顏靜宛 陳子強(qiáng) 周淑芬 王鋒

摘要：培育具有育種價(jià)值的GW2基因編輯的水稻優(yōu)異新品種在水稻育種中具有重要意義，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，以生產(chǎn)上廣泛推廣應(yīng)用的13份水稻品種為材料，對(duì)粒質(zhì)量基因（GW2）進(jìn)行定向性狀改良，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化創(chuàng)制出一批無(wú)T-DNA元件的水稻非轉(zhuǎn)基因GW2突變純合株系。結(jié)果表明：13份T0代水稻轉(zhuǎn)基因中，有28.0%～59.1%植株的GW2基因發(fā)生了突變，純合突變株數(shù)量占總突變株數(shù)量的35.0%，雙等位突變株數(shù)量占總突變株數(shù)量的14.2%，雜合突變株數(shù)量占總突變株數(shù)量的50.8%。此外，不同水稻品種發(fā)生的突變類(lèi)型也略有不同。對(duì)13份T2代非轉(zhuǎn)基因水稻GW2突變純合株進(jìn)行千粒質(zhì)量性狀的考種分析。與對(duì)應(yīng)的野生型親本品種相比，純合突變水稻植株的千粒質(zhì)量顯著提高10.81%～58.22%。本研究結(jié)果極大地豐富了GW2的突變類(lèi)型，為不同水稻品種的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)創(chuàng)造了重要的種質(zhì)資源，同時(shí)也為利用基因編輯提高水稻產(chǎn)量提供了有價(jià)值的育種信息。

關(guān)鍵詞：水稻；CRISPR/Cas9；基因編輯；粒質(zhì)量；GW2基因；突變

中圖分類(lèi)號(hào)：Q344+.14；S511.01? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）03-0073-06

水稻（Oryza sativa L.）是世界上種植最廣泛的作物之一，是全球超過(guò)35億人的主食，尤其是在亞洲。據(jù)預(yù)測(cè)，到2050年，水稻產(chǎn)量必須增加約42%，才能跟上全球日益增長(zhǎng)的糧食需求。粒質(zhì)量是影響水稻產(chǎn)量潛力的重要農(nóng)藝性狀之一，一直是育種家的主導(dǎo)性狀［1］。研究發(fā)現(xiàn)，水稻千粒質(zhì)量每提高1 g，可增加水稻產(chǎn)量400 kg/hm2［2］。因此，增加粒質(zhì)量對(duì)于水稻新品種的進(jìn)一步高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)越來(lái)越重要［3］。因此，迫切需要我們運(yùn)用更精準(zhǔn)的技術(shù)和方法來(lái)創(chuàng)制高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的水稻新品種。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者紛紛克隆出控制水稻粒型的基因，如GW2［4］、GW5［5］、TGW6［6］、GW8［7］等，其中水稻粒寬GW2基因已被Song等定位在第2號(hào)染色體，這是一個(gè)主要調(diào)控水稻粒寬和粒質(zhì)量的主效基因，GW2編碼的環(huán)型E3泛素連接酶通過(guò)將其底物靶向到蛋白酶體來(lái)調(diào)節(jié)蛋白水解，從而負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂［4］。大粒水稻中氨基酸殘基的缺失使得GW2無(wú)法結(jié)合底物，無(wú)法調(diào)控泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解，從而增加谷殼細(xì)胞數(shù)量，使小穗殼更大、更寬，加快籽粒灌漿速度，增加水稻籽粒的寬度、質(zhì)量和產(chǎn)量。

基因編輯技術(shù)是近幾年來(lái)快速發(fā)展的熱門(mén)新型技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)核酸酶對(duì)目標(biāo)靶基因序列進(jìn)行精準(zhǔn)編輯，經(jīng)過(guò)編輯后的目標(biāo)序列可產(chǎn)生不同形式的突變類(lèi)型，如堿基的缺失、插入或替換等形式的突變，這些變異形式都具有可遺傳性［8-10］。相比傳統(tǒng)的ZFNs、TALENs技術(shù)，基因編輯技術(shù)具有更精準(zhǔn)改良作物的重要農(nóng)藝性狀，可大大縮短培育新品種的時(shí)間，有利于基因功能研究和精確分子育種。在基因編輯技術(shù)中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于載體易于構(gòu)建、編輯效率高等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前主流的基因編輯系統(tǒng)［11］。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于作物上，可以創(chuàng)造出更多、性狀更優(yōu)良的新品種，也可以為解決全球糧食安全問(wèn)題提供更廣闊的前景［12-16］。

本研究主要對(duì)生產(chǎn)推廣中應(yīng)用廣泛的13份水稻品種進(jìn)行基因編輯，利用構(gòu)建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)粒質(zhì)量基因（GW2）進(jìn)行定向改良，通過(guò)基因編輯創(chuàng)制出一批優(yōu)異的非轉(zhuǎn)基因水稻新品種，以期為進(jìn)一步開(kāi)展品種設(shè)計(jì)和育種價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試受體材料是目前生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛的13份水稻品種，分別是：三系保持系50B；恢復(fù)系3550R、736R、5466R、615R、華占；常規(guī)秈稻品種福香9號(hào)、福泰8522、TN05、粵抗1522、福香98；常規(guī)粳稻品種臺(tái)粳9號(hào)、李粳2號(hào)。試驗(yàn)于2021年5月至2022年12月在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院壽山基地試驗(yàn)田內(nèi)進(jìn)行，按照常規(guī)方法進(jìn)行正常田間種植及管理。

1.2 主要試劑

Golden DNA聚合酶，購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；植物Cas9/gRNA質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒，購(gòu)自北京唯尚立德生物科技有限公司；引物合成和DNA測(cè)序由福州尚亞生物技術(shù)有限公司完成；組織培養(yǎng)試劑，購(gòu)自Sigma公司。

1.3 載體和菌株

供試菌株為大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌菌株EHA105，均購(gòu)自北京博邁德生物有限公司。

1.4 利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因敲除載體

利用植物Cas9/gRNA質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒（VK005-01）設(shè)計(jì)引物，試劑盒步驟如下：oligo二聚體的形成；oligo二聚體插入到載體中；轉(zhuǎn)化；陽(yáng)性克隆的鑒定測(cè)序。構(gòu)建水稻粒質(zhì)量相關(guān)性狀的水稻基因編輯載體。

1.5 水稻遺傳轉(zhuǎn)化

以13個(gè)水稻供試轉(zhuǎn)化受體的成熟胚經(jīng)誘導(dǎo)后產(chǎn)生的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，水稻愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代及與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)，抗性愈傷組織的篩選、分化及生根等相關(guān)培養(yǎng)基和具體試驗(yàn)步驟參照筆者所在實(shí)驗(yàn)室的常用操作方法［17］進(jìn)行。

1.6 T0代基因編輯轉(zhuǎn)化體植株的PCR檢測(cè)

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取水稻幼嫩葉片的基因組DNA［18］。設(shè)計(jì)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（Hpt）的PCR引物，引物編號(hào)及序列如下：hyg1，5′-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3′；hyg2，5′-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3′。以提取的T0代各單株的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（Hpt）鑒定轉(zhuǎn)基因植株。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物大小為845 bp。同時(shí)，設(shè)計(jì)粒質(zhì)量的CRISPR鑒定引物：gw2-1F，5′-GGTGAGGGTTTCATCTGCGG-3′；gw2-1R，5′-CCTACTCTCGCAACAACAAG-3′。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，59 ℃ 45 s，72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物大小為432 bp。

1.7 系統(tǒng)分析T0代基因編輯轉(zhuǎn)化體的序列信息

對(duì)13份水稻T0代轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行突變位點(diǎn)的測(cè)序，找出雙等位突變、雜合突變和純合突變的克隆，并對(duì)突變株的突變類(lèi)型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 非轉(zhuǎn)基因水稻GW2突變體的鑒定及其千粒質(zhì)量性狀的考種分析

將PCR測(cè)序結(jié)果為突變類(lèi)型的T0代轉(zhuǎn)基因單株經(jīng)過(guò)自交結(jié)實(shí)后，得到的即為T(mén)1代種子。以T1代各單株的基因組DNA為模版，通過(guò)引物hyg1/hyg2進(jìn)行PCR擴(kuò)增Hpt基因，無(wú)目的條帶的單株即為無(wú)T-DNA元件的GW2突變體。

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)種植無(wú)T-DNA元件的T1代純合GW2突變株系及其對(duì)應(yīng)的親本對(duì)照品種，每個(gè)株系種植5行，每行種植7株。株行距為20 cm×20 cm，單本栽插。按照大田常規(guī)方法進(jìn)行田間管理。收獲成熟種子烘干后，從中隨機(jī)數(shù)取飽滿、無(wú)病種子1 000粒，用YTS-5D水稻數(shù)字化考種機(jī)（武漢谷豐光電科技有限公司）稱質(zhì)量（g），3個(gè)重復(fù)。數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism軟件計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤，采用單因素方差分析進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR檢測(cè)

用植物Cas9/gRNA質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒（VK005-01）設(shè)計(jì)引物，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)按步驟操作，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑3～5個(gè)白色菌落搖菌后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果均正確。將載體命名為CRISPR/Cas9-GW2。

用編輯載體CRISPR/Cas9-GW2轉(zhuǎn)化13個(gè)水稻受體材料，每個(gè)轉(zhuǎn)化受體各轉(zhuǎn)化30個(gè)克隆，分別提取這些克隆水稻轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA，用PCR擴(kuò)增潮霉素基因。從轉(zhuǎn)基因植株中擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明目的序列已經(jīng)整合到水稻基因組中。在13個(gè)水稻T0代轉(zhuǎn)化材料中，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化陽(yáng)性率為60.0%～93.3%（表1）。其中，臺(tái)粳9號(hào)水稻轉(zhuǎn)基因苗中有28個(gè)克隆能擴(kuò)增出845 bp大小的DNA目標(biāo)條帶，而陰性對(duì)照則不能擴(kuò)增出目的基因大小的條帶，轉(zhuǎn)化陽(yáng)性率為93.3%。PCR檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

2.2 T0代轉(zhuǎn)基因水稻GW2基因突變類(lèi)型分析

為了解T0代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株GW2基因的突變情況，用gw2-1F、gw2-1R特異引物PCR擴(kuò)增上述轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的GW2基因靶位點(diǎn)序列（圖2），并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定，分析結(jié)果見(jiàn)表1。由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，在13份T0代水稻轉(zhuǎn)基因中，有28.0%～59.1%植株的GW2基因發(fā)生了突變。純合突變株占總突變株數(shù)的35.0%，雙等位突變株占總突變株數(shù)的14.2%，雜合突變株占總突變株數(shù)的50.8%。不同品種發(fā)生的突變類(lèi)型也略有不同，8株736R突變株只產(chǎn)生1種純合突變類(lèi)型；8株李粳2號(hào)突變株也只產(chǎn)生1種雜合突變類(lèi)型；14株臺(tái)粳9號(hào)突變株中卻有3株純合突變株、5株雙等位突變株、6株雜合突變株。綜上，利用CRISPR/Cas9-GW2質(zhì)粒是可以有效編輯不同水稻品種的GW2基因。

2.3 非轉(zhuǎn)基因水稻GW2突變體的鑒定及其千粒質(zhì)量性狀的考種分析

將PCR測(cè)序結(jié)果為突變類(lèi)型的T0代水稻轉(zhuǎn)基因種子種植，自交結(jié)實(shí)后得到T1代種子，對(duì)其DNA基因組進(jìn)行潮霉素基因PCR檢測(cè)，擴(kuò)增得到?jīng)]有潮霉素基因的單株，確定為不含T-DNA元件的非轉(zhuǎn)基因GW2突變體，圖3列出了臺(tái)粳9號(hào)T1代水稻轉(zhuǎn)化苗的潮霉素PCR檢測(cè)的結(jié)果，進(jìn)一步種植，自交結(jié)實(shí)得到T2代種子，對(duì)13份非轉(zhuǎn)基因水稻GW2突變純合株進(jìn)行千粒質(zhì)量性狀的考種分析。T2代種子的千粒質(zhì)量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表2，與對(duì)應(yīng)的野生型品種相比，所分析的純合突變植株都顯著提高了水稻的千粒質(zhì)量，增幅為10.81%～58.22%。其中常規(guī)秈稻品種福香9號(hào)、 福泰8522、粵抗1522的純合突變株的千粒質(zhì)量都比親本增幅超過(guò)50%。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，基因編輯技術(shù)特別是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的不斷改進(jìn)，使基因編輯成為一種簡(jiǎn)單、高效、易使用的多功能靶向遺傳操作工具。用CRISPR/Cas9系統(tǒng)來(lái)改良作物的性狀包括產(chǎn)量、品質(zhì)及生物和非生物脅迫抗性，有望加速作物改良和提高可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展的潛力［19］。如在水稻中同時(shí)敲除3個(gè)與粒質(zhì)量相關(guān)的基因（GW2、GW5和TGW6）會(huì)促使籽粒質(zhì)量聚合，從而大大增加了粒質(zhì)量［20］。吳明基等通過(guò)CRISPR/Cas9編輯Badh2基因來(lái)改良優(yōu)質(zhì)粳稻品種的香味性狀［21］。尹麗穎等利用CRISPR/Cas9技術(shù)來(lái)創(chuàng)制出高效抗除草劑水稻［22］。Zhang等通過(guò)CRISPR/Cas9敲除Waxy，產(chǎn)生了直鏈淀粉含量低的大米，從而改善了大米的食用和烹飪質(zhì)量［23］。張?jiān)暗壤肅RISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功獲得恢復(fù)紅種皮表型的純合株系［24］。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，以生產(chǎn)上推廣應(yīng)用廣泛的13份水稻品種為材料，對(duì)粒質(zhì)量基因（GW2）進(jìn)行定向性狀改良，一般有28.0%～59.1%植株的GW2基因發(fā)生了突變，能非常有效地改良不同水稻品種的粒質(zhì)量性狀，說(shuō)明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)是可以快速編輯不同背景不同地域的水稻品種的GW2基因，這也極大地突破和提高了水稻常規(guī)育種的進(jìn)程。但可能由于靶基因、靶位點(diǎn)、脫靶效應(yīng)等因素的影響，本研究所用的CRISPR/Cas9載體的編輯效率還不是非常高。隨著基因編輯器的不斷開(kāi)發(fā)，Zeng等開(kāi)發(fā)出一套植物高效廣靶向胞嘧啶堿基編輯器PhieCBEs，平均編輯效率提高了3～8倍，展現(xiàn)出穩(wěn)定的編輯能力［25］。隨后，Tan等在2022年又開(kāi)發(fā)了一個(gè)強(qiáng)大的高效腺嘌呤堿基編輯器PhieABEs，可以接近100%的編輯效率，在編輯窗口中有高比例的純合堿基取代［26］。 Wei等也開(kāi)發(fā)出高效的腺嘌呤堿基編輯rABE8e，在水稻中表現(xiàn)出約100%的編輯效率和較高的純合替代率［27］。這些高效基因編輯器的開(kāi)發(fā)，可實(shí)現(xiàn)多種形式精準(zhǔn)的基因修飾，滿足不同的基因編輯需求，從而為我們今后進(jìn)一步研究基因功能和分子育種奠定了基礎(chǔ)。

水稻產(chǎn)量是水稻重要的農(nóng)藝性狀，籽粒大小是決定水稻產(chǎn)量高低的重要因素之一，它不僅是糧食產(chǎn)量的組成部分，而且是決定市場(chǎng)價(jià)值的品質(zhì)性狀。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)不同水稻背景下的GW2位點(diǎn)進(jìn)行敲除，增產(chǎn)效果明顯，達(dá)到了預(yù)期的目的。發(fā)現(xiàn)不同水稻背景的突變類(lèi)型略有不同，可發(fā)生單堿基或多堿基的缺失或插入，所產(chǎn)生不同的突變類(lèi)型其千粒質(zhì)量的增產(chǎn)各不相同，即便不同水稻品種產(chǎn)生相同位點(diǎn)的突變類(lèi)型，其千粒質(zhì)量的增產(chǎn)也各不相同。在GW2基因同一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生腺嘌呤單堿基的缺失（-A），恢復(fù)系品種3550R的千粒質(zhì)量增加10.81%，華占的千粒質(zhì)量增加17.42%；常規(guī)秈稻福泰8522的千粒質(zhì)量增加26.51%，福香9號(hào)的千粒質(zhì)量增加38.63%；而常規(guī)粳稻臺(tái)粳9號(hào)的千粒質(zhì)量增加30.07%。而在GW2基因同一位點(diǎn)發(fā)生胞嘧啶單堿基的插入（+C），保持系50B的千粒質(zhì)量增加36.32%，常規(guī)秈稻粵抗1522的千粒質(zhì)量則增加58.22%。由此推測(cè)，這些不同背景的水稻品種突變后導(dǎo)致氨基酸移碼突變，從而使轉(zhuǎn)錄提前終止，編碼的蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域發(fā)生了改變，從而導(dǎo)致GW2無(wú)法結(jié)合底物，代謝途徑可能存在顯著差異，因此當(dāng)GW2突變后，不同品種的GW2突變體加快谷粒灌漿的速度產(chǎn)生了極顯著差異。GW2基因是一種遺傳決定因子，是今后選育良種的理想遺傳資源，可用于定向改良更多生產(chǎn)上主推的水稻品種。此外，需要一個(gè)全面綜合的研究策略，通過(guò)多重基因組編輯系統(tǒng)構(gòu)建更多有利的遺傳決定因素，以便有目的地快速培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的水稻品種，以應(yīng)對(duì)和保障未來(lái)的糧食安全。

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