徐洪超 王增雪 逄洪波 王蘭蘭 李雪梅 馬蓮菊 張飛 李玥瑩

摘要：為了探究不同氮處理對(duì)高粱氮代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的影響，提高高粱氮素利用率，選擇最佳施氮模式，選用2個(gè)高粱品種遼粘3號(hào)、晉雜34，設(shè)置4個(gè)氮處理水平（N0：0 kg/hm2，N1：60 kg/hm2，N2：120 kg/hm2，N3：180 kg/hm2），用熒光定量PCR方法分別測(cè)定苗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期高粱葉片、籽粒的NR、GS、GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量，分析不同氮處理水平對(duì)氮代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明：除成熟期葉片外，各生育期遼粘3號(hào)、晉雜34葉片、籽粒在施氮條件下的NR、GS、GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量均高于未施氮處理。隨施氮量增加，高粱葉片和籽粒NR、GS、GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量呈上調(diào)或先上調(diào)后下調(diào)的變化趨勢(shì)。遼粘3號(hào)和晉雜34在N2、N3處理的NR、GS、GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量處于較高水平。綜合多方面因素考慮，可以將N2處理確定為最適施氮量。

關(guān)鍵詞：氮處理；基因表達(dá)；高粱；氮代謝；基因相對(duì)表達(dá)量

中圖分類號(hào)：S514.06? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）03-0079-05

高粱作為世界上第五大類糧食作物，具有生長(zhǎng)力強(qiáng)、二氧化碳利用率高、需水量少等優(yōu)勢(shì)，在惡劣的生長(zhǎng)環(huán)境中還具有耐鹽堿、耐瘠薄、耐澇等抗逆特性［1-2］。高粱的應(yīng)用十分廣泛，在釀酒業(yè)、能源業(yè)、飼料業(yè)、造紙業(yè)、板材業(yè)和色素業(yè)等領(lǐng)域具有巨大的發(fā)展空間和優(yōu)勢(shì)。隨著高粱的需求不斷增多，產(chǎn)量成為其研究領(lǐng)域的一個(gè)重要課題。

氮素是植物生長(zhǎng)的必需元素，主要以硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的形式參與植物體內(nèi)的氮代謝調(diào)節(jié)過程。硝酸還原酶（NR）是硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮的第1個(gè)關(guān)鍵酶，谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合酶（GOGAT）是無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的關(guān)鍵酶［3］，它們對(duì)氮代謝同化過程具有不可替代的作用。同時(shí)，氮素同化過程受到一系列氮代謝相關(guān)酶基因的調(diào)控。氮代謝相關(guān)酶基因會(huì)影響酶活性的表達(dá)，從而影響高粱產(chǎn)量和品質(zhì)。房曉琨研究發(fā)現(xiàn)，栽培大豆的NR、GS、GOGAT活性與其對(duì)應(yīng)的基因相對(duì)表達(dá)量呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系［4］。植物體內(nèi)含N化合物的含量與氮代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量的關(guān)系也十分密切，魯黎明等對(duì)烤煙研究發(fā)現(xiàn)，煙葉可溶性蛋白含量與NR基因相對(duì)表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系［5］。林照輝研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，白菜NR基因的表達(dá)隨氮素濃度升高而升高［6］。寧改星等以葡萄為試材，研究發(fā)現(xiàn)，施氮可以影響氮代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)，改善氮代謝水平［7］。施氮處理下的葉片NR、GS、GDH基因表達(dá)水平均高于對(duì)照。然而過量施用氮肥，會(huì)產(chǎn)生成本增加、資源浪費(fèi)、環(huán)境污染等眾多的問題［8］。所以，在保持作物產(chǎn)量穩(wěn)定的同時(shí)，提高氮肥利用效率，減少氮肥使用量是解決問題的關(guān)鍵。

目前有關(guān)高粱氮代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的報(bào)道比較少。本試驗(yàn)選用遼粘3號(hào)、晉雜34高粱品種，分析比較不同氮處理對(duì)不同高粱品種各生育期葉片和籽粒的NR、GS、GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量，旨在從分子水平探究氮肥對(duì)高粱氮代謝的調(diào)控機(jī)制，為提高高粱氮素利用率、選擇最佳施氮模式提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)于2021年在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)材料是2個(gè)高粱品種遼粘3號(hào)、晉雜34，分別設(shè)置4個(gè)氮處理（N0 ：0 kg/hm2，N1：60 kg/hm2，N2：120 kg/hm2，N3：180 kg/hm2），選取苗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期高粱葉片和籽粒進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與濃度檢測(cè) 使用promega RNA提取試劑盒對(duì)高粱葉片和籽粒RNA進(jìn)行提取。用核酸定量?jī)xScanDrop 200進(jìn)行濃度檢測(cè)［9］。

1.2.2 Sor-NR、Sor-GS、Sor-GOGAT基因引物的設(shè)計(jì) 通過查找相關(guān)文獻(xiàn)資料［10］，確定本試驗(yàn)引物序列（表1）。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄 （1）去除基因組DNA。反應(yīng)體系：5×gDNA Clean Reaction Mix 2 μL，Total RNA*1 8 μL；反應(yīng)條件：42 ℃ 2 min。（2）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系：即去除基因組DNA反應(yīng)液10 μL，主要包括5× Evo M-MLV RT ReactionMix*1 4 μL，RNase freewater*1 6 μL；反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。

1.2.4 RT-qPCR反應(yīng) 本試驗(yàn)使用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括TB Green Premix Ex TaqⅡ 10 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.8 μL，DNA模板（<100 ng）*2 2.0 μL，滅菌水6.4 μL。RT-qPCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min；50 ℃降溫30 s。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT 算法進(jìn)行計(jì)算，并采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析（α=0.05），使用Origin 2021軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮處理對(duì)不同高粱品種不同生育期NR基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.1.1 對(duì)葉片NR基因相對(duì)表達(dá)量的影響 以N0處理作為對(duì)照，分別對(duì)遼粘3號(hào)和晉雜34在不同生育期不同氮處理的葉片NR基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在拔節(jié)期、抽穗期、成熟期，遼粘3號(hào)葉片NR基因相對(duì)表達(dá)量均表現(xiàn)為N2>N3>N1>N0，N2處理下的葉片NR基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他處理；在苗期，N3處理的葉片NR基因相對(duì)表達(dá)量最高，N2處理次之。在苗期、抽穗期、成熟期，晉雜34在N2處理的葉片NR基因相對(duì)表達(dá)量最高，N3處理次之，其中苗期、成熟期N2處理顯著高于其他處理。在拔節(jié)期，晉雜34葉片NR基因相對(duì)表達(dá)量隨施氮量增加逐漸上調(diào)，N3處理下的葉片NR基因相對(duì)表達(dá)量分別是N0、N1、N2處理的10.24、2.60、1.26倍（圖1）。

2.1.2 對(duì)籽粒NR基因相對(duì)表達(dá)量的影響 以N0處理作為對(duì)照，分別對(duì)遼粘3號(hào)和晉雜34在不同生育期不同氮處理的籽粒NR基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在抽穗期，遼粘3號(hào)和晉雜34籽粒NR基因相對(duì)表達(dá)量隨施氮量增加呈上調(diào)趨勢(shì)，N3處理顯著高于其他處理。在成熟期，遼粘3號(hào)在N3處理的籽粒NR基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他處理，晉雜34在不同氮處理的籽粒NR基因相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為N2>N3>N1>N0，且各處理之間沒有顯著差異（圖2）。

2.2 氮處理對(duì)不同高粱品種不同生育期GS基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.2.1 對(duì)葉片GS基因相對(duì)表達(dá)量的影響 以N0處理作為對(duì)照，分別對(duì)遼粘3號(hào)和晉雜34在不同生育期不同氮處理的葉片GS基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在苗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期，遼粘3號(hào)葉片GS基因相對(duì)表達(dá)量均表現(xiàn)為N2>N3>N1>N0，N2處理顯著高于其他處理。在苗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期，遼粘3號(hào)在N2處理的GS基因相對(duì)表達(dá)量分別是N0處理的3.73、4.55、2.91、1.73倍。在苗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期，晉雜34葉片GS基因相對(duì)表達(dá)量隨施氮量增加逐漸上調(diào)，且苗期、拔節(jié)期、抽穗期N3處理顯著高于其他處理；成熟期N1、N2、N3處理間差異不顯著（圖3）。

2.2.2 對(duì)籽粒GS基因相對(duì)表達(dá)量的影響 以N0處理作為對(duì)照，分別對(duì)遼粘3號(hào)和晉雜34在不同生育期不同氮處理的籽粒GS基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在抽穗期，遼粘3號(hào)和晉雜34高粱籽粒GS基因相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為N2>N3>N1>N0，N2處理顯著高于其他處理。在成熟期，遼粘3號(hào)和晉雜34在N2處理的籽粒GS基因相對(duì)表達(dá)量最高，N0、N1、N3處理間差異不顯著（圖4）。

2.3 氮處理對(duì)不同高粱品種不同生育期GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3.1 對(duì)葉片GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量的影響 以N0處理作為對(duì)照，分別對(duì)遼粘3號(hào)和晉雜34在不同生育期不同氮處理的葉片GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，遼粘3號(hào)在苗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期N2處理的葉片GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他處理，在苗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期N3處理的葉片GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量分別是N0處理的3.11、7.69、2.02、2.08倍。在苗期、抽穗期，晉雜34在N3處理的葉片GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量最高，分別是N0處理的10.66、1.99倍；在拔節(jié)期、成熟期，晉雜34在N2處理的葉片GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量最高，分別是N0處理的6.59、4.58倍（圖5）。

2.3.2 對(duì)籽粒GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量的影響 以N0處理作為對(duì)照，分別對(duì)遼粘3號(hào)和晉雜34高粱在不同生育期不同氮處理的籽粒GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在抽穗期，遼粘3號(hào)和晉雜34高粱籽粒GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為N2>N3>N1>N0，N2處理的葉片GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量分別是N0的2.97、3.98倍。在成熟期，遼粘3號(hào)和晉雜34高粱籽粒GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量隨施氮量增加逐漸上調(diào)，且N2、N3處理間差異不顯著，N2處理的葉片GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量是N0的12.89、4.38倍（圖6）。

3 討論

氮素同化過程受到基因的調(diào)控，氮素含量影響氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)，不同基因在不同品種的氮代謝通路上發(fā)揮的作用也會(huì)有所差別［11-12］。硝態(tài)氮在NR等相關(guān)酶的催化下可以轉(zhuǎn)化成銨態(tài)氮，GS/GOGAT可以催化銨態(tài)氮生成谷氨酸，在無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化成有機(jī)氮過程中發(fā)揮重要作用。目前，NR基因已在菠菜［13］、桑樹［14］等多個(gè)植物中被克隆，GS基因也相繼在甜菜［15］、小麥［16］中被克隆。影響氮代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的因素很多，其中溫度、光照、Fe3+均可以影響氮代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)［17］。王添民研究發(fā)現(xiàn)，不同硝銨比可以影響葡萄NR、GS、GOGAT基因的表達(dá)量［18］。植物的不同部位氮代謝相關(guān)酶基因表達(dá)也有所差別，周月琴研究發(fā)現(xiàn)，NR基因在茶樹根部的表達(dá)量要高于莖和葉［19］。

本研究通過測(cè)定高粱NR、GS、GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，除成熟期葉片外，其他各生育期遼粘3號(hào)和晉雜34葉片、籽粒在施氮條件下的NR、GS、GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量均高于未施氮處理（N0）。同時(shí)，遼粘3號(hào)和晉雜34在N2、N3處理的NR、GS、GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量高于N0、N1處理。在抽穗期、成熟期，遼粘3號(hào)和晉雜34在N2處理下的葉片NR基因相對(duì)表達(dá)量最高。隨施氮量增加，各生育期遼粘3號(hào)葉片GS、GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量呈先上調(diào)后下調(diào)的變化趨勢(shì)，且N2處理顯著高于其他處理；晉雜34葉片GS基因相對(duì)表達(dá)量逐漸上調(diào)。在抽穗期，遼粘3號(hào)和晉雜34籽粒GS、GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量隨施氮量增加呈先上調(diào)后下調(diào)的變化趨勢(shì)，N2處理表達(dá)量最高。以上說(shuō)明合理施氮可以提高高粱NR、GS、GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量，氮素過多則會(huì)抑制氮代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)。本研究結(jié)果與寧改星等的研究結(jié)果［7，20］保持一致。之前研究的施氮量對(duì)高粱氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)施氮可以提高遼粘3號(hào)高粱氮代謝相關(guān)酶活性，有利于氮代謝過程，從而提高產(chǎn)量［21］。本研究從分子角度進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果。

4 結(jié)論

綜上所述，適當(dāng)施氮可以提高高粱NR、GS、GOGAT基因相對(duì)表達(dá)量，促進(jìn)植物氮代謝過程，同時(shí)N2、N3處理下的高粱氮代謝相關(guān)酶基因相對(duì)表達(dá)量較高，與氮代謝相關(guān)酶活性研究結(jié)果一致。綜合氮素利用效率等多方面因素，可以將N2（120 kg/hm2）處理確定為遼粘3號(hào)、晉雜34高粱的最佳施氮量。

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