黃心河，張亞峰，伍鋼，陳雨濤，周瀟，張源淑，韓正康

(南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生理生化重點開放實驗室，江蘇 南京 210095)

乳腺是哺乳動物特有的器官，負責乳汁的合成與分泌，良好的發(fā)育是乳腺充分發(fā)揮泌乳功能的前提，對畜牧業(yè)生產(chǎn)及動物子代的生長發(fā)育具有重要影響。乳腺發(fā)育先后歷經(jīng)胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期和退化期5個階段[1]，其中退化期是乳腺發(fā)育過程中的一個重要階段?？s短乳腺的退化時間，延緩乳腺的退化，延長泌乳期可以發(fā)揮出奶牛、奶山羊等乳用動物的最大經(jīng)濟價值，對畜牧業(yè)生產(chǎn)提質(zhì)增效具有重要意義。

乳腺退化始于腺體內(nèi)的乳汁郁積[2]，乳腺上皮細胞分泌活動停止，細胞體積逐漸減小并開始凋亡，同時腺體重塑恢復(fù)至孕前狀態(tài)[3]。動物機體通過多種內(nèi)分泌激素和細胞因子對退化期的乳腺凋亡嚴密調(diào)控，維護乳腺的內(nèi)分泌平衡，確保乳腺周期性的泌乳性能正常[4]。研究表明，雌激素(E)是乳腺重塑和功能調(diào)節(jié)的重要驅(qū)動因子[5]，催乳素(PRL)[6]、生長激素(GH)[7]、胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)[7-8]和腫瘤壞死因子α(TNF-α)[8-9]對乳腺上皮細胞凋亡的調(diào)節(jié)均具有重要作用。

植物雌激素是天然存在的一類非甾體酚類植物化合物，大豆黃酮(DZ)屬于異黃酮類植物雌激素之一，化學結(jié)構(gòu)與17-β-雌二醇(E2)相似，能與雌激素受體(ER)結(jié)合，從而表現(xiàn)出雌激素活性和抗雌激素活性[10]。研究表明，DZ可促進乳腺上皮細胞的增殖和乳腺發(fā)育[11]，表現(xiàn)出雌激素激動劑的促進作用，與多種激素協(xié)同促進乳腺發(fā)育及泌乳[12]，同時影響凋亡相關(guān)蛋白的表達[13]，顯示了DZ在調(diào)控乳腺發(fā)育方面的開發(fā)潛力。DZ對乳腺的發(fā)育以及泌乳等方面的影響已有研究，但如何影響乳腺的退化尚未見詳細報道。

本試驗使用DZ處理妊娠中期小鼠，于斷奶的不同時期采樣檢測，通過測定血清中相關(guān)激素和細胞因子含量、觀察乳腺的組織學變化及檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達量等，初步探討DZ對斷奶期乳腺退化的影響，為植物雌激素DZ在乳用動物生產(chǎn)中利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 DZ和試劑

DZ由南京農(nóng)業(yè)大學韓正康教授贈送(純度>98%)；鼠源E2、PRL、IGF-Ⅰ ELISA 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；組織/細胞裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF及兔β-tubulin抗體均購自南京巴傲得生物科技有限公司；兔Bax和兔Bcl-2抗體購自Cell Signaling Technology公司；羊抗兔IgG購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；PVDF膜購自美國密理博公司；ECL顯色液購自翌圣生物科技公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自艾科瑞公司；TRIzol試劑、qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒購自Vazyme Biotech公司；異丙醇購自上海試四赫維化工有限公司；DEPC水購自南京生興有限公司等。

1.2 儀器與設(shè)備

POWER-PAC 300電泳儀和POWER-PACHC轉(zhuǎn)印儀均購自BIO-RAD公司(美國)；全自動化學發(fā)光圖像分析儀購自天能公司(中國上海)；RT-qPCR儀(羅氏LightCycler96)；BioPhotometer-D30核酸蛋白測定儀(德國)；酶標儀購自Tecan公司(瑞士)；組織研磨儀購自賽維爾公司(中國武漢)等。

1.3 實驗動物

SPF級ICR小鼠，7周齡，雌性48只，雄性24只，購自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司，動物許可證號：SCXK(浙)2019-0002。飼養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(22±2)℃，相對濕度50%～60%，12 h光照和12 h黑暗條件下，自由飲食和飲水。統(tǒng)一飼喂生長繁殖飼料，飼料配方包括東北玉米、小麥、西班牙苜蓿草、秘魯魚粉、美國雞肉粉、植物油、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等。飼料由本實驗室提供。

1.4 試驗分組及處理

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將雌雄小鼠以2∶1的比例混籠飼養(yǎng)，通過觀察陰道栓判斷雌鼠是否受精，有陰道栓出現(xiàn)的記為懷孕0.5 d。將孕鼠隨機分為對照組(CON組)、大豆黃酮組(DZ組)，每組24只。在母鼠懷孕14 d開始，每日下午15：00，DZ組按照每kg體重100 mg的劑量腹腔注射DZ，CON組注射等量的無菌PBS處理，連續(xù)7 d。試驗期間觀察發(fā)現(xiàn)小鼠精神狀況良好，飲水飲食及活動均正常，懷孕和分娩過程中無異常情況發(fā)生，符合試驗條件。試驗在南京農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心進行，經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心動物倫理委員會批準。

1.5 樣品采集

孕鼠正常分娩后，于哺乳期第10 天強制斷奶。在斷奶1、3及7 d這3個時間每組各取8只小鼠，禁食12 h后稱重。采集血液后頸椎脫臼處死小鼠，剝離皮膚采集小鼠全部乳腺組織并稱重。收集的血液經(jīng)3 000 r/min 離心15 min，獲得血清于-20 ℃保存。取第4對乳腺組織用于4%多聚甲醛固定，剩余乳腺組織置于-80 ℃凍存。

1.6 指標測定

1.6.1 乳腺指數(shù)的測定

將小鼠解剖后取出的所有乳腺稱重并記錄，計算乳腺指數(shù)(乳腺濕重/小鼠體重×100%)。

1.6.2 血清E2、PRL及IGF-Ⅰ濃度的測定

用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒測定血清中E2、PRL及IGF-Ⅰ濃度，按照試劑盒說明書要求操作測定。

1.6.3 小鼠乳腺組織切片HE染色及乳腺退化情況的量化計算

組織切片由南京農(nóng)業(yè)大學病理組制作。蘇木精-伊紅(HE)染色：將固定好的乳腺組織脫水、透明，之后石蠟包埋，常規(guī)法制作組織切片。光學顯微鏡下觀察乳腺組織的變化。

參照Chapman[14]方法，以脂肪細胞占據(jù)的腺體面積以及腺泡所占據(jù)的腺體面積作為指標，對發(fā)生的乳腺退化情況量化處理。各時期每組分別選取10個100倍放大的視野，利用Image J軟件計算每個視野中脂肪細胞的面積以及腺泡的面積，得出兩者面積分別占視野總面積的百分比，以直方圖形式表示。

1.6.4 熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測乳腺組織中凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2的表達

TRIzol一步法提取乳腺組織總RNA，測定RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板RT-qPCR檢測。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物序列(表1)，引物由北京擎科生物股份有限公司合成。

表1 RT-qPCR相關(guān)基因引物序列

1.6.5 Western blot檢測乳腺組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達

稱取約35 mg的乳腺組織，加入預(yù)冷的裂解液RIPA(含PMSF)勻漿后，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液BCA法測定蛋白濃度，統(tǒng)一蛋白濃度為5 μg/μL，加上樣緩沖液，100 ℃變性10 min制樣。每孔上樣50 μg，進行SDS-PAGE，然后濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h后加入一抗Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、β-tubulin(1∶10 000)，4 ℃孵育過夜。次日TBST漂洗，加入辣根過氧化物酶標記的1∶10 000羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h。洗滌后加入ECL發(fā)光液，全自動化學發(fā)光分析儀中檢測，Image J軟件分析各條帶灰度值。以β-tubulin為內(nèi)參，比較目的條帶相對灰度值。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 21.0軟件進行方差分析，GraphPad Prism 8.0軟件作圖，試驗結(jié)果均以“平均值±標準誤”表示，其中P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 DZ處理對斷奶期小鼠乳腺指數(shù)的影響

結(jié)果如圖1所示。與CON組相比，斷奶1 d時DZ組乳腺指數(shù)顯著增加(P<0.05)；斷奶3 d和7 d時DZ組乳腺指數(shù)有所降低，變化不明顯。但與斷奶1 d相比，斷奶3 d和7 d時CON組及DZ處理組乳腺指數(shù)均極顯著降低(P<0.01)。

注：同一時間點與對照組相比，* 表示差異顯著(P<0.05)；與斷奶1 d時相比，##表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

2.2 DZ處理對斷奶期小鼠血清中E2、PRL及IGF-Ⅰ濃度的影響

如表2所示，斷奶1 d時，與CON組相比，DZ處理降低了母鼠血清中E2濃度，顯著提高了血清中PRL(P<0.05)及IGF-Ⅰ濃度(P<0.01)。斷奶3 d時，與CON組相比，DZ處理極顯著提高了血清中E2(P<0.01)和PRL濃度(P<0.01)，IGF-Ⅰ含量無顯著變化。斷奶7 d時，與CON組相比，DZ處理提高了血清中E2濃度(P<0.05)，血清中IGF-Ⅰ和PRL濃度無顯著變化。

表2 不同斷奶期小鼠血清中E2、PRL、IGF-Ⅰ 濃度(n=8)

2.3 斷奶期母鼠乳腺組織形態(tài)學變化

如圖2所示，CON組在斷奶1 d時乳腺組織被腺泡充斥，且腺泡結(jié)構(gòu)完整內(nèi)充滿乳汁及其他分泌物。隨著斷奶時間延長，乳腺組織內(nèi)腺泡縮小且脂肪組織重新出現(xiàn)，到斷奶7 d時乳腺組織已全部被脂肪組織及結(jié)締組織所占據(jù)。DZ處理組乳腺組織中變化與CON組較一致，但相比于CON組，DZ組腺泡更大且結(jié)構(gòu)較為完整。斷奶3 d時，DZ處理組減少了脂肪細胞的增多，且緩解了腺泡大范圍縮小及數(shù)量減少的情況；斷奶7 d時，相對于CON組乳腺組織被豐富的脂肪組織和結(jié)締組織包圍的情況，DZ組還存在極少量完整的導管及腺泡。提示：DZ處理有減緩乳腺退化作用，但在斷奶早期階段效果更優(yōu)。

圖2 DZ處理對乳腺組織形態(tài)的影響(HE,比例尺=50 μm)

為了量化已經(jīng)發(fā)生的退化量，測量了脂肪細胞占據(jù)的腺體面積，以及腺泡占據(jù)的腺體面積。如圖3所示，與CON組相比，DZ處理組在斷奶1 d、3 d和7 d三個時間點母鼠的腺泡面積比均有所增加，其中斷奶3 d時，DZ處理組較CON組差異顯著(P<0.05)；同時與CON組相比，DZ處理組乳腺組織中脂肪細胞面積比均顯著降低(P<0.05)，且隨斷奶時間的延長，腺泡比例的下降與脂肪細胞占比增加呈正相關(guān)。

圖3 DZ對斷奶期小鼠乳腺退化的影響

2.4 DZ對斷奶期小鼠乳腺組織中Bax和Bcl-2基因表達的影響

與CON組相比，斷奶1 d時(圖4A)，DZ組極顯著下調(diào)了凋亡基因Bax(P<0.01)的表達，同時極顯著增加了Bcl-2/Bax表達的比值(P<0.01)；斷奶3 d時(圖4B)，DZ組極顯著下調(diào)了Bax的表達水平(P<0.01)，同時極顯著上調(diào)了Bcl-2基因的表達水平(P<0.01)，且DZ處理后極顯著增加兩者的比值(P<0.01)；斷奶7 d時(圖4C)，DZ處理后均極顯著下調(diào)了Bax和Bcl-2基因的表達水平(P<0.01)，DZ組顯著增加Bcl-2與Bax表達的比值(P<0.05)。

注：同一指標與對照組比較，*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

2.5 DZ對斷奶期小鼠乳腺組織中Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

與CON組相比，斷奶1 d時(圖5)，DZ組極顯著上調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平(P<0.01)，上調(diào)了凋亡蛋白Bax的表達水平(P>0.05)，同時極顯著增加了Bcl-2/Bax比值(P<0.01)；斷奶3 d時(圖6)，DZ組極顯著降低了Bax的表達水平(P<0.01)，且極顯著提高了Bcl-2的表達水平(P<0.01)，同時也極顯著增加了Bcl-2/Bax比值(P<0.01)；斷奶7 d時(圖7)，DZ組極顯著極提高了Bax和Bcl-2蛋白的表達水平(P<0.01)。

圖5 DZ對斷奶1 d小鼠乳腺組織Bax、Bcl-2蛋白表達水平的影響

圖6 DZ對斷奶3 d小鼠乳腺組織Bax、Bcl-2蛋白表達水平的影響

圖7 DZ對斷奶7 d小鼠乳腺組織Bax、Bcl-2蛋白表達水平的影響

3 討論

乳腺組織結(jié)構(gòu)大體可分為具有泌乳功能的實質(zhì)(腺泡和導管系統(tǒng))和起支持作用的間質(zhì)(主要是結(jié)締組織和脂肪組織)[15]。腺泡作為泌乳的基本單位，其數(shù)目決定泌乳能力[16]。幼畜斷奶后，乳頭失去了吮吸刺激，腺泡腔內(nèi)乳汁無法正常排出，乳腺分泌活動停止同時其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，乳腺組織及導管退化并被增殖的結(jié)締組織和脂肪組織所取代[17]。Bennetts等于1946年首次發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮可以引起空懷山羊的乳頭增長，甚至出現(xiàn)泌乳現(xiàn)象，提示異黃酮植物雌激素可以影響乳腺的發(fā)育和泌乳。劉春龍等[11]研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度范圍的DZ能促進奶牛乳腺上皮細胞的增殖。本研究結(jié)果顯示，隨斷奶時間延長乳腺腺泡面積比不斷下降，脂肪細胞占比不斷增加，這與李健等[18]的研究結(jié)果一致。與CON組相比，DZ處理后提高了斷奶期小鼠乳腺中腺泡的面積比，降低了脂肪組織的面積比；同時乳腺指數(shù)結(jié)果顯示，在斷奶1 d時，DZ組的乳腺指數(shù)增加，各組乳腺指數(shù)隨著斷奶時間延長乳腺指數(shù)不斷減小，斷奶3 d、7 d時DZ處理降低了母鼠的乳腺指數(shù)。提示DZ可能是通過增加腺泡比例，減緩脂肪細胞在乳腺組織中分化增殖的進程，從而影響乳腺的退化過程。

卵巢分泌的雌激素在哺乳動物乳腺生長發(fā)育的過程中扮演者重要的角色，它可通過與雌激素ER結(jié)合來影響乳腺發(fā)育，同時協(xié)同其他激素促進腺泡發(fā)育及乳汁生成[4]，但大劑量的E2在體內(nèi)易殘留且有毒害作用，會引起發(fā)育、生殖、行為等方面的異常變化。DZ是來自大自然的純天然藥物，與E2相比具有不良反應(yīng)小且安全的優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)DZ能與ER結(jié)合，表現(xiàn)出雌激素和抗雌激素活性[19]。同時本研究結(jié)果顯示，斷奶1 d時DZ組的血清E2含量低于CON組，DZ可能是通過與內(nèi)源性雌激素競爭ER，占據(jù)受體結(jié)合部位，發(fā)揮抗雌激素作用降低E2含量；而隨斷奶時間的延長，DZ通過發(fā)揮其雌激素樣作用使得血清中的E2含量提高，發(fā)揮雌激素樣作用，從而影響著乳腺的發(fā)育情況。PRL是一種由垂體泌乳素合成和分泌的肽激素，IGF-Ⅰ是乳腺生長發(fā)育的旁分泌因子之一。乳腺退化過程中受誘導凋亡和抑制增殖雙重因素的影響，乳腺上皮細胞數(shù)目不斷下降[4]。研究發(fā)現(xiàn)，PRL可對退化期的細胞死亡進行調(diào)控[7]，維持乳腺細胞的數(shù)量[1]。韓正康[20]研究發(fā)現(xiàn)，異黃酮類植物雌激素可與動物乳腺、垂體、下丘腦的ER競爭性結(jié)合，誘發(fā)血中PRL水平升高。另有研究證實DZ可通過PRL間接發(fā)揮作用[21]。本研究結(jié)果顯示，DZ處理后提高了斷奶期內(nèi)母鼠血清中的PRL含量，將血清中PRL含量在斷奶7 d內(nèi)維持在較高水平，當再次恢復(fù)泌乳時，高水平的PRL利于泌乳同時保持乳腺細胞數(shù)量，從而減少細胞凋亡，影響乳腺的退化。IGF-Ⅰ在乳腺退化過程中參與乳腺組織的重建，其作用由胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)來調(diào)節(jié)。乳腺細胞的生長與凋亡取決于乳腺中IGFBP-5與IGF-Ⅰ之間的相對平衡[22]。IGFBP-5可通過高親和力與IGF-Ⅰ結(jié)合，阻止IGF-Ⅰ與其受體IGF-ⅠR的相互作用，從而抑制IGF-Ⅰ介導的細胞生存，調(diào)控乳腺退化[23]。研究發(fā)現(xiàn)在妊娠母豬日糧中補充DZ能提高血清IGF-Ⅰ中含量[24]。本研究結(jié)果也顯示，DZ處理后提高了斷奶期內(nèi)血清IGF-Ⅰ含量。據(jù)報道由E2激活的核受體刺激IGF-Ⅰ的局部合成[25]，DZ處理后可能通過提高血清E2濃度，從而上調(diào)IGF-Ⅰ的表達，增加IGF-Ⅰ與其受體的親和力，抑制IGFBP-5表達，提高乳腺上皮細胞的存活率，更好發(fā)揮IGF-Ⅰ作為細胞生存因子促進有絲分裂抑制乳腺凋亡的作用，詳細機理有待進一步研究。

乳腺的退化分為2個階段：第一階段是由乳停滯引發(fā)溶酶體介導的細胞死亡，發(fā)生在斷奶48 h內(nèi)，導致乳腺上皮細胞發(fā)生廣泛的程序性細胞死亡，引起上皮細胞數(shù)量減少，此階段乳腺在哺乳刺激下可重新泌乳[2]；第二階段發(fā)生在斷奶2～7 d，主要是由線粒體介導的細胞凋亡來進行[3]，引發(fā)腺泡塌陷、細胞外基質(zhì)重塑、脂肪細胞的分化及細胞凋亡[2]。Bcl-2相關(guān)蛋白是影響乳腺上皮細胞凋亡的細胞內(nèi)信號介導者，在調(diào)節(jié)乳腺退化中發(fā)揮關(guān)鍵作用?？沟蛲鯞cl-2基因缺乏會加速乳腺細胞凋亡，其過表達可抑制乳腺第二階段的退化，促凋亡Bax基因缺失會延緩乳腺的退化[26]。Kuma等[13]研究發(fā)現(xiàn)，DZ可通過介導細胞凋亡的內(nèi)在途徑影響B(tài)ax與Bcl-2蛋白的比值。在細胞內(nèi)Bcl-2和Bax蛋白之間的相互作用是拮抗性的，細胞凋亡由Bcl-2/Bax比值的變化調(diào)節(jié)[27]。因此，Bcl-2/Bax比值通常用于檢測細胞凋亡效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，DZ處理可能通過提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，抑制促凋亡蛋白Bax的表達，增加Bcl-2/Bax的比值，使乳腺抗凋亡的過程處于優(yōu)勢，抑制細胞的凋亡。但在斷奶7 d時，DZ抑制凋亡的作用不明顯，DZ可能通過抑制細胞的凋亡進程來延緩乳腺的早期退化過程。

綜上，本研究顯示植物雌激素DZ可通過間接提高斷奶母鼠血清中IGF-Ⅰ、PRL含量發(fā)揮其促生存作用，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達，增加Bcl-2/Bax比值，抑制細胞凋亡進程，減少乳腺上皮細胞的凋亡，同時降低脂肪細胞所占面積比，減緩脂肪細胞在乳腺組織中分化增殖的進程，延緩乳腺的早期退化過程。