張琳琳 章 潔

1 天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腦病針灸科,天津市 300250; 2 天津中醫(yī)藥大學(xué)

神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)是指從神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cell,NSCs)增殖、分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,并逐漸向功能區(qū)域遷移、發(fā)生可塑性變化并與其他神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系從而產(chǎn)生神經(jīng)功能完整的過程。在此過程中,多種內(nèi)源性的信號(hào)分子參與并調(diào)控干細(xì)胞的增殖與分化。其中Neurogenin1基因(簡(jiǎn)稱Ngn1),作為堿性螺旋—環(huán)—螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)蛋白家族中的成員之一,能在神經(jīng)前體細(xì)胞(neuronal precursors)中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá),并調(diào)控神經(jīng)前體細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞,且抑制其向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化[1],為調(diào)控NSCs分化的重要因子,在神經(jīng)發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,與神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病具有相關(guān)性,目前發(fā)現(xiàn),可通過中醫(yī)藥手段對(duì)Neurogenin1基因的表達(dá)進(jìn)行干預(yù),從而對(duì)相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病起到一定的治療作用,現(xiàn)將其總結(jié)如下。

1 Ngn1簡(jiǎn)介

Ngn1基因包括Ngn1、Ngn2和Ngn3,是堿性螺旋—環(huán)—螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子的家族成員之一[2],在哺乳動(dòng)物的CNS中廣泛表達(dá),包括海馬中的錐形和顆粒神經(jīng)元、嗅球中的谷氨酸能中間神經(jīng)元、皮質(zhì)中的錐體細(xì)胞和丘腦的大部分等區(qū)域。該家族是生物發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分,在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中,不同類型的bHLH轉(zhuǎn)錄因子彼此調(diào)控、互相協(xié)調(diào),廣泛參與了神經(jīng)發(fā)生與細(xì)胞增殖分化等基本生理過程,其中Ngn1和Ngn2在神經(jīng)發(fā)生時(shí)活躍,Ngn3在胰腺組織和胰島素分泌細(xì)胞的發(fā)育中需要[3]。Ngn1定位于5號(hào)染色體,最初在非洲爪蟾中發(fā)現(xiàn)[4],在谷氨酸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的分化中起關(guān)鍵作用。它通過激活NeuroD1、Brm3a、GATA3和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體的下游級(jí)聯(lián),促進(jìn)谷氨酸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的正常分化[5]。同時(shí),Ngn1具有決定神經(jīng)元特性和亞型的功能,其生成的數(shù)量與特性在時(shí)間與空間上的順序受限于增殖的神經(jīng)祖細(xì)胞[6]。Ngn1可強(qiáng)烈誘導(dǎo)與神經(jīng)細(xì)胞遷移相關(guān)的基因,激活神經(jīng)發(fā)生的程序,包括細(xì)胞表面變化,誘導(dǎo)基因參與細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期調(diào)控因子[7]。可能通過干擾轉(zhuǎn)錄輔助因子介導(dǎo)多個(gè)啟動(dòng)子綁定的轉(zhuǎn)錄因子抑制膠質(zhì)細(xì)胞基因激活。

2 Ngn1在神經(jīng)發(fā)生過程中的作用

神經(jīng)細(xì)胞分化的過程極其復(fù)雜,在不同階段均有特定的標(biāo)志基因被開放或關(guān)閉,Ngn1能夠刺激神經(jīng)祖細(xì)胞的神經(jīng)元分化,但抑制膠質(zhì)細(xì)胞分化[5],并對(duì)神經(jīng)細(xì)胞亞型的分化起著關(guān)鍵作用。目前Ngn1在神經(jīng)發(fā)育中已經(jīng)得到較深入的研究。從非洲爪蟾和斑馬魚的神經(jīng)管的分化、小鼠和雞的皮質(zhì)祖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化,再到誘導(dǎo)小鼠胚胎p19癌細(xì)胞等,Ngn1都是不可或缺的角色。Blader等[8]研究了斑馬魚胚胎發(fā)育過程中Ngn1基因調(diào)控情況,證實(shí)脊椎動(dòng)物胚胎盡管缺乏原代神經(jīng)元,但可通過相關(guān)的機(jī)制來誘導(dǎo)Ngn1表達(dá)。Murray等[9]首先克隆了小鼠Ngn1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA2.7kb第一外顯子片段,發(fā)現(xiàn)在內(nèi)源性Ngn1條件誘導(dǎo)下對(duì)其神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)具有決定作用。吳萌[10]以全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,atRA,簡(jiǎn)稱RA)誘導(dǎo)小鼠胚胎瘤p19細(xì)胞分化模型模擬了胚胎干細(xì)胞被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)干細(xì)胞,繼之成為神經(jīng)前體細(xì)胞,直至終末分化成神經(jīng)元細(xì)胞的整個(gè)過程,發(fā)現(xiàn)在此過程中Ngn1表達(dá)顯著提高,其區(qū)域組蛋白H3多個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)乙?；揎棤顟B(tài),提示與Ngn1表達(dá)激活調(diào)控有關(guān)。Ngn1在缺血性卒中模型也有研究。急性卒中動(dòng)物模型中,注射表達(dá)Ngn1神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞比注射親代間充質(zhì)干細(xì)胞更能有效地緩解神經(jīng)功能缺損,且Ngn1的神經(jīng)誘導(dǎo)可增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢能力,提高其在缺血大鼠腦內(nèi)的植入效率[11]。閆曉波等[12]通過觀察試管缺氧培養(yǎng)模型后發(fā)現(xiàn),Ngn1能促進(jìn)成鼠大腦室下區(qū)缺氧后NSCs增生,認(rèn)為Ngn1在成鼠大腦缺血性腦卒中誘發(fā)的神經(jīng)再生過程中可能具有促進(jìn)其增殖的作用。此外,也有研究[13]認(rèn)為,Ngn1和β-catenin對(duì)缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化的共同協(xié)調(diào),促進(jìn)了神經(jīng)元進(jìn)行自我修復(fù)。

3 Ngn1與相關(guān)通路

3.1 Ngn1與JAK/STAT通路 大腦的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)是十分復(fù)雜的,Ngn1促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞形成是通過調(diào)節(jié)特定基因的活性來實(shí)現(xiàn)。JAK/STAT通路在神經(jīng)損傷、神經(jīng)修復(fù)和免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,就神經(jīng)發(fā)生而言,它一直充當(dāng)著開關(guān)的角色:體外研究表明,Ngn1激活的同時(shí)會(huì)與啟動(dòng)子miR-9結(jié)合, 下調(diào)JAK/STAT途徑上的關(guān)鍵成分, 實(shí)現(xiàn)Stat磷酸化的抑制, 從而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的形成[14]。使NSCs開始向神經(jīng)元方向分化。因此Ngn1對(duì)NSCs的分化具有競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)控作用。

3.2 Ngn1與CBP/p300 作為轉(zhuǎn)錄共激活因子之一,環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB binding protein,CBP)結(jié)合原件組蛋白乙?；窩BP/p300目前受到廣泛關(guān)注[15],CBP/p300屬于組蛋白乙酰化酶的兩個(gè)亞型,廣泛參與各種組蛋白的乙?；揎?使染色質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)變得疏松,利于基因表達(dá)。它能與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用,使轉(zhuǎn)錄因子被募集到啟動(dòng)子區(qū)域,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成,共同激活星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)基因。但Ngn1通過蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用,將激活劑復(fù)合物遠(yuǎn)離神經(jīng)膠質(zhì)分化基因。具體來說就是Ngn1螯合CBP/p300-Smad1的轉(zhuǎn)錄共激活因子復(fù)合物,從而阻斷其與STAT膠質(zhì)分化因子的相互作用,實(shí)現(xiàn)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性基因轉(zhuǎn)錄的作用[16]。

3.3 Ngn1與Wnt信號(hào)通路 Ngn1同時(shí)受Wnt信號(hào)的調(diào)節(jié),β-catenin是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子,且作為Ngn1的上游基因,能上調(diào)Ngn1的表達(dá)[17]。Wnt蛋白通過自分泌或旁分泌作用與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合,激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,特異地啟動(dòng)、激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而在胚胎的發(fā)育過程中對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、遷移、極性化和凋亡等過程進(jìn)行調(diào)節(jié)[18]。在經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的β-catenin/TCF復(fù)合物直接結(jié)合Ngn1 mRNA以促進(jìn)Ngn1蛋白在皮層神經(jīng)元前體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。

3.4 Ngn1與Notch信號(hào)通路 目前Notch信號(hào)通路已被認(rèn)為對(duì)NSCs的發(fā)育至關(guān)重要,該信號(hào)通路是一條保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,由兩個(gè)鄰近細(xì)胞的Notch受體與其配體相互作用而激活。研究表明,Notch信號(hào)通路通過抑制神經(jīng)元分化和軸突再生,促進(jìn)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生[19],其靶基因主要是bHLH轉(zhuǎn)錄因子,包括Hes1、Hes5、Mash1、Ngn1和Ngn2等[20]。Notch信號(hào)負(fù)調(diào)節(jié)Ngn1表達(dá),其中Hes1基因持續(xù)的過表達(dá)能下調(diào)Ngn1的表達(dá),即Hes1可以起到拮抗易位基因Ngn1的活性,從而維持NSCs的穩(wěn)定。

4 Ngn1與相關(guān)疾病

4.1 Ngn1與ALS 肌萎縮脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)又稱“漸凍人癥”,是指上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷之后,導(dǎo)致包括球部(所謂球部,是指延髓支配的這部分肌肉)、四肢、軀干、胸部腹部的肌肉逐漸無力和萎縮。有研究表明,ALS發(fā)病過程主要由激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞及其釋放的活性物質(zhì)所介導(dǎo)的多種細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用所引發(fā)[21]。長(zhǎng)期以來ALS的治療一直成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域無法攻克的難題,對(duì)此進(jìn)行了大量的研究實(shí)驗(yàn),其中有研究發(fā)現(xiàn)[22]在成年轉(zhuǎn)基因模型鼠脊髓中Ngn1表達(dá)明顯減少,推測(cè)ALS的發(fā)生與Ngn1的下調(diào)相關(guān)。治療上[23],通過在間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)中表達(dá)Ngn1基因,并移植到ALS小鼠模型中的神經(jīng)元誘導(dǎo)可導(dǎo)致神經(jīng)元樣細(xì)胞遷移到CNS,系統(tǒng)移植MSCs-Ngn1可通過調(diào)節(jié)對(duì)單核細(xì)胞化學(xué)誘導(dǎo)蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)受體的表達(dá)水平及體外遷移活動(dòng)對(duì)宿主神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生有利影響,提示神經(jīng)誘導(dǎo)移植MSCs對(duì)長(zhǎng)期治療ALS有潛在益處,Ngn1的作用必不可少。若能在發(fā)病前期移植,MSCs-Ngn1可延遲疾病發(fā)作進(jìn)展,而未經(jīng)處理的MSCs無效[23],這將為ALS的治療提供新的思路。

4.2 Ngn1與阿爾茨海默病 阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)又稱老年性癡呆,是由神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞缺陷引起,導(dǎo)致記憶衰退、認(rèn)知障礙、癡呆和肢體運(yùn)動(dòng)障礙[24],為中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一,起病隱匿、進(jìn)展性加重且不可治愈是其主要特點(diǎn),近年來針對(duì)其發(fā)病及治療機(jī)制研究逐漸深入,其中內(nèi)源性誘導(dǎo)NSCs增殖與分化,替代損傷或壞死的神經(jīng)細(xì)胞并重建神經(jīng)通路,從而改善學(xué)習(xí)記憶能力,是干細(xì)胞治療AD的機(jī)理之一。據(jù)報(bào)道,AD患者海馬神經(jīng)元線粒體較正常人有所減少,而在將NSCs移植到轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型中,發(fā)現(xiàn)其線粒體數(shù)量和線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增加[25],增加了神經(jīng)細(xì)胞能量輸出及其效率。Ngn1在神經(jīng)發(fā)生過程中具有競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)控NSCs向神經(jīng)元分化的關(guān)鍵作用,同樣也參與了AD治療某些關(guān)鍵環(huán)節(jié)[26]。海馬齒狀回顆粒下區(qū)的神經(jīng)發(fā)生可以作為AD中的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制,已有研究證實(shí)MSCs能在淀粉樣蛋白-β(Aβ)相關(guān)的AD模型中通過增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)元祖細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)元,調(diào)控海馬神經(jīng)發(fā)生[27]。本研究團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期致力于補(bǔ)腎中藥防治AD的臨床與機(jī)制研究,研究發(fā)現(xiàn)[28]益腎化濁方能明顯改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,提高其海馬區(qū)Ngn1基因表達(dá)水平,促進(jìn)神經(jīng)元Tubulin蛋白表達(dá),抑制GFAP蛋白表達(dá),由此推測(cè)益腎化濁方可能通過調(diào)控NSCs的分化促進(jìn)神經(jīng)元再生,進(jìn)而改善其學(xué)習(xí)記憶功能,該作用與調(diào)控Ngn1基因的表達(dá)密切相關(guān)。

4.3 Ngn1與精神分裂癥 多重證據(jù)表明精神分裂癥源自異常的神經(jīng)發(fā)育,因此參與腦結(jié)構(gòu)發(fā)育的基因序列變異可能與導(dǎo)致精神分裂癥中的結(jié)構(gòu)變化發(fā)生重疊。目前在Ngn1基因敲除小鼠中觀察到丘腦的發(fā)育不良[29],與在精神分裂癥中看到的丘腦結(jié)構(gòu)異常相似。有人[30]測(cè)序了來自愛爾蘭高度精神分裂癥家庭25名受試者的Ngn1基因,使用譜系不平衡試驗(yàn)(Pedigree Disequilibrium Test,PDT)和復(fù)雜疾病家系關(guān)聯(lián)性分析(FBAT)發(fā)現(xiàn),兩個(gè)Ngn1相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的主要等位基因位點(diǎn)(rs2344484-C和rs8192558-G)在精神分裂癥患者中更普遍,證明Ngn1變體可能對(duì)精神分裂癥易感性有一定的影響,但需要更大的樣本量來證實(shí),必須注意的是Ngn1和精神分裂癥之間存在相應(yīng)的關(guān)系[31]。

5 Ngn1與相關(guān)疾病的中醫(yī)治療

由于神經(jīng)系統(tǒng)的特殊性,目前很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病都缺乏有效的治療措施。Ngn1可以通過對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化功能進(jìn)行調(diào)控,從而達(dá)到神經(jīng)再生、恢復(fù)相關(guān)神經(jīng)功能等目的。但目前,尚未發(fā)現(xiàn)可具體調(diào)控Ngn1基因表達(dá)的方法。但有相關(guān)研究表明,中醫(yī)藥治療手段可以很好地達(dá)到增加Ngn1 基因表達(dá)的功效,從而達(dá)到有效治療目的。

5.1 中藥治療 神經(jīng)再生與中醫(yī)理論中“腦髓”功能活動(dòng)相類似,那么人腦內(nèi)神經(jīng)元受損缺失的病理基礎(chǔ)可能與腎中精氣虧虛相關(guān)聯(lián)[32]。實(shí)驗(yàn)研究表明,益腎化濁方可能通過增加AD模型中大鼠海馬區(qū)Ngn1基因的表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)元再生及神經(jīng)干細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化[28];缺血性卒中在我國發(fā)病率極高,中醫(yī)上稱之為“中風(fēng)”,其后遺癥期基本病機(jī)以“氣虛血瘀”最為多見。補(bǔ)陽還五湯具有補(bǔ)氣活血通絡(luò)的功效,臨床中可以起到很好的改善中風(fēng)后遺癥效果。研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)陽還五湯可通過調(diào)節(jié) NSCs Notch信號(hào)通路相關(guān)因子Ngn1等基因的表達(dá)水平從而促進(jìn) NSCs 的增殖[33]。

5.2 針灸治療 目前研究發(fā)現(xiàn),針灸治療可以通過干預(yù)各類信號(hào)通路,從而調(diào)控NCSs增殖分化,達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)與再生的目的[34]。實(shí)驗(yàn)研究表明,對(duì)大椎穴、次髎穴等穴位進(jìn)行電針治療,可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路中Ngn1蛋白表達(dá),達(dá)到促進(jìn)脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖與活化的目的,從而改善完全性骶上脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱大鼠的尿流動(dòng)力學(xué)[35];此外,火針干預(yù)后的脊髓損傷模型大鼠Ngn1和Cyclin D1的基因表達(dá)量均明顯升高,說明火針療法也可以調(diào)控Ngn1和Cyclin D1的基因表達(dá),從而達(dá)到恢復(fù)相關(guān)神經(jīng)功能的作用[36]。

6 結(jié)語

目前對(duì)Ngn1的功能已有很多研究報(bào)道,但對(duì)其所調(diào)控的認(rèn)識(shí)仍非常有限。例如Ngn1的轉(zhuǎn)錄如何被控制、活性如何調(diào)節(jié)、如何被募集到目的基因等都還有待進(jìn)一步研究,可能與其他基因相似,受到多水平的調(diào)控。總體來說,Ngn1發(fā)揮作用的具體機(jī)理研究及如何與中醫(yī)藥治療方法相結(jié)合將是今后研究的一個(gè)重要內(nèi)容。深入研究Ngn1的功能和調(diào)節(jié)將有助于我們更好地理解神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制,以及為NSCs治療諸多難治性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、精神分裂癥等提供潛在的治療途徑或假設(shè)。