喬繼琛　張玲紅　陳艷麗　倪藝軒　崔令花

【摘要】? 目的? 探討約氏瘧原蟲紅內(nèi)期不同發(fā)育階段蟲體蛋白電泳差異情況。方法? 采用約氏瘧原蟲17XNL蟲株感染6～8周齡昆明小鼠，制備瘧疾小鼠模型；每天尾靜脈采血計數(shù)小鼠紅細(xì)胞瘧原蟲感染率。待瘧疾小鼠紅細(xì)胞感染率達(dá)到10%以上，將小鼠摘眼球取血滴入肝素管抗凝，后經(jīng)過白細(xì)胞濾器濾除白細(xì)胞。將含蟲紅細(xì)胞分為混合階段組（對照組）和不同發(fā)育階段組，不同發(fā)育階段組紅細(xì)胞通過Percoll分離液分離為裂殖體組和滋養(yǎng)體（含大、小滋養(yǎng)體）組。分別裂解3組瘧原蟲蟲體，獲得蟲體蛋白；測定蛋白濃度后每孔上樣20μg總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分析；并對差異蛋白條帶進(jìn)行灰度值檢測。結(jié)果? 使用Percoll分離液可以分離出滋養(yǎng)體、裂殖體階段瘧原蟲蟲體，不同發(fā)育階段可溶性蟲體蛋白條帶數(shù)量差異不明顯；有7個蛋白條帶差異肉眼可見。其中，3個蛋白混合階段、滋養(yǎng)體階段、裂殖體階段蛋白表達(dá)量均由高逐漸減低；3個蛋白混合階段、滋養(yǎng)體階段、裂殖體階段蛋白表達(dá)量均由低逐漸增高；1個蛋白滋養(yǎng)體階段表達(dá)量最高，混合階段次之，裂殖體階段最低。結(jié)論? 使用Percoll分離液可以分離出不同發(fā)育階段瘧原蟲，不同發(fā)育階段可溶性蛋白在蛋白表達(dá)量上有一定差異，為后續(xù)不同發(fā)育階段蟲體蛋白研究奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】? 約氏瘧原蟲；紅內(nèi)期；不同發(fā)育階段；蟲體蛋白；電泳分析

中圖分類號? R381? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2024）07--04

Electrophoretic analysis of parasite proteins in different developmental stages of Plasmodium Yoelii? Qiao Jichen， Zhang Linghong， Chen Yanli， Ni Yixuan， Cui Linghua. Department of Basic Medical Science， Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 344000， China

【Abstract】? Objective? To investigate the difference of parasite protein electrophoresis in different developmental stages of Plasmodium Yoelii. Methods? Kunming mice aged 6-8 weeks were infected with 17XNL strain of Plasmodium yoelii and the malaria mouse model was prepared. The infection rate of plasmodium in mouse red blood cells was counted by daily tail vein sampling. When the red blood cell infection rate of malaria mice reached more than 10%， the mice were removed from the eyeballs and blood was dropped into the heparin tube for anticoagulation， and then the white blood cells were filtered through the white blood cell filter. The red blood cells were divided into mixed stage group （control group） and different developmental stage groups， and the red blood cells in different developmental stage groups were separated into schizozoite group and trophoblast group （including large and small trophoblast） by percoll separation solution. Three groups of Plasmodium bodies were cleaved to obtain the body protein. After the protein concentration was determined， 20μg of total protein was taken from each well and analyzed by SDS-PAGE. The gray values of the different protein bands were detected. Results? The Plasmodium of trophozoite and schizozoite stages could be isolated with Percoll solution， and the number of soluble plasmodium protein bands was not significantly different at different developmental stages. There were 7 differences in protein bands visible to the naked eye. Among them， the protein expression levels in 3 protein mixing stage， trophoblast stage and schizozoite stage were high and gradually decreased. The protein expression in 3 protein mixing stage， trophoblast stage and schizozoite stage increased gradually from low. The expression level of 1 protein trophoblast stage was the highest， followed by the mixed stage and the lowest in the schizozoite stage. Conclusion? Plasmodium parasites at different developmental stages can be isolated with Percoll solution， and there are some differences in the expression of soluble protein at different developmental stages， which lays a foundation for the subsequent study of parasite protein at different developmental stages.

【Key words】? Plasmodium yoelii; Red endopause; Different developmental stages; Insect body protein; Electrophoretic analysis

瘧疾是一種嚴(yán)重危害人類生命健康的蚊媒傳播疾病，曾在全球范圍內(nèi)多次大規(guī)模流行，至今仍是全球關(guān)注的三大公共衛(wèi)生問題之一[1-2]。據(jù)WHO統(tǒng)計，2020年全世界約有2.41億瘧疾感染病例和62.70萬瘧疾死亡病例[3]。據(jù)文獻(xiàn)報道，自2017年以來我國已連續(xù)5年無本土瘧疾病例發(fā)生，但輸入性瘧疾發(fā)病率明顯增高[4]。因此，國內(nèi)外瘧疾防控工作依然面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。瘧原蟲是瘧疾的病原體，在終宿主按蚊體內(nèi)進(jìn)行配子生殖和孢子生殖，在中間宿主人體的肝細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性生殖。瘧原蟲在紅細(xì)胞內(nèi)寄生時期簡稱為紅內(nèi)期，該時期是瘧原蟲主要的生存和致病階段[5]。在紅內(nèi)期，瘧原蟲裂殖子侵入紅細(xì)胞，在紅細(xì)胞內(nèi)攝取血紅蛋白為營養(yǎng)進(jìn)行生長發(fā)育；經(jīng)過小滋養(yǎng)體期、大滋養(yǎng)體期、裂殖子期，最終形成多個裂殖子脹破紅細(xì)胞，裂殖子在侵入新的紅細(xì)胞進(jìn)行下一輪的生長發(fā)育[6]。紅內(nèi)期瘧原蟲對人體損傷較大，患者會出現(xiàn)周期性的寒戰(zhàn)發(fā)熱，伴有不同程度的貧血和臟腑功能損傷，嚴(yán)重可導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)和患者死亡[7]。近年來隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)方法的進(jìn)步，特別是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的使用，瘧原蟲基因功能和表觀遺傳學(xué)的研究取得了較大進(jìn)展[8]。但現(xiàn)階段，對于瘧原蟲的免疫逃避機(jī)制、抗藥性蟲株產(chǎn)生機(jī)理和瘧原蟲侵入紅細(xì)胞的具體作用蛋白等方面尚不明確。因此，發(fā)掘瘧原蟲的關(guān)鍵功能蛋白至關(guān)重要。

以感染小鼠的約氏瘧原蟲作為研究對象，通過腹腔接種小鼠復(fù)蘇并培養(yǎng)約氏瘧原蟲，對瘧原蟲進(jìn)行高度同步化培養(yǎng)后大量制備紅內(nèi)期不同發(fā)育階段蟲體蛋白。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析各個時期瘧原蟲可溶性蟲體的表達(dá)差異情況，進(jìn)而篩選出差異表達(dá)的相關(guān)功能蛋白，為紅內(nèi)期瘧原蟲生長發(fā)育、致病機(jī)理以及后續(xù)疫苗研究和藥物研發(fā)奠定一定的基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 實驗動物? 昆明小鼠10只，6～8周齡，雌雄隨機(jī)；購于江蘇省常州市實驗動物中心。約氏瘧原蟲17XNL蟲株由蚌埠醫(yī)學(xué)院方強(qiáng)老師課題組惠贈，本實驗室保種。

1.1.2? 儀器與試劑? 非接觸式超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（SCIENTZ 08-III）購自寧波新芝生物科技股份有限公司；超微量紫外分光光度計（NanoDrop? One/OneC）購自美國Thermo公司；蛋白凝聚成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司。白細(xì)胞濾器、Percoll分離液購自生工生物工程（上海）股份有限公司；紅細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑、SDS-PAGE電泳上樣緩沖液、蛋白maker、蛋白膠配制試劑等均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）、蛋白脫色液等試劑為實驗室配制，均為國產(chǎn)分析純。

1.2? 實驗方法

1.2.1? 制備瘧疾小鼠模型? 從超低溫冰箱取出保存的約氏瘧原蟲17XNL蟲株，進(jìn)行瘧原蟲復(fù)蘇，后續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。使用1×106個約氏瘧原蟲17XNL蟲株腹腔注射感染小鼠，制備瘧疾小鼠模型。

1.2.2? 分組取瘧原蟲蟲體、制備蟲體蛋白? 每日對瘧疾小鼠模型進(jìn)行尾靜脈采血、制作血涂片染色并通過顯微鏡油鏡鏡檢，觀察小鼠瘧原蟲的感染情況，計數(shù)小鼠紅細(xì)胞瘧原蟲感染率，待感染率＞10%將小鼠摘眼球采血，收集到肝素抗凝管。將抗凝管內(nèi)紅細(xì)胞充分混勻，加入等體積PBS稀釋1倍后，使用白細(xì)胞濾器濾除白細(xì)胞。將過濾后的紅細(xì)胞充分混勻按1∶3的比例分到兩個試管，量少的即為混合階段組。將量多的一組使用50%percoll分離液分離，3100rpm離心20分鐘，離心結(jié)束后小心取出，吸取中間層紅細(xì)胞，即為含裂殖體紅細(xì)胞；底層為滋養(yǎng)體紅細(xì)胞。分別使用PBS清洗3組含蟲紅細(xì)胞，并分別取2μl制作血涂片染色觀察。后使用紅細(xì)胞裂解液裂解3組含蟲紅細(xì)胞，12000rpm離心5分鐘，后使用PBS多次離心清洗至上清液由紅色變成無色澄清。去除上清液，底部即為黑色蟲體。根據(jù)瘧原蟲數(shù)量加入適量PBS溶液和蛋白酶抑制劑，反復(fù)凍融2次后，使用非接觸式超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)裂解瘧原蟲（參數(shù)：超聲功率400W，超聲9秒，暫停4秒，共9個循環(huán)）。裂解后的瘧原蟲12000rpm離心5分鐘，上清液即為瘧原蟲可溶性蟲體蛋白。

1.2.3? SDS-PAGE電泳分析? 使用超微量紫外分光光度計分別測量3組不同階段的瘧原蟲蟲體蛋白濃度，根據(jù)每孔均上樣8μl（含20μg總蛋白）調(diào)整上樣體系，加入蛋白上樣緩沖液，使用PBS補(bǔ)充上樣標(biāo)本溶液。標(biāo)本液充分混勻，瞬時離心后使用99℃、10分鐘使樣品蛋白變性。瞬時離心后常規(guī)上樣maker和標(biāo)本，使用12%分離膠，100V恒壓進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。電泳結(jié)束后切去分離膠及多余部分，使用考馬斯亮藍(lán)快速染液染色30分鐘，后使用脫色液在搖床70rpm脫色2小時。脫色完成后，使用蛋白凝聚成像系統(tǒng)進(jìn)行成像；使用Iamge J1.80軟件進(jìn)行條帶灰度值對比，檢測相應(yīng)蛋白表達(dá)差異情況。

2? 結(jié)果

2.1? 不同階段瘧原蟲鏡檢

分別取混合階段組、滋養(yǎng)體組、裂殖體組含蟲紅細(xì)胞2μl制作血涂片，并進(jìn)行吉姆薩染色觀察；成功獲得混合階段瘧原蟲，滋養(yǎng)體階段瘧原蟲和裂殖體階段瘧原蟲，見圖1～3。

2.2? 不同階段蟲體蛋白SDS-PAGE蛋白電泳分析差異情況

從SDS-PAGE蛋白電泳圖譜上來看，肉眼可見的蛋白條帶數(shù)量有20余條，多數(shù)蛋白條帶位于25～230KD之間，瘧原蟲可溶性蟲體蛋白分子量高于230KD的有1條，蛋白分子量低于15KD有1條。其中，相對清晰且肉眼可見蛋白表達(dá)量有明顯差異蛋白有7條，以紅色箭頭標(biāo)注并進(jìn)行編號，見圖4。

2.3? 蛋白電泳條帶灰度值分析

根據(jù)蛋白圖譜，多數(shù)蛋白條帶灰度值無明顯差異，對肉眼可見蛋白表達(dá)量有明顯差異且以紅色箭頭標(biāo)注編號的7條蛋白進(jìn)行灰度值檢測，其中3、5、6號蛋白混合階段、滋養(yǎng)體階段、裂殖體階段蛋白表達(dá)量均由高逐漸減低。1、2、4號蛋白混合階段、滋養(yǎng)體階段、裂殖體階段蛋白表達(dá)量均由低逐漸增高。7號蛋白滋養(yǎng)體階段表達(dá)量最高，混合階段次之，裂殖體階段最低。見表1。

3? 討論

瘧疾是一種由瘧原蟲感染經(jīng)按蚊傳播的全球性傳染病[1]，曾在全球多個地區(qū)廣泛流行傳播，病死率較高[2]。關(guān)于瘧原蟲相關(guān)蛋白的研究取得了較多成果，有研究顯示，惡性瘧原蟲裂殖子成功入侵紅細(xì)胞后，在紅細(xì)胞表面表達(dá)惡性瘧原蟲紅細(xì)胞膜表面抗原蛋白（PfEMP1），此類蛋白可幫助瘧原蟲在宿主體內(nèi)實現(xiàn)免疫逃逸[9]。PfEMP1分子量大小在200～450KD之間，本研究表明在約氏瘧原蟲裂殖體階段高表達(dá)的蛋白有1、2、4號3個蛋白，可能同樣與瘧原蟲入侵紅細(xì)胞相關(guān)。

據(jù)文獻(xiàn)報道，通過SDS-PAGE蛋白電泳對5種瘧原蟲紅內(nèi)期可溶性蛋白質(zhì)圖譜比較，發(fā)現(xiàn)各種瘧原蟲紅內(nèi)期蛋白組分差異較大[10]，為瘧原蟲蟲種鑒定及生物學(xué)特性分析奠定了基礎(chǔ)。但研究者并未對瘧原蟲進(jìn)行同步化操作，沒有對不同發(fā)育階段各蛋白表達(dá)差異進(jìn)行深入研究。本研究以約氏瘧原蟲為研究對象對混合階段蟲體、滋養(yǎng)體階段蟲體及裂殖體階段蟲體分別進(jìn)行了SDS-PAGE蛋白電泳分析，并成功找到了7個明顯表達(dá)差異的蛋白。

綜上，本研究使用Percoll分離液分離出不同發(fā)育階段瘧原蟲，初步揭示了不同發(fā)育階段可溶性蛋白在蛋白表達(dá)量上有一定差異，為后續(xù)不同發(fā)育階段蟲體蛋白研究奠定基礎(chǔ)。

4? 參考文獻(xiàn)

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[10] 史明珠，張海珠，馮元鳳.5種瘧原蟲紅內(nèi)期可溶性蛋白質(zhì)圖譜比較[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2001（4）：253-255.

[2023-09-25收稿]

基金項目：江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（編號：GJJ 213313）

作者單位：344000? 江西省撫州市，江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部（喬繼琛、崔令花）； 蚌埠醫(yī)科大學(xué)安徽省感染與免疫重點實驗室（張玲紅、陳艷麗、倪藝軒）

*通訊作者