甘言剛,楊瓊瓊

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院腎內(nèi)科,中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心,廣東 廣州 510120)

IgA腎病(IgA nephrology,IgAN)是全球范圍內(nèi)最常見的原發(fā)性腎小球腎炎之一,主要表現(xiàn)為半乳糖缺陷型 IgA1(galactose-deficient IgA1,Gd-IgA1)在腎臟系膜區(qū)沉積[1]。幾乎所有患者在預(yù)期壽命內(nèi)都可能出現(xiàn)終末期腎衰竭[2]。IgAN的發(fā)病機(jī)制尚不明確[3]。IgAN患者存在免疫系統(tǒng)紊亂[4],GWAS等遺傳學(xué)研究表明,IgAN患者存在抗原呈遞(如MHC)、補(bǔ)體系統(tǒng)(如CFH、CFHR3-1、ITGAM-ITGAX)和黏膜免疫(如DEFA、CARD9、VAV3)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性改變[5～8]。多種免疫細(xì)胞在IgAN發(fā)生發(fā)展中起重要作用。APRIL和BAFF可促進(jìn)B細(xì)胞IgA類別轉(zhuǎn)換及糖基化異常導(dǎo)致IgAN[9,10]。B細(xì)胞中的TLR9可以識(shí)別PAMPs和/或DAMP,并通過APRIL和IL-6通路誘導(dǎo)Gd-IgA1的產(chǎn)生[11]。T細(xì)胞亞群的失衡亦可導(dǎo)致B細(xì)胞的增殖及Gd-IgA1分泌異常[4]。此外,在IgAN患者腎臟組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞浸潤,巨噬細(xì)胞及腎臟纖維化相關(guān)[12]。因此,探究免疫細(xì)胞在IgAN中的作用及機(jī)制具有重要科學(xué)研究價(jià)值。

傳統(tǒng)意義上的普通轉(zhuǎn)錄組測序(bulk RNA-seq)已經(jīng)提供了大量的關(guān)于IgAN基因表達(dá)改變的信息。外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)肉眼血尿發(fā)作期間的差異基因主要富集在IFN-γ信號(hào)傳導(dǎo)和抗原呈遞相關(guān)通路[13],CX3CR1基因及其配體fractalkine和IgAN患者肉眼血尿密切相關(guān)[14]。利用顯微切割技術(shù)將IgAN患者腎小球進(jìn)行bulk RNA-seq,發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮增生與先天免疫應(yīng)答、經(jīng)典補(bǔ)體通路激活和基質(zhì)轉(zhuǎn)換通路相關(guān)[15]。但是,bulk RNA-seq會(huì)掩蓋特異的細(xì)胞群體或狀態(tài)的基因表達(dá)情況,比如在Gd-IgA1產(chǎn)生以及在IgA1復(fù)合物沉積中起主要作用的細(xì)胞類型。單細(xì)胞RNA測序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)是在單個(gè)細(xì)胞水平對(duì)mRNA進(jìn)行高通量測序的一項(xiàng)新技術(shù),針對(duì)單個(gè)細(xì)胞研究其整體水平的基因表達(dá)情況,常用于識(shí)別新的細(xì)胞類型、確認(rèn)罕見的細(xì)胞群、構(gòu)建細(xì)胞狀態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育的圖譜[16]。能夠克服傳統(tǒng)bulk RNA-seq限制,進(jìn)行更加精細(xì)的細(xì)胞、分子水平的剖析。由于測序技術(shù)和細(xì)胞分離技術(shù)的快速發(fā)展,測序細(xì)胞數(shù)量由最初的幾百個(gè)細(xì)胞發(fā)展到成千上萬個(gè)細(xì)胞,并且測序性價(jià)比越來越高。分析方法也在持續(xù)改進(jìn),包括細(xì)胞類型的確定、高維數(shù)據(jù)的降維、無監(jiān)督聚類、系統(tǒng)發(fā)生建模、軌跡推斷、多數(shù)據(jù)集的協(xié)同分析等。

在IgAN研究領(lǐng)域,通過將具有不同分子分型的免疫細(xì)胞進(jìn)行聚類,以鑒定出可能與Gd-IgA1產(chǎn)生及沉積相關(guān)的免疫細(xì)胞亞群及表達(dá)差異。單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展還使腎臟中的細(xì)胞與細(xì)胞通訊研究、單細(xì)胞水平的調(diào)節(jié)狀態(tài)研究成為可能?？傊?單細(xì)胞測序技術(shù)的迅猛發(fā)展使人們能夠進(jìn)一步了解免疫相關(guān)性腎病中細(xì)胞的異質(zhì)性,并具有闡明致病性抗體產(chǎn)生及其在腎臟中沉積的復(fù)雜機(jī)制的巨大潛力,為確立免疫性腎病精準(zhǔn)治療策略提供新的思路。本文綜述了在IgAN患者中進(jìn)行的scRNA-seq研究的結(jié)果,隨著單細(xì)胞研究的深入,相信未來將有更多單細(xì)胞相關(guān)研究應(yīng)用于IgAN發(fā)病及機(jī)制的探索。

1 scRNA-seq識(shí)別IgAN 患者外周血免疫細(xì)胞亞群及信號(hào)通路

IgAN患者腎臟系膜區(qū)存在以IgA1為主的聚合物沉積,主要為Gd-IgA1。研究顯示IgAN患者血清Gd-IgA1水平與患者eGFR下降相關(guān)[17]。Gd-IgA1主要由抗體分泌的B細(xì)胞或漿細(xì)胞產(chǎn)生,因此闡明Gd-IgA1產(chǎn)生細(xì)胞的起源以及轉(zhuǎn)錄組譜的改變具有重要的科學(xué)研究價(jià)值。我們課題組前期利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)IgAN患者B細(xì)胞降維聚類分為4個(gè)亞群,IgAN患者外周血B2亞群細(xì)胞數(shù)顯著增加,B2細(xì)胞數(shù)量與IgAN患者血清C4水平呈正相關(guān)。IgAN患者B細(xì)胞差異基因發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞活化標(biāo)記物CD69在IgAN B細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),差異基因富集于病毒感染相關(guān)的途徑中,包括皰疹病毒、人嗜T細(xì)胞病毒、EB病毒和巨細(xì)胞病毒,提示 B細(xì)胞在IgAN中的改變可能與病毒感染導(dǎo)致的B細(xì)胞激活有關(guān)[18]。此外,有研究利用scRNA-seq鑒定了細(xì)胞因子刺激IgAN患者來源的IgA1分泌細(xì)胞的特有亞群,該亞群具有 C1GALT1低表達(dá)的特征[19]。這些結(jié)果表明,細(xì)胞因子介導(dǎo)的特定亞群及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變對(duì)GdIgA1產(chǎn)生起重要作用。

輔助性T細(xì)胞極化失衡在炎癥性疾病和自身免疫性疾病中起著重要作用[20,21]。幼稚CD4+T細(xì)胞在抗原-主要組織相容性復(fù)合體分子刺激下進(jìn)行克隆擴(kuò)增,分化為特異性效應(yīng)輔助性T細(xì)胞,包括輔助性T細(xì)胞(helper T cell,Th) 1、Th2、Th17、濾泡輔助T細(xì)胞(follicular helper T cell,Tfh)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[22]。Tfh細(xì)胞可通過IL-21和CD40L信號(hào)促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分化[23]。研究者在IgAN患者PBMC中發(fā)現(xiàn)Tfh、Th2及Th17比例增加,進(jìn)一步利用scRNA-seq鑒定IgAN患者PBMC中CD4+T細(xì)胞亞群及信號(hào)通路改變[24]。該研究發(fā)現(xiàn)在IgAN患者中Tfh細(xì)胞差異基因在調(diào)節(jié)B細(xì)胞分化、CD40-CD40L信號(hào)通路、細(xì)胞粘附和細(xì)胞因子分泌相關(guān)通路富集。Tfh功能基因(包括ICOS、STAT3、IL21R、IL6R、LTA和TNFSF14)表達(dá)上調(diào),進(jìn)一步提示Tfh細(xì)胞存在活化表型,Tfh細(xì)胞可能通過激活了B細(xì)胞促進(jìn)IgAN腎病發(fā)生發(fā)展[24]?；谶@些研究提示IgAN患者在特定抗原如病毒感染后可與T細(xì)胞相互作用共同促進(jìn)B細(xì)胞激活分化,促進(jìn)Gd-IgA1產(chǎn)生增多及疾病進(jìn)展。Nefecon可靶向抑制Peyer’淋巴結(jié)的B細(xì)胞局部激活,減少IgAN患者蛋白尿及腎小球?yàn)V過率下降[25]。通過抑制B細(xì)胞BAFF和APRIL通路的激活(如泰它西普、阿塞西普)也可顯著降低IgAN患者血清IgA1水平及蛋白尿[26,27]。因此,scRNA-seq對(duì)于鑒定IgAN患者外周血免疫細(xì)胞亞群及通路具有重要價(jià)值,對(duì)于IgAN患者靶向B細(xì)胞治療有重要啟示作用。

2 scRNA-seq探究IgAN腎組織亞群及信號(hào)通路

在IgAN中各種因素可導(dǎo)致Gd-IgA1的合成增加,且易于形成多聚IgA1并與自身抗體形成免疫復(fù)合物。IgA1免疫復(fù)合物的沉積觸發(fā)系膜增殖和各種細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分的分泌[28]。這些致病因素促進(jìn)系膜細(xì)胞其他腎細(xì)胞之間相互作用,最終導(dǎo)致腎小球硬化、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化[29]。一項(xiàng)納入13例IgAN患者、6例對(duì)照的研究對(duì)腎組織及外周血CD14+細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq,首次描繪了IgAN的腎臟組織單細(xì)胞水平圖譜,并初步探討了IgAN系膜增殖、免疫炎癥相關(guān)的可能發(fā)病機(jī)制[30]。研究中通過降維聚類共分為10個(gè)細(xì)胞群,主要有腎小管細(xì)胞、足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、腎小管閏細(xì)胞,還有部分免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞[30]。通過轉(zhuǎn)錄差異分析發(fā)現(xiàn)IgAN系膜細(xì)胞差異基因主要富集在細(xì)胞粘附、細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)通路,且發(fā)現(xiàn)J CHAIN在系膜細(xì)胞高表達(dá)[30]。J CHAIN主要功能是機(jī)體在形成IgM或IgA多聚體時(shí)起到一個(gè)鉸鏈作用,以及輔助抗體的轉(zhuǎn)運(yùn)、識(shí)別等[31]。該研究中首次發(fā)現(xiàn)J CHAIN在IgAN系膜細(xì)胞中的高表達(dá),說明其可能是IgA抗體免疫復(fù)合物傾向于沉積在IgAN患者的腎小球系膜區(qū)的原因。通過對(duì)IgAN和對(duì)照組的外周血CD14+細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測序分析發(fā)現(xiàn),IgAN腎臟原位巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出NOTCH信號(hào)通路、糖酵解、脂肪酸代謝等生物學(xué)過程的異常,還發(fā)現(xiàn)IgAN腎臟CD8+T細(xì)胞的免疫耗竭相關(guān)的基因表達(dá)增強(qiáng),細(xì)胞毒性相關(guān)基因表達(dá)減弱,可能提示IgAN患者腎臟中的T細(xì)胞功能異常[30]。其他scRNA-seq發(fā)現(xiàn)IgAN患者系膜細(xì)胞表達(dá)JAGGED1,內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)其受體NOTCH4,表明Jagged/Notch信號(hào)通路參與了IgAN的發(fā)病機(jī)制;PDGFRB在系膜細(xì)胞及成纖維細(xì)胞均表達(dá),其可能是系膜增殖和腎纖維化的潛在治療靶點(diǎn)[32]。

3 scRNA-seq揭示IgAN早期改變

IgAN早期病變發(fā)生的機(jī)制尚不明確,scRNA-seq技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)早期轉(zhuǎn)錄組改變及細(xì)胞間相互作用。ddY小鼠是一種自發(fā)性IgA腎病動(dòng)物模型,在系膜區(qū)可見 IgA以及 IgG、IgM 和 C3 的共沉積[33]。研究者利用ddY IgAN小鼠模型,基于scRNA-seq技術(shù)探討IgA腎病早期階段發(fā)生的分子變化。發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞是單細(xì)胞水平基因表達(dá)差異最顯著的細(xì)胞類型,其在疾病早期免疫細(xì)胞招募和浸潤中發(fā)揮重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)水平顯著上調(diào)的基因與內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、促炎以及介導(dǎo)T細(xì)胞激活遷移等過程密切相關(guān),提示內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞及白細(xì)胞的激活和招募發(fā)揮重要的作用[34]。該研究揭示了內(nèi)皮細(xì)胞在IgAN早期階段特別是免疫細(xì)胞招募和浸潤中的重要作用。抑制內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)差異基因及信號(hào)通路可能是IgAN早期階段干預(yù)的重要手段。

4 IgAN細(xì)胞間相互作用分析

細(xì)胞之間具有十分復(fù)雜的相互作用,這些相互作用在疾病發(fā)生及發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞-細(xì)胞之間的相互作用可以從scRNA-seq數(shù)據(jù)中計(jì)算受體-配體表達(dá)值相關(guān)性進(jìn)行研究。在IgAN患者中免疫細(xì)胞之間及免疫細(xì)胞與腎臟細(xì)胞中存在廣泛的相互作用。NK細(xì)胞和經(jīng)典單核細(xì)胞是IgAN中主要相互作用的細(xì)胞,NK細(xì)胞的傳出和傳入相互作用強(qiáng)度均降低,而單核細(xì)胞的相互作用強(qiáng)度均升高;在對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)6個(gè)信號(hào)通路(TNF、IL16、CXCL、MPZ、FASLG和NCAM)是特有的,而有2個(gè)信號(hào)通路(MIF、LIGHT)在IgAN中特有[18]。IgAN患者Tfh細(xì)胞與B細(xì)胞相互作用增強(qiáng),IgAN患者的多種受體-配體特別是LTA/TNFSF14(LIGHT)-TNFRSF14的相互作用增強(qiáng)[24]。在腎臟中,系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞通訊作用最強(qiáng),說明在IgAN患者系膜細(xì)胞增殖過程中,內(nèi)皮細(xì)胞與系膜細(xì)胞之間可能存在緊密的相互作用,共同導(dǎo)致了系膜區(qū)的病理變化[30]。此外,系膜細(xì)胞與巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞亦存在較強(qiáng)的相互作用,既往研究亦發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞浸潤與IgAN患者不良預(yù)后相關(guān)[35]。此外,在IgAN腎組織中系膜細(xì)胞與足細(xì)胞亦存在顯著的相互作用,這可能也是IgAN患者出現(xiàn)蛋白尿的原因[32]。綜上,IgAN存在細(xì)胞間通訊改變,因此改變IgAN患者異常細(xì)胞間通訊可能是抑制B細(xì)胞激活及減少蛋白尿的潛在治療策略。

5 思考與挑戰(zhàn)

近年來,單細(xì)胞水平的分析使得我們開始理解細(xì)胞群體的復(fù)雜性和異質(zhì)性,克服了傳統(tǒng)bulk RNA-seq測序分析不足以完全表征生物學(xué)復(fù)雜性的缺點(diǎn)。ScRNA-seq促進(jìn)了IgAN的機(jī)制研究,促進(jìn)了IgAN患者診斷和治療的發(fā)展。然而,在單細(xì)胞研究廣泛開展的大背景下,我們也不得不去思考單細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于IgAN研究的局限性。首先,在單細(xì)胞的分離和捕獲過程中,單細(xì)胞的活性和完整性可能受到影響,從而導(dǎo)致下游分析中顯示的細(xì)胞功能可能已經(jīng)不同于其在體內(nèi)環(huán)境下的功能狀態(tài);第二,真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄并不以穩(wěn)定的基礎(chǔ)速率進(jìn)行,而是以脈沖形式出現(xiàn)。因此,在一個(gè)特定的時(shí)間點(diǎn)檢測到細(xì)胞中特定基因的轉(zhuǎn)錄本是一個(gè)不明確的結(jié)果,對(duì)結(jié)果的解釋應(yīng)側(cè)重于通路分析和基因集合富集分析,而不是單個(gè)基因的表達(dá)或功能作用。第三,除了scRNA-seq的這些固有局限性之外,scRNA-seq依賴于存活的單細(xì)胞懸液,這種懸液很容易從外周血或淋巴結(jié)中獲得,但通常很難從實(shí)體組織中獲得。樣本保存條件的差異也可以引起轉(zhuǎn)錄組的大量變化。第四,在不同的時(shí)間處理樣品,即使有輕微的技術(shù)變化,也會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的批處理效應(yīng)。

綜上,IgAN是最常見的腎小球疾病,其異質(zhì)性強(qiáng),治療存在挑戰(zhàn),發(fā)病機(jī)制尚未闡明。scRNA-seq從單細(xì)胞層面解析了IgAN患者PBMC及腎組織細(xì)胞亞群及通路改變。IgAN患者外周血B細(xì)胞差異基因與B細(xì)胞激活、病毒感染相關(guān)通路相關(guān),且與Tfh細(xì)胞相互作用增強(qiáng)。IgAN腎組織中的系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及其與免疫細(xì)胞之間存在廣泛細(xì)胞間相互作用。未來隨著蛋白組學(xué)、表觀組學(xué)及空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)展,將成為揭示IgAN發(fā)病機(jī)制的更為有力技術(shù)和方法。