陶晨玥，苑秋悅，周東杰，張萍萍，周羅晶，王麗萍*

(1.揚(yáng)州大學(xué)護(hù)理學(xué)院·公共衛(wèi)生學(xué)院,揚(yáng)州 225001;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,沈陽 110000;3.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,揚(yáng)州 225001;4.江蘇省揚(yáng)州市婦幼保健院婦產(chǎn)科,揚(yáng)州 225001;5.江蘇省蘇北人民醫(yī)院科技處,揚(yáng)州 225001)

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修飾是RNA中最豐富的表觀遺傳修飾方式,主要分布于5′和3′非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)、終止密碼子和長(zhǎng)外顯子區(qū),于1974年首次報(bào)道[1]。m6A甲基化修飾主要涉及m6A甲基化酶(METTL3、METTL14、WTAP)、m6A去甲基化酶(FTO、ALKBH5)和甲基化識(shí)別酶(YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、hnRNP、elF3)三者的協(xié)同作用[2-3],影響RNA的核輸出、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯、降解及RNA-蛋白質(zhì)相互作用的生物學(xué)效應(yīng),對(duì)機(jī)體的生理或病理過程均有重要意義[4]。異常的m6A甲基化修飾可能導(dǎo)致基因失調(diào),同時(shí)破壞體內(nèi)平衡,從而引起腫瘤的發(fā)生及女性生殖系統(tǒng)疾病等病癥[5]。本文分別對(duì)m6A甲基化修飾在卵泡發(fā)育過程和女性生殖系統(tǒng)疾病中的作用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、m6A甲基化修飾在卵泡發(fā)育過程中的作用

卵泡是女性生殖系統(tǒng)的核心功能單位,其發(fā)育過程經(jīng)歷了募集、生長(zhǎng)、優(yōu)勢(shì)選擇、成熟、排卵等,在不同物種間高度相似[6]。這一復(fù)雜過程,受到機(jī)體多因素的精密調(diào)控,僅有少數(shù)原始卵泡能夠發(fā)育成熟至排卵,該過程涉及多個(gè)系統(tǒng)調(diào)節(jié),并受到多種激素的調(diào)控[7]。m6A修飾不僅在卵泡發(fā)育過程中起到重要調(diào)節(jié)作用,還影響卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂和生殖激素合成過程。

m6A修飾在卵泡發(fā)育過程中呈現(xiàn)出一系列的動(dòng)態(tài)變化,下面分別闡述m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶和甲基結(jié)合蛋白在調(diào)控卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、卵泡發(fā)育及生殖激素合成過程中的作用。

1.m6A參與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂:m6A修飾參與了卵母細(xì)胞的成熟過程。研究人員特異性敲除Gdf9-Cre小鼠卵母細(xì)胞中的METTL3,小鼠出現(xiàn)了卵母細(xì)胞DNA損傷、卵泡發(fā)育缺陷和排卵異常等情況。結(jié)合MeRIP-seq分析推測(cè),METTL3可能通過靶向ITSN2進(jìn)行m6A修飾以增強(qiáng)其穩(wěn)定性,從而影響卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂[8]。另有研究證明,敲低女性生殖細(xì)胞中的METTL3會(huì)降低mRNA翻譯效率、抑制卵母細(xì)胞成熟,并導(dǎo)致母體到合子轉(zhuǎn)換的缺陷[9]。較近研究表明,經(jīng)m6A甲基化抑制劑環(huán)亮氨酸(CL)處理后的卵母細(xì)胞表現(xiàn)出卵丘擴(kuò)張過程受損,線粒體中活性氧(ROS)增加,且由于破壞了紡錘體組織和染色體排列,導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟延遲等現(xiàn)象[10]。同樣有研究發(fā)現(xiàn),在減數(shù)分裂過程中,化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞核酸m6A修飾的減少可能會(huì)影響卵母細(xì)胞的成熟和發(fā)育能力。此外,在非哺乳動(dòng)物中也證實(shí)了m6A修飾參與卵母細(xì)胞分裂和翻譯。Qi等[11]選擇非洲爪蟾卵母細(xì)胞作為研究對(duì)象,對(duì)GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行m6A甲基化測(cè)序,4 207個(gè)具有m6A峰的mRNA被鑒定,這些mRNA主要參與轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分裂等生物學(xué)過程,而卵母細(xì)胞m6A修飾可能通過抑制mRNA翻譯來影響減數(shù)分裂的進(jìn)行。

目前的研究主要集中于METTL3在卵母細(xì)胞成熟過程中的作用,其通過影響翻譯效率、破壞mRNA穩(wěn)定性和生殖激素合成相關(guān)基因的表達(dá)而發(fā)揮作用。其他參與卵母細(xì)胞成熟減數(shù)分裂的m6A修飾酶有待進(jìn)一步鑒定。

2.m6A參與卵泡發(fā)育:據(jù)報(bào)道,在YTHDC1fl/-Ddx4-Cre或YTHDC1fl/-Zp3-Cre雌性小鼠中,生殖細(xì)胞在MI前期發(fā)育,但被阻滯在初級(jí)卵泡階段[12]。說明YTHDC1缺失導(dǎo)致卵泡發(fā)育阻滯,提示YTHDC1是女性卵泡發(fā)育和成熟所必需的關(guān)鍵因子。對(duì)海蘭褐母雞的卵泡選擇進(jìn)行初步研究發(fā)現(xiàn),在卵泡選擇過程中,雞卵泡轉(zhuǎn)錄組被m6A廣泛甲基化,且m6A甲基化峰和m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本在卵泡選擇過程中都有所增加,表明m6A甲基化可動(dòng)態(tài)修飾調(diào)節(jié)雞的卵泡選擇[13]。病毒樣m6A甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白(KIAA1429)是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的新鑒定成分,在指導(dǎo)區(qū)域選擇性m6A沉積中起關(guān)鍵作用,可通過介導(dǎo)RNA代謝在卵泡發(fā)生和維持卵母細(xì)胞能力中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[14]。此外,Cao等[15]通過分析豬的小卵泡和大卵泡m6A甲基化轉(zhuǎn)錄組圖譜發(fā)現(xiàn),在小卵泡到大卵泡的發(fā)育過程中顆粒細(xì)胞存在大量m6A修飾并且呈動(dòng)態(tài)變化,這些m6A修飾主要富集在mRNA轉(zhuǎn)錄的基因編碼區(qū),靠近5′UTR或3′UTR的m6A修飾增加了患病風(fēng)險(xiǎn)。功能分析表明,這些差異m6A修飾的基因在類固醇激素合成和卵泡發(fā)育相關(guān)的CYP19A1、FSHR、CDC27、AKT3等多個(gè)信號(hào)通路中富集。因此,豬顆粒細(xì)胞中不同的m6A修飾可能參與了類固醇發(fā)生和卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)。

目前,只有部分m6A酶被證實(shí)參與卵泡的發(fā)育階段,其中大部分尚未得到深入研究,明確m6A酶與卵泡發(fā)育相關(guān)因子及上下游靶基因之間的相互作用或?qū)⒊蔀橄乱徊窖芯恐攸c(diǎn)。

3.m6A參與生殖激素合成:人類的生殖功能是由促性腺激素(Gn)支持的,例如垂體在促性腺激素釋放激素(GnRH)刺激下產(chǎn)生卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH),FSH和LH對(duì)于卵泡的發(fā)育成熟起到重要調(diào)控作用[16]。研究人員用Gn治療大鼠模擬生理性GnRH介導(dǎo)的FSH合成和分泌調(diào)節(jié),應(yīng)用m6A-seq分析Gn治療前后大鼠垂體m6A的差異性修飾,共鑒定出6 413個(gè)差異峰,其中3 764個(gè)m6A峰上調(diào),2 649個(gè)m6A峰下調(diào),為探討m6A修飾在生殖激素分泌調(diào)節(jié)中的潛在作用奠定了基礎(chǔ)[17]。卵泡刺激素受體(FSHR)對(duì)FSH介導(dǎo)的卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要,FSH/FSHR的減少可能誘導(dǎo)卵泡生長(zhǎng)停滯。另有研究發(fā)現(xiàn),中樞基因OGN可以增加FSHR的表達(dá),提示OGN可以調(diào)節(jié)多囊卵巢綜合征(PCOS)和卵巢癌的激素反應(yīng);同時(shí),相關(guān)分析提示OGN功能可能與m6A修飾和鐵死亡密切相關(guān)[5]。

有研究表明,GABAAR(γ-aminobutyric acid receptor type A)受體在錳誘導(dǎo)未成熟雌性大鼠GnRH分泌的調(diào)節(jié)中起重要作用。抑制去甲基化酶脂肪含量和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)會(huì)抑制下丘腦GABAAR蛋白表達(dá),FTO依賴m6A去甲基化調(diào)節(jié)GnRH神經(jīng)元中GABAAR mRNA的加工,導(dǎo)致青春期延遲發(fā)生[18]。但是,m6A修飾是否參與GnRH分泌和調(diào)節(jié)FSH和LH進(jìn)而影響并參與卵泡發(fā)育還有待進(jìn)一步研究。

二、m6A甲基化修飾在女性生殖系統(tǒng)疾病中的作用

1.m6A與早發(fā)性卵巢功能不全:早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)意味著原始卵泡的早期消耗,以Gn升高和雌激素缺乏為特征,是嚴(yán)重影響育齡女性卵泡發(fā)育、成熟及身心健康的卵巢功能障礙性疾病[19]。研究表明,POI患者的m6A甲基化水平高于正常人[20]。一項(xiàng)病例對(duì)照研究的數(shù)據(jù)表明,POI患者的卵巢顆粒細(xì)胞中的m6A含量均高于非POI患者的含量,人卵巢顆粒細(xì)胞中FTO表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致m6A水平增高,可能會(huì)損害卵巢功能并進(jìn)一步增加患POI的風(fēng)險(xiǎn)[20]。在YTHDC2突變患者的外周血中,聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白(SYCP2L)表達(dá)水平升高[21]。SYCP2L是早期減數(shù)分裂標(biāo)記物,已被證實(shí)與POI相關(guān)[22],提示YTHDC2是人類減數(shù)分裂和POI的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

2.m6A與PCOS:PCOS是導(dǎo)致育齡女性不孕的常見生殖內(nèi)分泌疾病,嚴(yán)重影響女性的正常生殖和生理代謝,與我國(guó)生育率下降直接相關(guān)。PCOS主要表現(xiàn)為原始卵泡激活數(shù)量異常增多、竇前卵泡發(fā)育減緩、卵泡存活率增加和/或卵泡閉鎖減少等,從而引起卵泡不成熟甚至不排卵的現(xiàn)象[23]。

通過分析控制性促排卵后正常排卵女性和非肥胖PCOS患者黃體化顆粒細(xì)胞的m6A譜,發(fā)現(xiàn)PCOS患者的黃體化顆粒細(xì)胞觸發(fā)m6A水平升高,深入研究發(fā)現(xiàn),m6A介導(dǎo)的FOXO3轉(zhuǎn)錄在PCOS患者的黃體化顆粒細(xì)胞中缺失[24]。而FOXO3在細(xì)胞凋亡、代謝、細(xì)胞增殖和維持細(xì)胞活性等多種細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要作用[25]。此外,FTO通過降低FLOT2 mRNA的m6A水平和增加FLOT2 mRNA的穩(wěn)定性來促進(jìn)FLOT2的表達(dá)[26]。FLOT2缺失減弱了FTO過表達(dá)對(duì)顆粒細(xì)胞增殖/凋亡和胰島素抵抗的影響。FTO通過上調(diào)FLOT2誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞功能障礙,推測(cè)其可能參與肥胖PCOS的病理生理學(xué)調(diào)控。

3.m6A與卵巢癌:卵巢癌是全世界婦女癌癥相關(guān)死亡的第五大原因,死亡率居?jì)D科癌癥首位[27]。腫瘤抑制因子FBW7通過拮抗YTHDF2介導(dǎo)的BMF mRNA在卵巢癌中的衰減進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展[28]。Liu等[29]通過對(duì)卵巢癌的多組學(xué)分析,確定了一個(gè)涉及EIF3C的新機(jī)制作為YTHDF1的直接靶點(diǎn)。YTHDF1通過與m6A修飾的EIF3C mRNA結(jié)合,以m6A依賴的方式增強(qiáng)EIF3C的翻譯,并同時(shí)促進(jìn)整體翻譯輸出,從而參與卵巢癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。此外,一項(xiàng)關(guān)于子宮內(nèi)膜樣卵巢癌的m6A修飾的研究發(fā)現(xiàn),敲低METTL3顯著降低COV362細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并在G0/G1期誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[30]。

4.m6A與宮頸癌:宮頸癌是全球最常見的婦科惡性腫瘤之一,也是發(fā)展中國(guó)家癌癥相關(guān)死亡的主要原因[31]。METTL14在HPV陽性和HPV陰性宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲中都起到重要致癌作用,METTL14基因敲除通過降低Akt和mTOR的磷酸化來抑制PI3k/Akt/mTOR信號(hào)通路,并影響下游凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá);沉默METTL14可以誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯[32]。近年來,有研究發(fā)現(xiàn),YTHDF1在宮頸癌中高表達(dá),且與宮頸癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān),敲低YTHDF1抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,甚至抑制了體內(nèi)宮頸癌細(xì)胞的成瘤能力;研究還表明,YTHDF1通過調(diào)節(jié)RANBP2的表達(dá)在宮頸癌中發(fā)揮致癌作用,提示YTHDF1可作為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)[33]?，F(xiàn)有研究通過MeRIP-seq技術(shù)確定了TXNDC5是METTL3介導(dǎo)的m6A修飾的靶點(diǎn),并揭示了METTL3介導(dǎo)的TXNDC5的表達(dá)依賴于m6A閱讀器,同時(shí)結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證METTL3通過調(diào)控TXNDC5的表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,即METTL3促進(jìn)了宮頸癌的惡性進(jìn)展,提示METTL3可能是宮頸癌潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[34]。

5.m6A與子宮內(nèi)膜癌:子宮內(nèi)膜癌是子宮上皮內(nèi)層的惡性腫瘤,發(fā)病率和疾病相關(guān)的死亡率在世界范圍內(nèi)不斷增加[35]。Zhang等[36]檢測(cè)出FTO在轉(zhuǎn)移性子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá),深入研究發(fā)現(xiàn),FTO通過催化HOXB13 mRNA 3′UTR區(qū)去甲基化修飾,從而取消與YTHDF2蛋白的m6A修飾識(shí)別。HOXB13 mRNA的下降和HOXB13蛋白表達(dá)的增加伴隨著WNT信號(hào)通路的激活及下游蛋白的高表達(dá),導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲,即FTO促進(jìn)了癌細(xì)胞體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)移和侵襲。以人類子宮內(nèi)膜癌作為研究對(duì)象,研究發(fā)現(xiàn)大約70%的子宮內(nèi)膜腫瘤表現(xiàn)出m6A修飾的減少,推測(cè)可能是由于METTL14突變或METTL3的表達(dá)降低所導(dǎo)致的,該結(jié)果提示m6A修飾對(duì)mRNA甲基化的減少將成為子宮內(nèi)膜癌的致癌新機(jī)制[37]。此外,WTAP在癌組織中顯著上調(diào),WATP通過甲基化CAV-1的3′-UTR并下調(diào)CAV-1的表達(dá),激活子宮內(nèi)膜癌中的NF-κB信號(hào)通路,從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展,表明WATP可作為子宮內(nèi)膜癌的潛在治療靶點(diǎn)[38]。

三、小結(jié)與展望

目前,m6A修飾相關(guān)研究主要聚焦于基礎(chǔ)研究,臨床轉(zhuǎn)化相關(guān)研究非常有限。特定m6A修飾蛋白可作為反應(yīng)卵泡發(fā)育障礙的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。研究不同m6A修飾蛋白相應(yīng)抑制劑和激活劑可作為重要治療策略,廣泛應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。目前已鑒定的FTO抑制劑包括CS1/2[39]、FB23[40]、Dac51[41]等。越來越多的m6A修飾蛋白對(duì)應(yīng)調(diào)節(jié)劑在動(dòng)物疾病模型中發(fā)揮有效治療作用。在未來,m6A調(diào)節(jié)劑可能成為治療卵泡發(fā)育障礙甚至卵巢相關(guān)疾病的重要途徑之一。

異常m6A修飾通過多種方式影響卵泡發(fā)育過程,導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常,影響女性生殖功能。但m6A修飾在女性生殖系統(tǒng)的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究,許多未知功能可能參與卵泡的發(fā)育過程。綜上所述,m6A修飾在卵泡發(fā)育過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用,是卵母細(xì)胞發(fā)育障礙和生殖系統(tǒng)疾病的潛在生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。