代昕宇，胡博，鄧效禹，張成琪，李昀真，李甜甜，孫亞杰，許麗文，白雪

(中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112)

犬細小病毒(canine parvovirus，CPV)屬于細小病毒科、細小病毒亞科的原細小病毒屬。細小病毒科由具有4～6 kb線性基因組的無囊膜單鏈DNA病毒組成，直徑18～26 nm，可感染多種動物[1]。原細小病毒屬包括貓細小病毒(feline parvovirus，F(xiàn)PV)、CPV、水貂腸炎病毒(mink parvovirus，MEV)和浣熊細小病毒(rabbacon parvovirus，RPV)[2]。CPV于20世紀70年代末從一種類似FPV的原始病毒中出現(xiàn)，可能是通過物種間跳躍獲得了感染家養(yǎng)犬的能力[3]。CPV的線性單鏈DNA(ssDNA)基因組全長約5 kb，具有2個開放閱讀框(ORF)，編碼2個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)和2個形成病毒衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白(VP1和VP2)[4]。

CPV感染是引起犬死亡的主要原因之一，潛伏期3～7 d，發(fā)病犬出現(xiàn)嚴重的腸胃炎、嗜睡、嘔吐、發(fā)熱等癥狀，病程中腸道組織中廣泛自溶，腸道固有層塌縮，隱窩數(shù)量減少，可見的隱窩中增生性細胞發(fā)生大量堆積[5-7]。CPV對未接種疫苗幼犬的感染率和致死率都很高，可能會在衛(wèi)生條件較差或未接種疫苗的犬舍暴發(fā)大規(guī)模的疫情[4]。

病毒純化是制備高質(zhì)量抗體或更高安全性疫苗的必要條件。常規(guī)的實驗室純化病毒方法包括差速離心、蔗糖密度梯度離心、大分子沉淀和層析純化等。蔗糖密度梯度離心的方法通常在實驗室中采用，純化少量細小病毒或病毒樣顆粒[8-9]，但該方法所用儀器昂貴，基本無法進行擴大生產(chǎn)。層析方法對病毒粒子損傷較小，操作簡便，并且能夠?qū)崿F(xiàn)大量制備，已應用于多種病毒和病毒樣顆粒的純化，以去除生物制品中的病毒污染物[10]。本試驗建立了一種用于純化CPV的層析方法，為犬細小病毒病的疫苗、診斷及治療制品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和耗材

MEM培養(yǎng)基購于Gibco公司，F(xiàn)BS購自上海牛耳生物科技有限公司。辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG購自 BBI生命科學有限公司；抗CPV VP2鼠源單克隆抗體由本團隊制備并保存。0.22 μm濾膜和超濾管購自默克-密理博公司；超濾膜包購自Sartorius公司；犬細小病毒檢測試紙購自快靈生物有限公司。Sepharose 4 Fast Flow(Sepharose 4FF)填料及層析柱購自博格隆(上海)生物技術(shù)有限公司；Purose shell V15填料購自嘉興千純生物有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和病毒增殖

CPV-ZCS株、F81細胞均由本實驗室保存。在37 ℃，5% CO2環(huán)境下，使用含8% FBS的血清培養(yǎng)F81細胞至長滿單層，傳代后按照感染比(MOI)為0.1接種CPV-ZCS，繼續(xù)培養(yǎng)至90%細胞發(fā)生病變后收獲病毒，反復凍融3次以裂解細胞，收取病毒液。

1.3 病毒初步澄清和濃縮

將病毒液5 000 r/min 離心30 min以初步澄清后，通過50 kDa膜包超濾系統(tǒng)對回收的病毒液進行25倍濃縮并進一步去除病毒液中的細胞碎片。

1.4 病毒的層析純化

以濃縮后的病毒液作為樣品，上樣量5 mL，使用AKTA蛋白層析系統(tǒng)分別在Sepharose 4FF填料和Purose shell V15填料中進行層析純化，緩沖液為20 mmol/L PBS溶液，在1 mL/min的流速下收取紫外光(UV)280 nm監(jiān)測圖譜中出現(xiàn)洗脫峰中的每1 mL流穿液，以細小病毒病原檢測試紙初步判斷病毒所在UV峰，并用血凝試驗進一步確定，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 純化后病毒的超濾管濃縮

將病毒峰的流穿液合并成一管后加入30 kDa超濾管中，5 000 r/min離心30 min，取超濾管中未透過濾膜的液體，-80 ℃凍存。

1.6 純化后產(chǎn)物的SDS-PAGE及Western blot檢測

取純化后UV值最高的病毒液1 mL，以CPV病毒液作為陽性對照，F(xiàn)81細胞總蛋白作為陰性對照，以1% BSA作為牛血清相關(guān)蛋白對照，將各樣品上樣于10% SDS-PAGE進行分離后，使用考馬斯亮藍染色液進行染色，觀察樣品中的蛋白條帶；另取凝膠分離后的樣品，通過半干式轉(zhuǎn)膜將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至0.45 μm的硝酸纖維(NC)膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h后，PBST清洗3次，每次5 min，加入1∶2 000稀釋后的CPV VP2單抗作為一抗孵育2 h，PBST清洗3次，加入 1∶10 000稀釋后的HRP標記的山羊抗小鼠IgG孵育1 h，PBST清洗3次，最后使用DAB顯色試劑盒進行染色并觀察NC膜上的蛋白條帶。

1.7 總蛋白去除率和病毒回收率測定

用BCA法測定層析前后的蛋白含量，計算出總蛋白去除率。將CPV VP2單抗作為包被抗體，HRP標記的山羊抗小鼠IgG作為酶標二抗，以ELISA雙抗體夾心法檢測病毒液和純化樣品中的病毒含量，計算病毒回收率。

1.8 電鏡觀察

采用常規(guī)負染法對純化后的病毒液進行染色，日立(日本)H8100透射電子顯微鏡觀察。

1.9 病毒的血凝性檢測

采用血凝試驗對不同純化步驟的病毒進行血凝價的檢測，血凝方法參考文獻[11]，在96孔V型血凝板上，每孔加入25 μL pH=7.2 的PBS溶液，向第1排分別加入25 μL病毒液、濃縮后的病毒與純化后的細小病毒，每組2個重復，進行2倍倍比稀釋，加入1%的仔豬血紅細胞，混勻后4 ℃孵育1 h，將96孔板立起觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 層析圖譜分析

澄清及濃縮后的病毒層析圖譜見圖1，使用快速試紙條檢測發(fā)現(xiàn)，Sepharose 4FF流穿液中，流穿峰2為唯一含有病毒的峰；而在Purose shell V15中，流穿峰1是唯一檢測出病毒的峰。經(jīng)血凝試驗進一步確定(見表1)，發(fā)現(xiàn)Sepharose 4FF流穿峰3和Purose shell V15流穿峰2中存在少量病毒。

表1 各取樣點血凝效價檢測 log2

圖1 Sepharose 4FF(A)和Purose shell V15(B)層析圖譜

2.2 純化后病毒液總蛋白去除率和病毒回收率

由表2可知，2種層析填料的總蛋白去除率均在97%以上，但Purose shell V15更高，可達99%以上。ELISA試驗結(jié)果顯示Purose shell V15填料純化后的病毒回收率更高，達到81.43%。

表2 2種層析柱純化后的病毒液總蛋白去除率和病毒回收率

2.3 SDS-PAGE和Western blot檢測

細小病毒含有3種結(jié)構(gòu)蛋白，VP1(84 kDa)，VP2(67 kDa)和VP3(63 kDa)，其中VP3由VP2通過宿主蛋白酶裂解產(chǎn)生[12]。經(jīng)層析純化后，選取抗原試紙測定含有病毒的UV峰，取最高峰的1 mL樣品進行SDS-PAGE和Western blot檢測。由圖2可見，Purose shell V15純化后可見VP1與VP2蛋白條帶，Sepharose 4FF純化后僅可見VP2條帶，且含有部分牛血清蛋白。由圖3可見，兩種層析填料純化樣品均可見Western blot目標條帶，但 Purose shell V15純化后目標條帶更明顯。

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準(100 kDa)；1. 陰性對照(F81細胞蛋白)；2. 陽性對照(CPV病毒液)；3. Sepharose 4FF純化樣品；4. Purose shell V15純化樣品；5. 1% BSA對照。

2.4 電鏡檢測

電鏡下觀察病毒，結(jié)果如圖4所示，完整的病毒粒子大小約20 nm，呈二十面體結(jié)構(gòu)。

圖4 Purose shell V15(A)和Sepharose 4FF(B)純化樣品電鏡檢測結(jié)果

2.5 血凝試驗

對各步驟所得樣品進行血凝試驗，觀察孵育后完全凝集的孔數(shù)，確定血凝效價。結(jié)果如表3所示，使用2種層析填料純化后血凝效價稍有降低，超濾管濃縮后血凝效價明顯增加，病毒液濃度上升。

表3 血凝試驗結(jié)果(血凝效價) log2

3 討論

層析純化作為一種常用的病毒粒子純化方法，與離心方法相比有著上樣量大、易于放大的優(yōu)點，并且更容易保持病毒粒子的抗原性[13]，因此在工業(yè)上大規(guī)模應用于滅活疫苗的純化制備。本試驗采用2種不同填料的層析柱，通過層析將濃縮后的病毒液中各個組分分開后，用SDS-PAGE和Western blot確定了適合于細小病毒純化的層析柱類型、基本過程參數(shù)和病毒主要所在的UV峰，最后使用電鏡確定了純化后病毒的形態(tài)。

層析柱上樣時對于病毒液的澄清度和濃度都有一定的要求，本試驗采用離心和切向流過濾的方式進行病毒上樣前的預處理。低速離心(5 000 r/min)可以去除病毒液中的大部分固體顆粒，有助于減小病毒在切向流過濾中受到的剪切力。膜包切向流過濾是一種通過可選孔徑(30～300 kDa)的吸附性薄膜分離組分的技術(shù)，廣泛應用于生物制品的下游純化工藝中[14]。本試驗中根據(jù)細小病毒粒子大小，選用50 kDa膜包通過切向流過濾分離病毒與病毒液中的其他液體組分，達到提高留存液中病毒濃度的效果。另外，在層析試驗過程中，發(fā)現(xiàn)由于細小病毒體積與分子量較小，分子篩填料無法將細小病毒與大部分雜質(zhì)分離，而帶有離子配基的Purose shell V15填料能夠?qū)⒉《痉蛛x在體積很小的UV峰中，對于細小病毒的分離更有優(yōu)勢。

綜上，本試驗建立的層析純化方法能夠得到高純度的CPV粒子，具有較好的總蛋白去除率和病毒回收率，為抗體篩選和疫苗制備提供了良好的原材料，為后續(xù)進一步的研究奠定了基礎(chǔ)。