其核移位和DNA結合,促進TNF-α、IL-1β等炎性因子的表達,減少骨細胞形成,使OB增殖、分化能力降低。研究發(fā)現NF-κB的激活下調OB分化[20];抑制IκBα的降解,穩(wěn)定NF-κB/IκBα復合物,可抑制NF-κB的活化,減少炎性因子的釋放[21-22]。HUANG等[23]發(fā)現在人牙槽骨OB分化中,三七皂苷R1可通過抑制NF-κB通路,逆轉TNF-α誘導的鈣結節(jié)和ALP活性的降低。楊青坡等[24]發(fā)現姜黃素能降低骨組織中NF-κB表達,明顯改善OP大鼠骨密度。在本研究中,我們通過pcDNA3.1質粒轉染構建SOX5過表達OB,發(fā)現大鼠OB中磷酸化NF-κB p65、TNF-α蛋白表達升高,IκBα表達降低,說明NF-κB信號通路被激活;而沉默SOX5的表達后,IκBα表達增加,磷酸化NF-κB p65、TNF-α表達降低,提示NF-κB信號通路被抑制。

綜上所述,沉默SOX5具有促進OB增殖的作用,并可調節(jié)OB的分化,其作用機制可能與抑制NF-κB信號通路的激活有關,過表達SOX5則發(fā)揮相反作用。但本研究尚存在一定不足,未對NF-κB信號通路進行干擾從反面進行驗證;此外,由于體內外環(huán)境的巨大差異,在體內沉默SOX5是否發(fā)揮相同的作用,有待進一步研究。