■ 王虹娟 周晨雨 馮 茜 馮振宇 李 娜*

（1.太原師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西晉中 030619；2.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030013）

核桃青皮，是胡桃與胡桃楸這兩類胡桃科植物的外果皮[1]，產(chǎn)地集中于河北、山西與山東等[2]。主要功能為抗腫瘤、清熱、止痢、解毒等；對(duì)于疣、疥癬等皮膚病具有外用價(jià)值[3]。核桃青皮不同于傳統(tǒng)的藥用青龍衣（為入伏采收的核桃未成熟果實(shí)的外果皮，帶未成熟果核，切片曬制），為成熟核桃外表生長(zhǎng)的一層厚厚的青皮。隨著時(shí)間的推移，核桃最外層包裹的青皮會(huì)自然裂開，露出核桃，自然掉落在地上，供人們生食、炒食或榨油等，而核桃青皮最終作為農(nóng)業(yè)廢棄物丟棄。近年來，已有文獻(xiàn)報(bào)道成熟的核桃外果皮中含有多糖等大分子化合物[4]。

多糖類化合物在動(dòng)物胞膜及微生物、植物的胞壁內(nèi)有著大量分布，具有重要的生物學(xué)功能，如抗病毒抗癌、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等[5-6]。目前多糖的提取方法主要是水提法[7]，傳統(tǒng)提取技術(shù)存在以下不足：提取率低、溶劑消耗量高、周期長(zhǎng)、純度不高等[8-10]。雙水相萃?。╝queous two-phase extraction， ATPE）方法的所有操作都能夠于室溫中開展，所以對(duì)多糖生物功能活性的保持有利，并且具有生物相容性好、萃取率高、易于放大、目標(biāo)產(chǎn)物活性損失少等特點(diǎn)[11-13]，已普遍用來提取黃酮、多糖、色素等活性物質(zhì)[14-16]，但目前還沒有研究涉及此項(xiàng)技術(shù)用于核桃青皮多糖（walnut peel polysaccharides， WPPs）的提取。因此試驗(yàn)經(jīng)由Box-Behnken 響應(yīng)面耦合遺傳算法（genetic algorithm，GA）完成WPPs最優(yōu)提取工藝條件的篩選，同時(shí)對(duì)此類多糖的體外抗氧化功能加以分析，旨在指導(dǎo)核桃青皮資源的有效利用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

核桃青皮，白露節(jié)氣之后采收的成熟核桃的外果皮。

K2HPO4、無水乙醇、苯酚、ABTS、葡萄糖(Glu)標(biāo)準(zhǔn)品，均為市購(gòu)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

電子天平（型號(hào)為JD200-4），沈陽龍騰公司制造；多功能粉碎機(jī)（型號(hào)為4500A）、智能恒溫培養(yǎng)振蕩器（型號(hào)為HNY-100B），天津市歐諾儀器公司制造；高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)為HC-3018R），購(gòu)自中科中佳科學(xué)儀器公司；分光光度計(jì)（型號(hào)為V-1100），購(gòu)自美析儀器公司；光譜儀（型號(hào)為Nicolet iS5），賽默飛世爾科技公司制造。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備把自然曬干的核桃青皮置于多功能粉碎機(jī)內(nèi)，先行粉碎處理，過篩，放入提前備好的密封袋，室溫儲(chǔ)存，備用。

1.3.2 雙水相相圖的繪制

采用濁點(diǎn)滴定法繪制雙水相相圖[17-18]。

1.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品7.5 mg，倒入容量瓶中，放純化水，定容至50 mL，再搖勻。分別吸取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液40、80、120、160、200 μL，各以純化水補(bǔ)至200 μL，然后依次加入5%苯酚400 μL，濃硫酸2 000 μL，把以上所有液體完全混勻，進(jìn)行0.5 h 反應(yīng)，測(cè)定OD490值，獲得如下回歸方程：Y=4.232 4X+0.005 2，R2=0.997 8。

1.3.4 核桃青皮多糖的提取

基于相圖進(jìn)行雙水相體系的配制，體系呈30 g的總質(zhì)量，而后加入提前備好的一定質(zhì)量的核桃青皮粉末。放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中萃取后，離心，收集下相，記錄下相體積，最終得出核桃青皮多糖提取率。

式中：m——核桃青皮粉末加入體系內(nèi)的重量（g）；

Cb——下相WPPs濃度為（mg/mL）；

Vb——下相體積為（mL）。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

以多糖提取率作為考察指標(biāo)，分別考察提取時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（12%、14%、16%、18%、20%）、加料量（0.50、0.60、0.75、1.00、1.50 g）、提取溫度（20、30、40、50、60 ℃）、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（28%、30%、32%、34%、36%）這幾種因素對(duì)核桃青皮多糖提取率的影響。

1.3.6 Ethanol/K2HPO4體系提取核桃青皮多糖的Box-Behnken試驗(yàn)

把配制雙水相所需K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間與提取溫度這3 項(xiàng)因素當(dāng)做變量，依次記作A、B、C，將WPPs提取率視為響應(yīng)值，記作Y，設(shè)計(jì)試驗(yàn)，其中不變條件為制備雙水相時(shí)需要的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)32%，體系中始終加料量為0.6 g。3個(gè)試驗(yàn)變量及試驗(yàn)水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與試驗(yàn)數(shù)據(jù)

1.3.7 遺傳算法設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝

本次試驗(yàn)采用了RSM 模型作為GA 的適應(yīng)度函數(shù)。如公式（2）所示。

式中：f(X)——RSM模型得到的目標(biāo)函數(shù)；

X——輸入向量；

Y——核桃青皮多糖得率（mg/g）；

遺傳算法優(yōu)化的約束條件:選擇各因素水平的上下限,下式為WPPs得率最佳的約束條件。

1.3.8 核桃青皮多糖的紅外光譜(FT-IR)結(jié)構(gòu)分析

將干燥的核桃青皮多糖樣本4.0 mg 與干燥的溴化鉀（KBr）在瑪瑙研缽中研磨均勻后壓片，使用Thermo Fisher Nicolet iS5 傅里葉紅外光譜儀在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描分析。

1.3.9 檢測(cè)核桃青皮多糖清除自由基能力

以1∶1 比例標(biāo)準(zhǔn)把7 mmol/L ABTS（試劑1）、2.5 mmol/L K2S2O8（試劑2）在常溫環(huán)境中混勻，經(jīng)過0.5 d 暗反應(yīng)，獲得ABTS 工作液。在刻度試管內(nèi)加入多糖樣品溶液，隨后加入ABTS 溶液，混勻，但需在避光環(huán)境中操作，反應(yīng) 10 min，檢測(cè)OD734值。按式（3）計(jì)算自由基清除率及IC50值[19]。

式中：A0——ABTS（2.7 mL）工作液+純化水（0.3 mL）的OD值；

Ar——無水乙醇（2.7 mL）溶液+樣品溶液（0.3 mL）的OD值；

As——ABTS（2.7 mL）工作液+樣品溶液（0.3 mL）的OD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及作圖分別運(yùn)用了Design-Expert 13和GraphPad Prism 8.0軟件；并且采用Matlab 2022b優(yōu)化核桃青皮多糖提取工藝參數(shù)。試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相相圖的繪制

如圖1 所示，相圖是一條曲線（MON）。根據(jù)相圖，在兩相區(qū)內(nèi)選擇乙醇和K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行核桃青皮多糖提取試驗(yàn)。

圖1 Ethanol/K2HPO4雙水相相圖

2.2 核桃青皮多糖提取的單因素試驗(yàn)

2.2.1 K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)核桃青皮多糖提取效果的影響

本試驗(yàn)由低到高分別選取了5種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的K2HPO4，由于雙水相體系中下相所占的體積越大越有利于多糖的提取，但下相的體積與K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)密不可分。由圖2可見，在K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)在16%時(shí)，可獲得最高WPPs提取率，之后繼續(xù)上調(diào)K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)，多糖提取率反而呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。這可能是由于鹽濃度越高，下相中溶解多糖的自由水的體積越少[20]，因此多糖的分配行為也受到影響，最終使得WPPs提取率下降。因此，選取16%作為核桃青皮多糖雙水相提取的最適 K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖2 K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)多糖提取率的影響

2.2.2 核桃青皮多糖提取效果受乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

如圖3 所示，32%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)的多糖提取率位于折線圖的最高點(diǎn)，隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)上調(diào)，WPPs提取率會(huì)降低。原因可能在于乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)上調(diào)后，進(jìn)一步增強(qiáng)了其水化功能，增大了相比，減小了下相體積，就此弱化了K2HPO4溶解性，多糖提取受到負(fù)面影響。所以，最佳提取條件為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)32%。

圖3 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)多糖提取率的影響

2.2.3 加料量對(duì)核桃青皮多糖提取率的影響

從圖4可以看出，加料量為0.6 g時(shí)呈現(xiàn)出最大的WPPs 提取率，之后繼續(xù)上調(diào)加料量，WPPs 提取率開始下降。分析原因?yàn)槿苜|(zhì)和溶液的接觸面積隨著加料量的增加而擴(kuò)大，有利于多糖的溶出[21]；但在加料量超過0.6 g 后，上調(diào)加料量的同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的WPPs向溶解平衡狀態(tài)發(fā)展，多糖不能完全溶出，傳質(zhì)速率和效率降低；同時(shí)隨著加料量的不斷增多，造成水溶性雜質(zhì)同樣增多[22]。說明樣品用量過大或者過小都不利于WPPs 的提取?？紤]到提取成本，選擇0.6 g加料量作為多糖提取的最適提取參數(shù)。

圖4 加料量對(duì)多糖提取率的影響

2.2.4 提取溫度對(duì)核桃青皮多糖提取率的影響

由圖5 可以看出，多糖提取率會(huì)因溫度升高而增加，因溫度下降而降低，植物多糖通常難溶于冷水、易溶于熱水[23]。溫度為30 ℃時(shí)，WPPs的提取率最大，為103.46 mg/g，可見，30 ℃為最理想的WPPs提取溫度。

圖5 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

2.2.5 提取時(shí)間對(duì)核桃青皮多糖提取效果的影響

由圖6可以看出，本次試驗(yàn)設(shè)置了5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在雙水相體系為40 min 的萃取時(shí)間時(shí)WPPs 提取率最高；但萃取時(shí)間增加至50 min，多糖提取率變化不明顯，并且時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)引起提取率降低。綜合考慮，本研究中最理想的WPPs雙水相提取時(shí)間為40 min。

圖6 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

通過以上單因素試驗(yàn)分析并綜合考慮多糖提取率及試驗(yàn)成本等因素，可明確，提取WPPs的最佳單因素條件：組成雙水相體系的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32%，K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%，加料量為0.6 g，提取最適時(shí)間是40 min，溫度為30 ℃。除乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加料量外，前述五個(gè)單因素中余下的三個(gè)因素對(duì)WPPs 提取率的影響程度皆在10%以上，因此，將加料量0.6 g 以及構(gòu)成雙水相體系的乙醇（32%）保持恒定，響應(yīng)面測(cè)試方案優(yōu)化指標(biāo)即為K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.3.1 Box-Behnken優(yōu)化核桃青皮多糖提取率

選擇的優(yōu)化因素為K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）和提取時(shí)間（C），響應(yīng)值（Y）為多糖得率，結(jié)果見表2，該結(jié)果擬合的二次回歸方程為：

表2 Box-Behnken試驗(yàn)方案和測(cè)試結(jié)果

由表3 的方差分析結(jié)果可知，擬合模型極顯著（P＜0.000 1），即每個(gè)因素及其響應(yīng)值關(guān)系密切。P=0.175 1 為其失擬項(xiàng)，即試驗(yàn)數(shù)據(jù)與此模型在試驗(yàn)范圍內(nèi)的擬合性較高；信噪比大于4（17.449 5），證實(shí)產(chǎn)生了極高的信號(hào)強(qiáng)度；R2（擬合系數(shù)）等于0.982 2，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與預(yù)測(cè)值吻合度較高；值為0.959 4，證實(shí)：測(cè)試考察變量造成的變化占比95.94%；4.25%的變異系數(shù)值證實(shí)在試驗(yàn)范圍內(nèi)模型穩(wěn)定性一致。差異極顯著（P＜0.01）的為一次項(xiàng)A和B、二次項(xiàng)A2和C2，差異顯著（P＜0.05）的為交互項(xiàng)AB、BC、二次項(xiàng)B2。這表明K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間這兩個(gè)因素對(duì)核桃青皮多糖得率具有顯著影響。綜合分析，本試驗(yàn)方法可靠，各因素水平間設(shè)計(jì)合理。

表3 響應(yīng)面方差分析

2.3.2 模型準(zhǔn)確性分析

核桃青皮多糖響應(yīng)值的殘差正態(tài)分布概率圖如圖7（A）所示，一條直線雙側(cè)相對(duì)合理地分布著17 組響應(yīng)值，方差高度吻合。圖7（B）顯示，實(shí)測(cè)值極度趨同于預(yù)判值，證實(shí)3 個(gè)變量指標(biāo)及其響應(yīng)聯(lián)系可以利用本次設(shè)計(jì)的模型有效擬合。圖7（C）所示為基于建模擬合分析17 組試驗(yàn)運(yùn)行數(shù)據(jù)與內(nèi)部學(xué)生化殘差的結(jié)果，表明各數(shù)據(jù)點(diǎn)全部沒有超出極值，并且數(shù)據(jù)都落在[-3,3]。圖7（D）說明杠桿值處在樣本空間中心，全部＜1，證實(shí)試驗(yàn)?zāi)Ｐ筒淮嬖谌魏斡行睢D7（E）則為基于DFBETAS值的差異圖，17組運(yùn)行數(shù)據(jù)均不會(huì)過多地影響到其回歸系數(shù)；明顯影響統(tǒng)計(jì)量的試驗(yàn)指標(biāo)可以基于Cook’D 證實(shí)，第3 組和第13 組試驗(yàn)值為離群點(diǎn)，擬合二次多項(xiàng)式模型環(huán)節(jié)，需做剔除處理，但是結(jié)合圖7（A）～圖7（E）綜合分析得到，第3 組和第13 組試驗(yàn)值為強(qiáng)影響點(diǎn)而非異常點(diǎn)，因此予以保留，其余15組試驗(yàn)值的Cook’D值在確定的范圍內(nèi)。本回歸分析結(jié)果證實(shí)：核桃青皮多糖提取技術(shù)模型有相對(duì)較高的準(zhǔn)確性。

圖7 Box-Behnken模型準(zhǔn)確度測(cè)試

2.3.3 交互作用分析

如圖8（a）所示，響應(yīng)面3D 圖形呈現(xiàn)為一個(gè)向上拱起的曲面，可見雙水相體系所含K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)同提取時(shí)間的交互效應(yīng)可顯著影響WPPs 得率，并且具有極大值，此極大值見于響應(yīng)曲面的最上方。從圖8（b）中可以看出K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間的交互作用較強(qiáng)。同樣，圖9（a）也是一個(gè)向上拱起的曲面，顏色由深逐漸變淺，可見，在提取時(shí)間與溫度上調(diào)時(shí)，WPPs 得率呈先提高后下降表現(xiàn)；圖9（b）是圖9（a）的等高線圖，結(jié)果同圖9（a）一致。

圖8 提取時(shí)間與K2HPO4交互作用對(duì)多糖得率的影響

圖9 提取時(shí)間與提取溫度交互作用對(duì)多糖得率的影響

2.3.4 核桃青皮多糖最佳提取技術(shù)指標(biāo)驗(yàn)證與優(yōu)化

分析優(yōu)化工具選擇的是遺傳算法優(yōu)化工具箱（屬M(fèi)atlab2022b 軟件），共需完成66 次迭代，此時(shí)K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X1）、提取時(shí)間（X2）、提取溫度（X3）試驗(yàn)水平分別為16.562 4%，33.646 5 min 和28.083 7 ℃，此條件下，WPPs得率最高預(yù)測(cè)值為114.519 mg/g。遺傳算法結(jié)果如圖10所示。

圖10 遺傳算法優(yōu)化結(jié)果

2.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過遺傳算法可以得出優(yōu)化工藝條件為：K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.562 4%，提取時(shí)間33.646 5 min，提取溫度28.083 7 ℃，所得核桃青皮多糖得率理論值為114.519 mg/g。為驗(yàn)證遺傳算法，方便實(shí)際操作，將上述提取條件修改為：構(gòu)成雙水相體系的K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%，提取時(shí)間34 min，提取溫度為28 ℃時(shí)開展驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3 次，最終得到WPPs 的得率為111 mg/g，試驗(yàn)值同理論值的相對(duì)誤差是2.6%，說明響應(yīng)面耦合遺傳算法可較好地模擬和預(yù)測(cè)核桃青皮多糖得率，進(jìn)一步證實(shí)采用遺傳算法優(yōu)化雙水相提取核桃青皮多糖工藝參數(shù)是可行的，可為實(shí)際操作提供良好的指導(dǎo)。

2.4 核桃青皮多糖的抗氧化活性測(cè)定

由圖11 可知，在試驗(yàn)濃度區(qū)間內(nèi)，核桃青皮多糖和陽性對(duì)照BHT 對(duì)ABTS 自由基清除能力均呈對(duì)數(shù)增加趨勢(shì)，核桃青皮多糖清除ABTS 自由基的IC50=0.12 mg/mL，陽性對(duì)照BHT 清除ABTS 自由基的IC50=1.36 μg/mL，清除率峰值（WPPs 濃度為0.5 mg/mL）為93.4%和95.57%（BHT 濃度為6 μg/mL）。因此可以推斷出，采用雙水相提取的核桃青皮多糖保留了其抗氧化活性。

圖11 核桃青皮多糖對(duì)ABTS自由基的清除率

2.5 核桃青皮多糖的紅外光譜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

如圖12所示，3 376.65 cm-1區(qū)域見寬且強(qiáng)的吸收峰，為WPPs分子間或者分子內(nèi)O—H伸縮振動(dòng)所致的強(qiáng)吸收，提示多糖中含有—OH基團(tuán)。在1 657.08 cm-1處的吸收峰為羰基的C＝O 伸縮振動(dòng)或形成了結(jié)晶水。1 085.65 cm-1的吸收峰為C—O—C 或C—O—H的變角振動(dòng)，986.31 cm-1處為烯烴C—H 面外彎曲振動(dòng)，位于862.73 cm-1的吸收峰說明多糖含β-糖苷鍵[24]。綜合以上分析，說明采用雙水相提取的核桃青皮多糖具有多糖化合物的顯著特征。

3 討論與結(jié)論

本研究以白露節(jié)氣之后采收的成熟核桃的外果皮為原料，摒棄傳統(tǒng)的水提法，采用新型雙水相提取技術(shù)，由普通有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽溶液組成，該雙水相系統(tǒng)具有極性高、成本低、反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，并且保留了多糖的生物活性[25-26]。其中，乙醇價(jià)格低廉、無毒、易回收，具有較大的水化能，能與其形成雙水相的鹽較少，因此適合作為雙水相體系的上相；K2HPO4在與乙醇形成的雙水相中具有相對(duì)較寬的分相范圍[27]，由新型雙水相體系的分離機(jī)制推測(cè)，為無機(jī)鹽溶解時(shí)結(jié)合水分子所產(chǎn)生的鹽析效應(yīng)引起，而高價(jià)鹽的鹽析作用要比低價(jià)鹽的鹽析作用大，因此磷酸鹽體系分相效果好[28]，并且K2HPO4可以阻止一些雜蛋白的溶解[29]。由于K2HPO4呈微堿性且微溶于醇，能夠穩(wěn)定分相，因此將K2HPO4當(dāng)作鹽相[11]，最終確定乙醇/K2HPO4雙水相為萃取核桃青皮多糖的最佳體系，將提取與分離兩個(gè)過程合為一體[30]。試驗(yàn)采用乙醇/K2HPO4雙水相體系提取并優(yōu)化WPPs 的最佳工藝條件，結(jié)果顯示，當(dāng)K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取溫度與時(shí)間分別為16%、28 ℃和34 min 時(shí)，WPPs 得率為111 mg/g，該提取工藝條件合理可行，可為多糖提取工業(yè)化提供良好的指導(dǎo)。本研究中雙水相提取所得WPPs在3 376.65、1 657.08、1 085.65、986.31、862.73 cm-1均存在強(qiáng)且寬的吸收峰，符合多糖的結(jié)構(gòu)特征。說明該方法所得WPPs 具有典型的多糖化合物的結(jié)構(gòu)特征。體外抗氧化試驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)由雙水相途徑制備所得WPPs可以清除ABTS自由基，可見，WPPs具備成為一類天然抗氧化劑的潛力，可以應(yīng)用于食品、保健品等領(lǐng)域，具有較高的研究開發(fā)價(jià)值。