張翔 黃媛媛 宋聰 賈振華 賈良良 宋水山

摘要：為了研究長期施加鉀肥對小麥產(chǎn)量、氮磷鉀吸收量以及小麥根際土壤微生物多樣性的影響，利用高通量測序技術(shù)，對河北省農(nóng)林科學(xué)院辛集市馬蘭農(nóng)場鉀肥定位試驗(yàn)田的8個小麥根際土壤樣品進(jìn)行測序，得到2組樣品的微生物群落組成信息，結(jié)合河北省農(nóng)林科學(xué)院資源環(huán)境研究所提供的小麥產(chǎn)量和品質(zhì)數(shù)據(jù)，進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，在NP組（不施加鉀肥）優(yōu)勢細(xì)菌菌群集中在疣微菌門（Verrucomicrobia），優(yōu)勢真菌菌群集中在毛殼菌科（Chaetomiaceae）、錐蓋傘屬（Conocybe）以及被孢霉目 （Mortierellales）。而NPK組（施加鉀肥）的優(yōu)勢細(xì)菌菌群集中在假諾卡氏菌科（Pseudonocardiaceae）、Terrimonas，優(yōu)勢真菌菌群集中在光柄菇科（Pluteaceae）、花褶傘屬（Panaeolus）。在細(xì)菌屬水平上，2組間差異較大的細(xì)菌菌屬有15種，其中NP組顯著增多的是Terrabacter、長繩菌屬（Longilinea）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、狹義梭菌屬（Clostridium sensu stricto）、Mangroviflexus、Rhizorhabdus、Tahibacter，而NPK組顯著增多的是Methyloceanibacter、Terrimonas、德克斯氏菌屬（Derxia）、倫茨氏菌屬（Lentzea）、Chryseolinea、間孢囊菌屬（Intrasporangium）、Maricaulis、纖維微桿菌屬（Cellulosimicrobium）。在真菌屬水平上，差異顯著的只有NP組中較多的毛殼菌屬（Chaetomium）和球腔菌屬（Phaeosphaeria）。結(jié)合小麥產(chǎn)量和養(yǎng)分?jǐn)?shù)據(jù)可以得出，鉀肥可以提高小麥的產(chǎn)量和氮磷鉀吸收量，而參與小麥吸收鉀元素的菌群應(yīng)該有Ohtaekwangia、Gp3、其他菌屬和一些未知細(xì)菌菌屬，以及毛球殼科的一個未知菌屬（unclassified_Lasiosphaeriaceae）、未知真菌菌屬（unclassified_Fungi）和地星科的一個未知菌屬（unclassified_Geastraceae）等真菌菌屬。

關(guān)鍵詞：鉀肥；小麥根際土壤；微生物多樣性；高通量測序；冗余分析

中圖分類號：S512.106? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）03-0254-07

土壤是農(nóng)業(yè)的根基，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)重要的組成部分。土壤中的微生物更是參與了農(nóng)作物生長發(fā)育的各個階段［1］。土壤微生物主要包括真菌、細(xì)菌、古菌、病毒、原生動物以及藻類［2］。它們在土壤的碳循環(huán)、氮循環(huán)、硫循環(huán)以及有機(jī)質(zhì)的分解和轉(zhuǎn)化過程中扮演著重要的角色［3］。土壤微生物種類繁多、功能多樣，是衡量土壤健康質(zhì)量的重要指標(biāo)［4］。在農(nóng)業(yè)研究上，耕地土壤微生物已經(jīng)受到了很多的關(guān)注，其中利用高通量二代測序技術(shù)了解土壤微生物多樣性已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用［5］。該技術(shù)可以檢測出土壤中的所有微生物的相對豐度，通過對土壤中所有微生物的相對豐度可以分析出耕地土壤中的微生物群落的組成情況，對耕地土壤的改良修復(fù)和肥料的施加提供科學(xué)的數(shù)據(jù)指導(dǎo)［6-7］。

小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，在我國有著廣泛的種植［8-9］。在小麥生長發(fā)育過程中鉀是必不可少的營養(yǎng)元素之一，參與了小麥體內(nèi)各種生理生化過程［10］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用鉀肥是解決土壤中鉀元素不足以及提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要途徑［11］。研究表明，在氮磷肥的基礎(chǔ)上施加不同量的鉀肥均可以提高小麥的產(chǎn)量［12］。隨著我國經(jīng)濟(jì)水平的提高、人口的增長，對糧食的需求也日趨提高［13］。我國已經(jīng)成為世界主要的鉀肥消費(fèi)國［14］。所以，合理地利用鉀肥既可以降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，又可以節(jié)省鉀礦資源［15］，對我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展有著重要的意義［16］。本研究利用高通量二代測序技術(shù)對河北省農(nóng)林科學(xué)院馬蘭農(nóng)場試驗(yàn)站的鉀肥長期定位試驗(yàn)田的土壤微生物進(jìn)行測序，分析研究土壤微生物與鉀肥施加量和產(chǎn)量之間的關(guān)系，以期為小麥的科學(xué)施肥和耕地土壤修復(fù)改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)概況

試驗(yàn)于2018年在河北省辛集市馬蘭村馬蘭農(nóng)場進(jìn)行，地處115.201°～115.206°E、37.995°～37.997°N，屬暖溫帶半濕潤季風(fēng)大陸氣候，海拔在25.0～37.8 m之間，年平均氣溫10～20 ℃，年平均降水量525.7 mm，年平均日照時數(shù)2 554.9 h。

馬蘭農(nóng)場試驗(yàn)站鉀肥定位試驗(yàn)由河北省農(nóng)林科學(xué)院資源環(huán)境研究所設(shè)計(jì)，試驗(yàn)田從1992年開始小麥—玉米輪作，共5個處理，本次試驗(yàn)取其中2個處理作為試驗(yàn)對象，每個處理4次重復(fù)，小區(qū)面積為50 m2（0.075畝），秸稈全部清除。各處理同量施用氮磷肥，每季施N 225 kg/hm2、P2O 5 90 kg/hm2。施加鉀肥的處理底肥施150 kghm2 K2O 。田間施肥情況見表1。

1.2 樣品的采集

本次試驗(yàn)所用土壤樣品及小麥樣品均在2018年6月采集完成。

本研究所用土壤樣品采用“5點(diǎn)采樣法”采集，在每塊地的4個角以及中間位置進(jìn)行土壤樣品的采集，然后進(jìn)行混樣。本研究所用土壤樣品為小麥的根際土壤，根際土壤距離小麥根部最近，土壤菌群與小麥根部交流更頻繁。采集時先將小麥根部的大塊土壤抖掉，然后用軟毛刷將附著在小麥根系表面的土壤刷到取樣袋中。將所取土壤樣品放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，存入-80 ℃冰箱中待測。

1.3 土壤微生物總DNA提取及PCR擴(kuò)增

取500 mg土壤樣品放入滅過菌的2 mL離心管中，然后用OMEGA公司的E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒對土壤樣品進(jìn)行DNA提取。土壤DNA提取后，利用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）對土壤中細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。同時，利用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對土壤中真菌ITS區(qū)域的ITS1～I(xiàn)TS2區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4 上機(jī)測序

將PCR產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）股份有限公司高通量測序部，利用Illumina MiSeq高通量測序平臺對樣品進(jìn)行測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

MiSeq測序序列中含有樣本標(biāo)簽序列，以及測序時加入的引物和接頭序列。首先需要去除引物接頭序列，再根據(jù)測序序列之間的重疊關(guān)系，將成對的序列拼接成一條序列，然后按照樣品標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到各樣本的有效數(shù)據(jù)［17］。

使用USEARCH去除預(yù)處理后序列中非擴(kuò)增區(qū)域序列，而后對序列進(jìn)行測序錯誤校正，并調(diào)用UCHIME進(jìn)行鑒定嵌合體。隨后再將去除嵌合體的序列與數(shù)據(jù)庫代表性序列進(jìn)行BLASTn比對，低于閾值的比對結(jié)果通常被認(rèn)為是靶標(biāo)區(qū)域外的序列，剔除掉該部分序列。

接下來，利用QIIME、UCLUST、USEARCH軟件按照97%相似性將全部優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行聚類，得到代表序列和操作分類單元（OTU）表。利用Mothur等軟件進(jìn)行稀釋性曲線的繪制，利用QIIME等軟件計(jì)算Chao1指數(shù)、observed species指數(shù)、goods coverage指數(shù)和Shannon指數(shù)。為了得到每個OTU的物種信息，采用RDP Classifier算法對每個OTU代表序列進(jìn)行比對分析，并在各個水平注釋群落物種信息。利用R語言繪制物種組成分析和主成分分析（PCA）的圖表［18］。并根據(jù)各個樣品的物種組成信息進(jìn)行LEfSe分析。

1.6 關(guān)聯(lián)性分析

利用冗余分析（RDA）法分析河北省農(nóng)林科學(xué)院資源環(huán)境研究所提供的小麥相關(guān)數(shù)據(jù)與高通量數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)性，篩選出與鉀肥關(guān)系密切的菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果分析

將8個樣品的下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理、去除嵌合體后，剩下的優(yōu)質(zhì)序列為分析所用的最終序列［19］。如表2所示，8個樣品中細(xì)菌的16S rDNA V3～V4區(qū)域的最終序列一共有557 581條，平均每個樣品有7萬條左右。OTU總數(shù)為51 801個，平均每個樣品有6 475個。如表3所示，8個樣品中真菌的 ITS1～I(xiàn)TS2區(qū)域的最終序列一共有514 125條，平均每個樣品有64 265條。OTU總數(shù)為6 387個，平均每個樣品有798個。從這2個表中可以看出，在測序深度相當(dāng)?shù)那闆r下，土壤中的細(xì)菌數(shù)量和種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真菌的數(shù)量和種類。

2.2 測序深度分析

Shannon指數(shù)是反映土壤微生物多樣性的指數(shù)。由圖1和圖2可以看出，隨著測序深度的增加各個樣品的曲線趨于平緩，說明隨著測序深度的增加，新增微生物種類明顯減少，所以當(dāng)前的測序深度已經(jīng)可以足夠反映土壤中所有細(xì)菌和真菌的真實(shí)情況。

2.3 2組間PCA結(jié)果

PCA是利用降維方法分析各個土壤樣品中菌群的相似性。PCA中距離越近說明樣品間的相似性越高。圖3和圖4分別展示了這8個樣品中細(xì)菌和真菌的PCA三維圖。從圖中可以看出，NP組和NPK組2組樣品間的距離要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于組內(nèi)的距離，說明它們的組間的菌群差異要大于組內(nèi)差異，也就說明了這樣的分組方式有意義，可以進(jìn)一步進(jìn)行組間菌群差異的分析。

2.4 2組間LEfSe結(jié)果

LEfSe是對2組間差異菌群進(jìn)行分析的方法。如5和圖6所示，分別是2組間細(xì)菌和真菌差異菌群的LEfSe分支圖，其中紅色是NP組的優(yōu)勢菌群，綠色是NPK組的優(yōu)勢菌群。可以看出，NP組的優(yōu)勢細(xì)菌菌群集中在了疣微菌門（Verrucomicrobia），優(yōu)勢真菌菌群集中在了毛殼菌科（Chaetomiaceae）、錐蓋傘屬（Conocybe）以及被孢霉目（Mortierellales）。

而NPK組的優(yōu)勢細(xì)菌菌群集中在了假諾卡氏菌科（Pseudonocardiaceae）、Terrimonas，優(yōu)勢真菌菌群集中在了光柄菇科（Pluteaceae）、花褶傘屬（Panaeolus）。

2.5 2組間屬水平差異微生物菌群分析

屬水平是高通量測序技術(shù)能達(dá)到的測量較準(zhǔn)確的一個分類水平。圖7和圖8展示的是2組樣品中土壤微生物在屬水平上細(xì)菌和真菌相對豐度差異較大的菌屬，其中紅色部分是相對豐度有顯著差異的菌屬。從圖7中可以看出，2組間差異較大的細(xì)菌菌屬有15種，其中NP組顯著增多的是地桿菌屬（Terrabacter）、長繩菌屬（Longilinea）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、狹義梭菌屬（Clostridium sensu stricto）、Mangroviflexus、Rhizorhabdus、Tahibacter，而NPK組顯著增多的是Methyloceanibacter、Terrimonas、德克斯氏菌屬（Derxia）、倫茨氏菌屬（Lentzea）、Chryseolinea、間孢囊菌屬（Intrasporangium）、Maricaulis、纖維微桿菌屬（Cellulosimicrobium）。圖8展示了2組間屬水平上差異較大的真菌菌群，其中差異顯著的只有NP組中較多的毛殼菌屬（Chaetomium）和球腔菌屬（Phaeosphaeria）。

產(chǎn)生這些差異菌屬的原因，可能是由于長期的鉀肥施加使土壤中微生物群落的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。因?yàn)槲⑸锶郝渲g存在著聯(lián)系，所以鉀肥施加后，一些能夠利用、分解鉀肥的微生物以及其他相關(guān)微生物就會聚集。

2.6 小麥產(chǎn)量、氮磷鉀吸收量與土壤微生物關(guān)聯(lián)性分析

表4中展示的是2組處理小麥籽粒產(chǎn)量和小麥氮磷鉀吸收量，該數(shù)據(jù)由河北省農(nóng)林科學(xué)院資源環(huán)境研究所提供。從表4中可以看出，施加鉀肥后，小麥的籽粒產(chǎn)量和小麥中氮磷鉀的成分都有了明顯的提高，說明鉀肥對小麥的生長發(fā)育和小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)都有一定的影響。

圖9和圖10展示了屬水平上細(xì)菌和真菌相對豐度與小麥產(chǎn)量和氮磷鉀吸收量的相關(guān)性。從圖9可以看出，鉀肥的施加與小麥籽粒產(chǎn)量和氮磷鉀的吸收量成呈正相關(guān)趨勢，同時也與Ohtaekwangia、Gp3、其他菌屬以及一些未知細(xì)菌菌屬相對豐度呈正相關(guān)的趨勢。未知菌屬中是一些目前沒有命名的菌屬，這些菌屬中應(yīng)該有與鉀肥有密切聯(lián)系的菌屬。由圖10可知，鉀肥的施加與毛球殼科的一個未知菌屬（unclassified_Lasiosphaeriaceae）、未分類真菌菌屬（unclassified_Fungi）以及地星科的一個未知菌屬（unclassified_Geastraceae）等真菌菌屬相對豐度呈正相關(guān)的趨勢。與鉀肥施加呈正相關(guān)的這一系列細(xì)菌和真菌有可能參與了鉀肥的分解以及小麥對鉀的吸收過程。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)對河北省農(nóng)林科學(xué)院辛集市馬蘭農(nóng)場試驗(yàn)站的鉀肥定位試驗(yàn)田的土壤進(jìn)行采集和高通量測序分析。本次試驗(yàn)的土壤樣品采集了來自鉀肥定位試驗(yàn)的2個處理，分別是NP組和NPK組。NP組在整個小麥生長發(fā)育過程中不施加鉀肥，NPK組小麥生長發(fā)育過程中施加適量的鉀肥。本試驗(yàn)一共采集了8個小麥根際土壤樣品，并利用Illumina MiSeq高通量測序平臺對這8個樣品中的細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)域以及真菌ITS1～I(xiàn)TS2區(qū)域進(jìn)行測序。其中細(xì)菌得到557 581條最終序列，真菌得到514 125條最終序列。通過聚類細(xì)菌得到 51 801 個OTU，真菌得到6 387個OTU。通過稀釋曲線分析得出所有土壤樣品的測序深度已經(jīng)能夠反映土壤微生物的真實(shí)情況。通過PCA，說明NP與NPK組間差異大于組內(nèi)差異，具有分組意義，可以進(jìn)行組間菌群的差異性分析。

LEfSe是對組間差異菌群的分析，通過分析可以得出，NP組的優(yōu)勢細(xì)菌菌群集中在了疣微菌門（Verrucomicrobia），優(yōu)勢真菌菌群集中在了毛殼菌科（Chaetomiaceae）、錐蓋傘屬（Conocybe）以及被孢霉目（Mortierellales）。而NPK組的優(yōu)勢細(xì)菌菌群集中在了假諾卡氏菌科（Pseudonocardiaceae）、Terrimonas，優(yōu)勢真菌菌群集中在了光柄菇科（Pluteaceae）、花褶傘屬（Panaeolus）。進(jìn)一步分析屬水平的差異菌群可以得出，NP組顯著增多的細(xì)菌菌屬是Terrabacter、Longilinea、Nitrospira、Clostridium sensu stricto、Mangroviflexus、Rhizorhabdus、Tahibacter，而NPK組顯著增多的細(xì)菌菌屬是Methyloceanibacter、Terrimonas、Derxia、Lentzea、Chryseolinea、Intrasporangium、Maricaulis、Cellulosimicrobium。在真菌屬水平上的差異菌群只有NP組中較多的毛殼菌屬（Chaetomium）和球腔菌屬（Phaeosphaeria）。這些差異菌群產(chǎn)生的原因可能是小麥田長期施加鉀肥造成的，這些差異菌群應(yīng)該與土壤中鉀元素的轉(zhuǎn)化分解有關(guān)。

結(jié)合河北省農(nóng)林科學(xué)院資源環(huán)境研究所提供的小麥產(chǎn)量和氮磷鉀吸收量的相關(guān)數(shù)據(jù)，可以看出鉀肥的施加可以提高小麥的產(chǎn)量和氮磷鉀吸收量。鉀肥對小麥的一系列影響，應(yīng)該也與土壤微生物有著一定的聯(lián)系。通過RDA圖可以看出，小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)與Ohtaekwangia、Gp3、其他菌屬以及一些未知細(xì)菌菌屬的相關(guān)豐度呈正相關(guān)的趨勢，也與unclassified_Lasiosphaeriaceae、unclassified_Fungi、unclassified_Geastraceae等真菌菌屬的相關(guān)豐度呈正相關(guān)的趨勢。這些菌屬應(yīng)該是直接或間接地參與了小麥在整個生長發(fā)育過程中對鉀元素的吸收。

通過以上分析可以看出，鉀肥的施加量與小麥的生長發(fā)育有著重要的聯(lián)系，這與路欣春等的研究結(jié)果［20-21］相符。結(jié)合高通量測序的分析結(jié)果可以看出，土壤微生物參與了小麥吸收鉀肥的過程，并可以有效促進(jìn)小麥吸收鉀元素，這與Yadav等的研究結(jié)果［22-24］相符。

綜上所述，通過對河北省農(nóng)林科學(xué)院辛集市馬蘭農(nóng)場鉀肥定位試驗(yàn)田小麥根際土壤的采集與土壤微生物進(jìn)行分析，得出的結(jié)論是鉀肥的合理施加可以提高小麥的產(chǎn)量和氮磷鉀吸收量，土壤中的一系列細(xì)菌和真菌直接或間接地參與了小麥對土壤中鉀元素的吸收過程。另外，還有哪些微生物參與了鉀元素的吸收過程，以及參與的具體方式還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)來進(jìn)行探討。

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