■ 楊富貴 王娟紅，2，3* 張橋橋 常衛(wèi)華，2，3* 陳彬龍 吉能伍各 舒 豪 唐馨怡 蒲 彬

（1.西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，四川西昌 615013；2.四川攀西動(dòng)物疫病檢測與防控實(shí)驗(yàn)室，四川西昌 615013；3.四川地方特色山羊重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川西昌 615013）

口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的多發(fā)于豬、牛、羊等偶蹄目動(dòng)物的一種急性、烈性、熱性、高度接觸性傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織已將其列為A 類傳染病之首，其對畜牧業(yè)發(fā)展和人類食品衛(wèi)生安全構(gòu)成巨大威脅，目前主要以接種疫苗的方式來保護(hù)易感動(dòng)物，通過檢疫淘汰來凈化畜群[1]。由于檢疫淘汰需要強(qiáng)有力的財(cái)政支持，世界上大部分國家以接種疫苗預(yù)防為主，也正因如此，口蹄疫領(lǐng)域的科學(xué)家都在積極開展不同類型疫苗及不同形式免疫程序方面的研究，利用最經(jīng)濟(jì)有效的疫苗和最佳的免疫程序來預(yù)防口蹄疫的發(fā)生[2]。我國大部分地區(qū)，根據(jù)生產(chǎn)實(shí)踐，結(jié)合當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)殖模式，設(shè)定不同的免疫程序。對于口蹄疫疫苗初免的時(shí)間不同，學(xué)者也有不同看法，劉賀等[3]認(rèn)為，首次免疫的時(shí)間應(yīng)該與國家要求的70%抗體合格率相符合，因此應(yīng)該在母源抗體下降到70%左右，即28 日齡時(shí)進(jìn)行首次免疫。高琳琳[4]認(rèn)為羊口蹄疫的免疫時(shí)間應(yīng)該根據(jù)免疫后抗體水平來確定，而抗體水平在接近而未低于臨界保護(hù)值時(shí)（即45 日齡時(shí)）免疫效果較好。史杰等[5]通過對比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，羊55日齡時(shí)進(jìn)行首次免疫效果最好。由此看來，不同的飼養(yǎng)場，飼養(yǎng)管理模式不同，免疫程序也會(huì)有差異。

本研究根據(jù)四川省越西縣某羊場飼養(yǎng)管理實(shí)際情況，選擇健康羔羊，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分別對該養(yǎng)殖場未接種口蹄疫疫苗與接種口蹄疫疫苗后的羔羊體內(nèi)口蹄疫抗體水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，掌握抗體消長規(guī)律，以期為該羊場優(yōu)化口蹄疫免疫程序提供數(shù)據(jù)支撐，為該場的防疫工作、生產(chǎn)管理等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)所用湖羊均為越西縣某羊場未接種口蹄疫疫苗的羔羊，采用放牧加補(bǔ)飼的方式飼養(yǎng)，白天放牧，歸牧?xí)r補(bǔ)飼適量的精料及燕麥稈等農(nóng)副產(chǎn)物。根據(jù)該羊場口蹄疫抗體抽檢結(jié)果可知，該場哺乳期母羊口蹄疫抗體水均在85%以上，符合國家要求的70%水準(zhǔn)，故隨機(jī)挑選適齡羔羊進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 疫苗及試劑

口蹄疫O型、A型二價(jià)滅活疫苗（OHM/02株+AKT～Ⅲ株），批號為2021033，天康生物制藥有限公司生產(chǎn)；口蹄疫A 型抗體液相阻斷ELISA 檢測試劑盒（批號為20210608133）、口蹄疫O 型抗體液相阻斷ELISA 檢測試劑盒（批號為20210608133），蘭州獸研生物科技有限公司生產(chǎn)；抗原（批號為2021101135），蘭州獸研生物科技有限公司生產(chǎn)，-20 ℃保存；其他試劑2～8 ℃保存。

1.3 試驗(yàn)分組

選取15 日齡湖羊羔羊24 只為A 組，選取60 日齡湖羊羔羊24只為B組。A組羔羊隨著生長每間隔14 d左右檢測其母源抗體水平1 次，直至67 日齡。B 組羔羊在60 日齡接種疫苗，與母羊分開單獨(dú)飼養(yǎng)，隨后分別在接種疫苗后第7、14、21、28 天采血并檢測口蹄疫抗體。

1.4 免疫

使用連續(xù)注射器進(jìn)行頸部肌肉注射，一羊一換針頭，防止羔羊交叉感染，注射劑量為1 mL/只。

1.5 血液采集

使用普通真空采血管進(jìn)行頸靜脈采血，一次采血5 mL，分離血清，4 ℃保存。

1.6 抗體檢測

1.6.1 主要試劑準(zhǔn)備

口蹄疫A 型病毒稀釋液：將口蹄疫A 型病毒抗原從-20 ℃環(huán)境中取出置于常溫環(huán)境下解凍30 min，隨后將口蹄疫A型病毒抗原用抗原稀釋液稀釋至1∶20的工作濃度，實(shí)際配備溶液劑量按照50 μL×（實(shí)際使用免抗包被板孔數(shù)-4）+400 μL計(jì)算。

口蹄疫O 型病毒稀釋液：將口蹄疫O 型病毒抗原從-20 ℃環(huán)境中取出置于常溫環(huán)境下解凍30 min，隨后將口蹄疫O型病毒抗原用抗原稀釋液稀釋至1∶15的工作濃度，實(shí)際配備溶液劑量按照50 μL×（實(shí)際使用免抗包被板孔數(shù)-4）+400 μL計(jì)算。

1.6.2 抗原抗體反應(yīng)

稀釋血清：取酶標(biāo)板，分別在A1～A6 每個(gè)孔位加入50 μL 的PBST 稀釋液，隨后A1 孔按照50 μL/孔的量加入被檢血清，使用移液器吹打10～15 次后，吸取A1 孔血清與PBST 稀釋液混合溶液至A2 孔，重復(fù)以上操作直至血清與PBST溶液稀釋比例為1∶64，吹打最后一個(gè)孔后將移液槍頭與槍頭內(nèi)50 μL 溶液一起棄去。隨后將酶標(biāo)板A3～A6的4個(gè)孔溶液按照50 μL的量移液至A1～D1。重復(fù)此操作直至酶標(biāo)板上的1～10列都為血清稀釋液；同時(shí)稀釋陽性對照血清和陰性對照血清。

加病毒抗原：試驗(yàn)血清、陰性血清和陽性血清中的每一稀釋孔加入稀釋后的病毒抗原，稀釋液量為50 μL，而病毒抗原對照孔加入稀釋后的病毒抗原稀釋液量為100 μL。

將加好樣品的酶標(biāo)板用封板膜封板，隨后放入調(diào)速振蕩器振蕩3 min，取出后置于恒溫箱37 ℃溫育30 min。

1.6.3 加酶標(biāo)抗體工作液

溫育后瀝干并拍打干燥包被板，在每個(gè)孔中加入PBST 稀釋液，瀝干PBST 稀釋液，拍干，重復(fù)上述動(dòng)作5 次，然后在每個(gè)孔中加入A 型或O 型酶標(biāo)抗體工作液（藍(lán)色），用封板膜封板后置于恒溫箱37 ℃溫育30 min。

1.6.4 加TMB底物混合液

溫育結(jié)束后，將孔內(nèi)液體倒掉，拍干，隨后每孔加入350 μL PBST 稀釋液后，倒掉PBST 稀釋液，拍干，重復(fù)以上操作5 次，隨后每孔加入TMB 底物混合液50 μL，用封板膜封板后置于恒溫箱37 ℃反應(yīng)15 min。

1.6.5 終止顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)，將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀內(nèi)讀取OD450nm值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 16.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果以“平均值”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 羔羊口蹄疫母源抗體變化情況

2.1.1 口蹄疫A型母源抗體變化情況

羊場內(nèi)隨機(jī)抽檢適齡羔羊24只，在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別采集血液樣品測定口蹄疫A 型母源抗體，結(jié)果見表1。由表1 可知，羔羊口蹄疫A 型母源抗體合格率在14 日齡時(shí)為79.16%，30 日齡時(shí)降至國家水平線以下，60 日齡時(shí)為37.50%，隨著時(shí)間推移，羔羊口蹄疫A 型母源抗體合格率逐步下降。

表1 A組羔羊口蹄疫A型母源抗體變化情況

2.1.2 口蹄疫O型母源抗體變化情況

羊場內(nèi)隨機(jī)抽檢測適齡羔羊24只，在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別采集血液樣品測定口蹄疫O 型母源抗體，結(jié)果見表2。由表2 可知，羔羊口蹄疫O 型母源抗體合格率在14 日齡時(shí)為87.50%，30 日齡時(shí)已降至國家水平線以下，60 日齡時(shí)合格率為45.83%，隨著時(shí)間的推移，羔羊口蹄疫O型母源抗體合格率逐步下降。

表2 A組羔羊口蹄疫O型母源抗體變化情況

2.1.3 羔羊口蹄疫母源抗體消長情況口蹄疫O 型母源抗體與A 型母源抗體隨著時(shí)間的推移而逐漸下降，可能與羔羊無法從母乳中攝取到足夠的母源抗體有關(guān)；并且A、O型母源抗體下降幅度基本一致，但是在30日齡與60日齡之間，口蹄疫O 型母源抗體下降幅度略低于口蹄疫A 型母源抗體下降幅度（見圖1）。

圖1 A組羔羊口蹄疫母源抗體變化情況

2.2 羔羊接種疫苗后抗體變化情況

2.2.1 接種疫苗7 d內(nèi)羊只采食情況

羔羊在免疫前采食量正常，部分羊只在免疫后第2～4 天出現(xiàn)食欲不振、精神萎靡等情況，第5 天與第6 天采食量恢復(fù)正常。

2.2.2 羔羊免疫后口蹄疫A型抗體變化情況

羊場內(nèi)隨機(jī)抽檢60 日齡羔羊24 只，在6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別采血，測定口蹄疫A型抗體，結(jié)果見表3?？谔阋逜 型抗體免疫合格率在接種7 d 時(shí)為16.67%，接種21 d 時(shí)增長到70.83%，符合國家要求的70.00%抗體合格率，接種42 d 時(shí)達(dá)到峰值91.67%，接種56 d 時(shí)再無變化，可見隨著時(shí)間推移，羔羊口蹄疫A 型抗體合格率逐步上升并達(dá)到峰值。

表3 B組羔羊免疫后口蹄疫A型抗體變化情況

2.2.3 羊免疫后口蹄疫O型抗體變化情況

羊場內(nèi)隨機(jī)抽檢60日齡羔羊24只，在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別采血，測定口蹄疫O型抗體，結(jié)果見表4。羔羊口蹄疫O型抗體合格率在接種7 d時(shí)為25.00%，接種21 d時(shí)增長到75.00%，符合國家要求的70%抗體合格率，在接種56 d 時(shí)達(dá)到峰值91.67%，隨著時(shí)間的推移，羔羊口蹄疫O型抗體合格率逐步上升并達(dá)到峰值。

表4 B組羔羊免疫后口蹄疫O型抗體變化情況

2.2.4 羔羊免疫后口蹄疫A、O型抗體變化情況

從圖2可以看出，免疫后口蹄疫O 型、A 型抗體隨著時(shí)間的推移逐漸上升，可能是羔羊從疫苗免疫過程中產(chǎn)生口蹄疫抗體。接種后一個(gè)月內(nèi)，A 型抗體合格率雖然低于O 型抗體合格率，但之后A 型抗體合格率的增長比O 型抗體合格率增長快，在接種后第2 個(gè)月時(shí)，O 型抗體合格率略低于A 型抗體合格率，但是在免疫56 d后，口蹄疫A、O型抗體合格率趨于一致。該現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與疫苗中兩種毒株的濃度有關(guān)，也可能與動(dòng)物機(jī)體反應(yīng)有關(guān)。

圖2 羔羊免疫后口蹄疫抗體變化情況

3 討論

3.1 口蹄疫母源抗體變化情況

母源抗體是新生胎兒免疫前抵抗疫病的有效保障。新生胎兒在吃到母乳后，體內(nèi)抗體逐步提升，在1～3 d 達(dá)到峰值，其半衰期為21～23 d，在體內(nèi)存留時(shí)間約為2 個(gè)月，但是隨著時(shí)間的推移，新生胎兒的母源抗體開始下降[6]。根據(jù)該羊場以往的口蹄疫常規(guī)檢測數(shù)據(jù)可知，該場使用的口蹄疫疫苗在成年羊中產(chǎn)生了良好的抗體陽性率，其中包括懷孕母羊，說明該場所使用的疫苗在產(chǎn)生抗體方面具有較強(qiáng)的可靠性。在本研究中，口蹄疫A、O 型母源抗體陽性率在14 日齡時(shí)都超過了70.00%，隨后一直在下降，在30日齡后甚至低于70.00%，此時(shí)羔羊雖仍然與母羊處于同一圈舍，獲得口蹄疫抗體的途徑并沒有變化，但是體內(nèi)抗體仍然在不斷減少。隨著時(shí)間的推移，母羊分泌的母乳中抗體水平也隨之下降[7]，此時(shí)羔羊雖然以母乳為主，但是已經(jīng)不能從母乳中獲得足量的口蹄疫抗體，因此羔羊體內(nèi)口蹄疫抗體水平不斷下降[8]。從本研究結(jié)果得知，30～60 日齡時(shí)羔羊口蹄疫O 型母源抗體下降幅度較口蹄疫A 型母源抗體下降幅度小，可能與抗體在機(jī)體內(nèi)的代謝方式有關(guān)。

3.2 免疫后口蹄疫抗體變化情況

口蹄疫疫苗接種是羔羊在母乳中攝取不到口蹄疫抗體時(shí)對羔羊體內(nèi)抗體的一種補(bǔ)充手段。對于養(yǎng)殖場來說，疫苗接種程序的制定具有地方性、獨(dú)特性，受各個(gè)養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖方式、飼料配比、消毒手段、氣候、品種等因素影響。在第一次免疫時(shí)，母源抗體對免疫效果有一定的影響，這些母源抗體可保護(hù)幼畜不受感染[9]，對早期預(yù)防口蹄疫具有重要意義，當(dāng)然幼齡動(dòng)物的主動(dòng)免疫也會(huì)影響免疫效果[10]。如在母源抗體水平較高的情況下進(jìn)行免疫接種，進(jìn)入體內(nèi)的疫苗可被中和，可造成免疫失敗[11]。在母源抗體水平較低時(shí)進(jìn)行接種，雖然會(huì)有良好的免疫效果，但是羔羊在一定時(shí)間內(nèi)并不能獲得足夠的免疫保護(hù)，有感染疫病的風(fēng)險(xiǎn)，并且風(fēng)險(xiǎn)隨著時(shí)間的增長逐漸增大[12]。在本研究中，67 日齡時(shí)未接種的羔羊口蹄疫A、O 型抗體合格率分別為29.17%、33.33%，67 日齡時(shí)已經(jīng)免疫的羔羊口蹄疫A、O 型抗體合格率分別為16.67%、25.00%，在相同日齡下，接種后比未接種的羔羊平均抗體低10 個(gè)百分點(diǎn)，推測可能有以下幾個(gè)原因：羔羊在接種后轉(zhuǎn)群，與成年母羊隔開，失去了母源抗體的攝入，導(dǎo)致體內(nèi)抗體水平不足；也可能是體內(nèi)母源抗體與疫苗抗原產(chǎn)生中和反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)抗體水平下降[13-14]，下降原因有待深入研究。在疫苗接種21 d 后免疫抗體合格率達(dá)70.00%左右，符合國家要求的口蹄疫免疫抗體合格率[15]?？谔阋逜、O 型抗體合格率在接種后42 d基本保持穩(wěn)定，無太大變化。

綜上所述，該場在羔羊60 日齡接種口蹄疫疫苗是可行的，對羔羊口蹄疫具有較好的保護(hù)作用。研究中個(gè)別數(shù)據(jù)與國家規(guī)定的并不完全一致，但通過該研究可為口蹄疫免疫程序的制定提供參考，有助于養(yǎng)殖場做好每年的強(qiáng)制免疫計(jì)劃，保障口蹄疫抗體水平在國家規(guī)定的范圍內(nèi)。

4 結(jié)論

本研究通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分別對越西某羊場未接種口蹄疫疫苗與接種口蹄疫疫苗的羔羊體內(nèi)口蹄疫抗體水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，結(jié)果表明該養(yǎng)殖場在羔羊60 日齡時(shí)進(jìn)行口蹄疫免疫接種是可行的，而且對羔羊口蹄疫具有較好的保護(hù)作用。試驗(yàn)結(jié)果對羊場免疫程序的制定具有一定的借鑒意義，有助于養(yǎng)殖場做好每年的強(qiáng)制免疫計(jì)劃。