徐之恒，孫少輝，董友富，唐偉明，徐孝宙，邢軍，李豪，孫劉妹，萬(wàn)進(jìn)，王聰*，張振東*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院(轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院)，江蘇 揚(yáng)州 215001；2. 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 100070；3. 江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；4. 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以母豬的繁殖障礙、生長(zhǎng)豬的呼吸道疾病以及感染豬的繼發(fā)感染為主要臨床表現(xiàn)的重要疫病，給我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。PRRSV分為PRRSV1(歐洲型)與PRRSV2(美洲型)兩個(gè)種，我國(guó)主要以PRRSV2的流行為主[3]。根據(jù)ORF5基因序列，PRRSV2共分為9個(gè)譜系，我國(guó)主要流行4個(gè)譜系(譜系1、3、5、8)[4]。2006年我國(guó)暴發(fā)高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，其nsp2基因存在30個(gè)氨基酸的缺失(1+29)[5]；2013年類(lèi)NADC30毒株傳入我國(guó)，其nsp2基因存在131個(gè)氨基酸的缺失(111+1+19)[6]；2017年開(kāi)始，類(lèi)NADC34毒株在我國(guó)多個(gè)省份被檢出，其nsp2基因的缺失特征為連續(xù)的100個(gè)氨基酸[7]。近年來(lái)，疫苗演化毒株、譜系1的類(lèi)NADC30/NADC34毒株及不同譜系之間的重組毒株頻繁檢出[8-9]，使得PRRSV田間流行毒株呈現(xiàn)出明顯的多樣性和復(fù)雜性，嚴(yán)重困擾著我國(guó)豬場(chǎng)的生產(chǎn)發(fā)展，尤其在生物安全防控較差的豬場(chǎng)，PRRS時(shí)有暴發(fā)流行。為做好PRRS的預(yù)警、防控及凈化工作，臨床生產(chǎn)中往往通過(guò)對(duì)新生仔豬睪丸處理液、家豬口水液、臨斷奶弱仔豬血液等樣本的檢測(cè)，及時(shí)了解豬群PRRSV的感染狀態(tài)，進(jìn)而適時(shí)采取不同的控制措施。因此，建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法對(duì)PRRS的篩查、診斷、防控及凈化工作意義重大[10]。本研究根據(jù)國(guó)內(nèi)PRRSV2不同譜系流行毒株的情況，選取ORF6基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成了1對(duì)引物和1條MGB探針，建立了一種通用型的TaqMan MGB熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)方法，以期為臨床上PRRS的快速診斷及科學(xué)防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸與臨床樣品

豬瘟病毒(CSFV)、PRRSV(歐洲型與美洲型)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的核酸樣本均由本實(shí)驗(yàn)室保存；30份PRRSV陽(yáng)性病料(RT-PCR初檢陽(yáng)性)來(lái)自江蘇省不同地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)。

1.2 主要試劑

Bio Flux Simply P病毒 DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自杭州博日科技股份有限公司；PrimeScript RT reagent Kit購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；2×EsTaqMasterMix(Dye)反應(yīng)酶購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；DL2000 Plus DNA Marker、FastPure Plasmid Mini Kit及AceQ?qPCR Probe Master Mix均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；pMD19-T 載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 主要儀器

PCR擴(kuò)增儀，購(gòu)自美國(guó) Applied Biosystems 公司；CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；瓊脂糖凝膠電泳儀，購(gòu)自北京六一儀器廠；凝膠成像分析系統(tǒng)，購(gòu)自南京麥高德生物科技有限公司。

1.4 引物與探針的設(shè)計(jì)合成

選取PRRSV2不同譜系常見(jiàn)參考毒株ORF6基因的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)并合成熒光定量PCR方法的上下游引物及探針序列。PRRSV2-F：5′-TTGCTAGGCCGCAAGTACAT-3′；PRRSV2-R：5′-GGACGACAAATGCGTGGTTA-3′；PRRSV2-P：5′ FAM-TCTGGCCCCTGCCCA-MGB-3′。引物和探針由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒的制備

以PRRSV2陽(yáng)性樣品的 cDNA作為模板，使用上述引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將PCR 產(chǎn)物凝膠回收并純化后克隆至pMD19-T載體，送至浙江尚亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定，測(cè)序成功的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為p19T-PRRSV2-M。使用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定陽(yáng)性質(zhì)粒濃度，并計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)。質(zhì)粒拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度(μg/mL)×6.02×1023(copies/mol)/質(zhì)粒堿基數(shù)×660(g/mol)。隨后按照泊松分布的原理進(jìn)行10倍倍比稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋至1×108～1×101copies/μL，每次稀釋樣品時(shí)，渦旋儀震蕩30 s，移液槍吹打50次，重復(fù)3次，使質(zhì)粒充分溶解于ddH2O中，做好標(biāo)記，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.6 RT-qPCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用20 μL反應(yīng)體系，2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL，探針(10 μmol/L)0.3 μL，上下游引物(10 μmol/L)分別設(shè)置3個(gè)體積，即0.4、0.6、0.8 μL以優(yōu)化反應(yīng)體系，模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 10 s，分別設(shè)置56 ℃、58 ℃和 60 ℃以優(yōu)化反應(yīng)的退火溫度，退火時(shí)間31 s，循環(huán)數(shù)40個(gè)。將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10倍倍比稀釋后，按照已優(yōu)化的方法進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以Ct值為Y軸，標(biāo)準(zhǔn)品拷貝指數(shù)為X軸，由熒光定量PCR儀自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性試驗(yàn)

用本實(shí)驗(yàn)室保存的PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PCV3、PEDV、PPV的核酸樣本為模板，進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

用1×107～1×104copies/μL的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行RT-qPCR，每個(gè)梯度設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)，根據(jù)檢測(cè)所得Ct值計(jì)算組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)；在不同時(shí)間段(間隔1周)對(duì)不同稀釋度(107、106、105、104copies/μL)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行3次檢測(cè)，根據(jù)所得Ct值計(jì)算組間標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)(CV)。

1.9 臨床樣品的檢測(cè)

取本實(shí)驗(yàn)室從江蘇省部分豬場(chǎng)收集的30份PRRSV陽(yáng)性病料，利用Bio Flux Simply P病毒DNA/RNA提取試劑盒提取PRRSV RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，按照本研究建立的方法進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證本研究建立方法的有效性。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備

使用本研究設(shè)計(jì)的上下游引物擴(kuò)增出目的片段(圖略)，將其克隆至pMD19-T載體上，測(cè)序后與所選區(qū)域的基因序列完全一致。測(cè)定陽(yáng)性質(zhì)粒濃度為203.64 ng/μL，根據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式得出陽(yáng)性質(zhì)粒原始拷貝數(shù)為4.74×1010copies/μL，先將陽(yáng)性質(zhì)粒稀釋至1×1010copies/μL，再按照泊松分布的原理對(duì)其進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)?×108～1×101copies/μL陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。

2.2 反應(yīng)體系和條件的確定

經(jīng)過(guò)退火溫度和引物探針配比的優(yōu)化，最終確定了PRRSV2 TaqMan MGB實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL，探針(10 μmol/L)0.3 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O補(bǔ)充至20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，采集 FAM 通道熒光，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用拷貝數(shù)為1×108～1×101copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行RT-qPCR，每組3個(gè)重復(fù)，設(shè)置1組陰性對(duì)照(模板為ddH2O )。結(jié)果顯示，該基因的擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)較為典型的S型(圖1)，不同稀釋度下的擴(kuò)增曲線間距均勻，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增。以起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為X軸，Ct值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可見(jiàn)不同稀釋度下呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(圖2)。以不同稀釋度下的Ct值(表1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=-3.563x+41.659，R2=0.994，最低檢測(cè)下限為10 copies/μL。

表1 熒光定量PCR批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

圖1 PRRSV2 ORF6基因TaqMan MGB RT-qPCR擴(kuò)增曲線

圖2 PRRSV2 ORF6基因TaqMan MGB RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 特異性試驗(yàn)

使用本研究建立的PRRSV2 ORF6基因 TaqMan MGB RT-qPCR方法對(duì)PRRSV1、PRRSV2、CSFV、 PRV、PCV2、PCV3、PEDV、PPV的核酸及陰性對(duì)照(ddH2O)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，只有PRRSV檢測(cè)為陽(yáng)性，其他核酸和陰性對(duì)照均為陰性，表明本研究建立的方法具有良好的特異性。

圖3 PRRSV2 ORF6基因TaqMan MGB RT-qPCR方法的特異性檢測(cè)結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

將p19T-PRRSV2-M質(zhì)粒原液稀釋至1×107～1×104copies/μL進(jìn)行批內(nèi)與批間重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.55%、0.16%、0.34%和0.31%(表1)；批間變異系數(shù)分別為1.68%、1.32%、1.28%和1.07%(表2)。

表2 熒光定量PCR批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 PRRSV臨床陽(yáng)性樣品的檢測(cè)

使用本研究建立的方法對(duì)30份PRRSV陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，30份陽(yáng)性樣品均具有明顯的擴(kuò)增曲線，陽(yáng)性率100%，Ct值區(qū)間范圍在22～36(圖4)，表明本試驗(yàn)所建立的方法可用于臨床樣品的檢測(cè)。

圖4 臨床陽(yáng)性樣品的RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前PRRS的防控依然是我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)面臨的最重大問(wèn)題之一。不管是后備豬的更新入群，還是仔豬的保健免疫，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室手段進(jìn)行早期PRRSV的評(píng)估篩查，及時(shí)發(fā)現(xiàn)隱性帶毒豬，對(duì)PRRS的防控具有非常重要的意義[11-12]。2017年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對(duì)全國(guó)核心育種場(chǎng)提出了PRRS的凈化要求和標(biāo)準(zhǔn)，即連續(xù)24個(gè)月以上無(wú)PRRS臨床病例，且野毒感染病原學(xué)和抗體陰性，所以PRRS的凈化工作更是離不開(kāi)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。匈牙利通過(guò)實(shí)驗(yàn)室連續(xù)檢測(cè)，結(jié)合滅活苗免疫及后備豬更新的方式實(shí)現(xiàn)了PRRS的凈化[13]。2018年非洲豬瘟傳入我國(guó)，為做好病原的早期篩查及精準(zhǔn)剔除，RT-qPCR檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用[14]，極大地推動(dòng)了我國(guó)動(dòng)物疫病檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展，這也更有利于我國(guó)PRRS等疫病的防控與凈化工作。

PRRSV是一種單股正鏈RNA病毒，全長(zhǎng)約15 kb，具有快速變異與演化的特性[3-4]。近年來(lái)，我國(guó)PRRSV2的流行毒株發(fā)生變化，且多樣性和復(fù)雜性明顯增多[15]，因此，建立一種特異性強(qiáng)、敏感度高的通用型檢測(cè)方法對(duì)當(dāng)前PRRS的診斷監(jiān)控非常重要。PRRSV至少含有10個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼多種非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白[16]，本研究通過(guò)大量比對(duì)GenBank上登錄的PRRSV2不同譜系毒株的片段序列，發(fā)現(xiàn)編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白M的ORF6基因上存在一段高度保守序列，設(shè)計(jì)了特異性擴(kuò)增PRRSV2不同譜系毒株ORF6基因的引物對(duì)和探針。TaqMan-MGB探針是在經(jīng)典TaqMan方法上經(jīng)改良后發(fā)展而來(lái)的一種水解型探針，特異性大大增強(qiáng)，目前多種動(dòng)物病原的RT-qPCR檢測(cè)方法對(duì)TaqMan-MGB探針進(jìn)行了更新與優(yōu)化，且表現(xiàn)出了非常好的應(yīng)用效果[17-19]。本研究通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，在進(jìn)行敏感性、特異性、重復(fù)性試驗(yàn)后，建立了檢測(cè)PRRSV2 ORF6基因的TaqMan MGB探針RT-qPCR方法，該方法對(duì)CSFV、PRV、PCV2等常見(jiàn)的病原均無(wú)交叉反應(yīng)，對(duì)不同滴度的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板均具有典型的擴(kuò)增曲線，Ct值與濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，最低檢出濃度為10 copies/μL，相比于已報(bào)道的普通PCR方法，敏感性顯著提高且檢測(cè)時(shí)間大大縮短[20-21]。重復(fù)性試驗(yàn)顯示組間與組內(nèi)的離散度小，表明該方法具有良好的重復(fù)性。對(duì)30份PRRSV陽(yáng)性樣品(血樣、唾液樣、組織樣、睪丸處理液等)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性，但與初檢Ct值存在0.5～1.2的差異，這可能與樣品長(zhǎng)期存放的核酸降解有關(guān)。

綜上，本研究所建立的TaqMan MGB探針RT-qPCR方法是一種特異、靈敏、高效且可應(yīng)用于臨床上不同種類(lèi)樣品的檢測(cè)方法，為PRRSV2感染的快速診斷及防控凈化提供了技術(shù)手段。