黃華萍 周曉玲

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 (廣西 南寧, 530200) 2.柳州市中醫(yī)醫(yī)院

1 外泌體的特征及功能

人體中所有細(xì)胞都可以分泌脂質(zhì)雙層膜包裹的,可穿過生物屏障進(jìn)入細(xì)胞的囊泡群[1]。分泌的細(xì)胞囊泡群可根據(jù)其大小分為外泌體、微泡以及凋亡小體,其中外泌體是一種由細(xì)胞內(nèi)多囊泡與細(xì)胞膜分離形成并釋放到細(xì)胞外,攜帶一系列復(fù)雜生物活性物質(zhì),如蛋白質(zhì)、miRNA、DNA和糖脂等,進(jìn)入細(xì)胞參與生理活動(dòng),直徑為30～150 nm大小的小膜結(jié)合囊泡,可通過標(biāo)志物和蛋白質(zhì)區(qū)分外泌體與微泡和凋亡小體[2,3]。

外泌體與靶細(xì)胞相互作用方式各不相同,其中主要的是:①通過內(nèi)吞作用在細(xì)胞之間起到傳遞信息、細(xì)胞間物質(zhì)交換、新陳代謝、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)免疫細(xì)胞的歸巢等功能[4],例如與琥珀酰亞胺酯(pHrodo)標(biāo)記的外泌體共同培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞(DC)出現(xiàn)了熒光紅色[5];使用光學(xué)顯微鏡觀察人胚腎上皮細(xì)胞(HEK293T)與含GFP-CD63外泌體(GFP-CD63 EV)共同培育后的細(xì)胞質(zhì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)點(diǎn)狀染色模式,且在此基礎(chǔ)上使用發(fā)動(dòng)蛋白(dynamin)抑制劑,出現(xiàn)外泌體的被攝取率減少[6],由上證據(jù)可知外泌體通過內(nèi)吞作用作用于靶細(xì)胞;②外泌體因攜帶的物質(zhì)不同而具有多種不同的活性,如調(diào)節(jié)免疫、抗凝抗炎等,例如在上皮和內(nèi)皮細(xì)胞衍生的外泌體與Flt3+或Tie2+肺泡巨噬細(xì)胞(AM)的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),上皮和內(nèi)皮細(xì)胞衍生的外泌體通過抑制蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子1(RGS1)來調(diào)節(jié)AM亞群的免疫表型來達(dá)到調(diào)節(jié)免疫、抗炎等作用[7];人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的含miR-455-3p的外泌體在肝臟內(nèi)通過抑制枯否細(xì)胞活化和炎性因子分泌來達(dá)到改善肝臟以及全身炎癥反應(yīng)的目的[8];③外泌體可能可作為潛在的特性高的診斷工具,起到診斷標(biāo)志物的作用,例如HCC細(xì)胞旁分泌的外泌體miR-21通過激活癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞并促進(jìn)癌癥進(jìn)展,說明外泌體miR-21可能成為肝細(xì)胞癌的新的標(biāo)志物[9,10]。

肝硬化、肝衰竭、肝癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚未完全明確,但與環(huán)境、代謝、遺傳等密切相關(guān),其治療也會(huì)受到許多原因限制,如自身免疫、經(jīng)濟(jì)條件等,由此迫切需要找到新的治療方式。外泌體對(duì)于肝病的作用及其治療潛力是巨大的,許多證據(jù)表明,在受損程度不同的肝臟中,釋放的外泌體種類、含量也會(huì)有所不同,因此外泌體可能成為肝病中新的標(biāo)志物,便于臨床中對(duì)疾病更早更準(zhǔn)確的診斷,也可通過外泌體介導(dǎo)細(xì)胞間通訊、物質(zhì)交換等作用參與肝病的生理病理的過程中,實(shí)現(xiàn)對(duì)肝硬化、肝衰竭、肝癌等一系列肝病的干細(xì)胞治療[11,12]。

2 外泌體與肝病

2.1 外泌體與肝硬化 肝硬化是一種由多種慢性肝病發(fā)展而成的病理階段[13]。有研究證明,肝硬化發(fā)展到一定程度,將無法通過消除致病因素促進(jìn)肝纖維化的消退,但由于人體的肝臟具有較高的再生能力,肝硬化初期可通過消除致病因素使肝纖維化消退,恢復(fù)部分肝功能,因此我們可以無細(xì)胞療法干預(yù)肝硬化的進(jìn)程[14]。肝纖維化過程為細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積,是肝臟組織損傷和修復(fù)的病理反應(yīng),多因藥物、酒精、病毒以及自身免疫或代謝性疾病所引起;肝臟中多種細(xì)胞均參與此病理過程,包括肝星狀細(xì)胞(HSC)、成纖維細(xì)胞和枯否細(xì)胞等[15]。其中星狀細(xì)胞被激活和轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,并且通過自分泌和旁分泌不斷地釋放細(xì)胞因子,促進(jìn)自身增殖和活化,并分泌膠原纖維,是肝纖維化形成的關(guān)鍵過程[16]。在實(shí)驗(yàn)研究中表明,Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過特定基因的轉(zhuǎn)錄,特別是WISP1和Cyclin D1,在肝星狀細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞外基質(zhì)形成過程中起重要作用[17];人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體(hBM-MSCs-Ex)通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路導(dǎo)致 HSC 活化的下調(diào),并最終減少肝纖維化[18]。在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化老鼠模型中,通過血清檢測(cè)法檢測(cè)干細(xì)胞、外泌體的治療組血清發(fā)現(xiàn)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBil)、堿性磷酸酶(ALP)和γ-轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)的水平較未處理組顯著降低,且血清總蛋白(TP)的血清水平較未處理組高,提示干細(xì)胞、外泌體的治療組肝功能增高;此外,外泌體治療組與干細(xì)胞治療組相比,外泌體治療組的表面肝纖維化指標(biāo)顯著降低,表明外泌體治療組的效果較干細(xì)胞治療組的效果明顯[19]。

另有研究表明,在肝纖維化過程中,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,其參與肝星狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞樣表型的轉(zhuǎn)化[20-22]。HBM-MSCs-Ex靶向STAT3,表達(dá)嗜肝性,且與STAT3形成iExosiRNA-STAT3和 iExomASO-STAT3,抑制STAT3信號(hào)通路,可有效抑制肝纖維化形成[23]。

2.2 外泌體與肝衰竭 肝衰竭與肝硬化均可由慢性乙型肝炎病毒引起,二者不同之處在于目前可應(yīng)用的常規(guī)治療手段中,肝硬化的治療中目前尚缺少有效驗(yàn)證的藥物,多以治療原發(fā)病為主,而肝衰竭患者可通過自身肝臟再生能力而存活[24]。臨床上常用甲胎蛋白(AFP)作為判斷肝臟再生的標(biāo)志物,但其也可作為肝臟腫瘤、生殖細(xì)胞腫瘤標(biāo)志物。其余標(biāo)志物均在肝臟中過分表達(dá),缺乏特異性。許多實(shí)驗(yàn)研究表明, 源自肝細(xì)胞本身的外泌體所攜帶的蛋白質(zhì)、RNA或microRNA,隨著肝臟疾病的不同病理特征展現(xiàn)出不一樣的水平波動(dòng),可能成為作為不同肝病的潛在標(biāo)志物[25]。在實(shí)驗(yàn)研究中,通過圖像流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組、慢性乙型病毒性肝炎患者(CHB)和慢加急性肝衰竭(ACLF)患者的血清水平發(fā)現(xiàn),ACLF患者和CHB患者較對(duì)照組血清中含白蛋白(ALB)和CD63的外泌體百分比升高,由此可推測(cè)源自于肝細(xì)胞含有ALB和CD63的外泌體可作為ACLF、CHB的預(yù)警標(biāo)志物;亦發(fā)現(xiàn)含有ALB 、CD63和VEGF的外泌體百分比在CHB中增加,但在ACLF中減少,且在ACLF患者死亡組與存活組的血清比較中,存活組血清含CD63、ALB及VEGF的外泌體比死亡組百分比高,含CD63、ALB的外泌體百分比在兩者之間無差異,故可推測(cè)可能具有ALB、VEGF的肝源性外泌體可作為肝臟再生及預(yù)后評(píng)估的特異性高的新標(biāo)記物[26]。

急性肝衰竭(AHF)多以黃疸、凝血功能障礙以及多器官衰竭為主要臨床表現(xiàn),由全身炎癥反應(yīng)綜合征引起的高死亡率的一種疾病,其刺激因素多以肝細(xì)胞死亡為主[27]。研究發(fā)現(xiàn),脂多糖/D-氨基半乳糖(LPS/D-GalN)誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠模型中,脂多糖(LPS)與Toll樣受體4 (TLR4)/CD14 復(fù)合物結(jié)合,通過Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 (JAK/STAT) 或核因子激活的B細(xì)胞的κ-輕鏈增強(qiáng)(NF-κB)等通路激活炎性因子導(dǎo)致肝臟炎性病變及肝細(xì)胞死亡,引起急性肝衰竭[28,29]。其中,誘導(dǎo)的炎性因子以NLRP3炎性小體(NLRP3)、白細(xì)胞介素1b(IL-1b)和半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)為主,三者為肝臟炎癥損傷決定因素[30]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中,通過對(duì)肝臟組織進(jìn)行H&E 染色,羊膜間質(zhì)干細(xì)胞旁分泌的外泌體(hAMSC-Exos)在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的AHF小鼠模型組與對(duì)照組相比,模型組肝臟組織損傷較對(duì)照組減輕,其中包括細(xì)胞壞死、炎性滲出以及組織出血均減輕,且在通過兩者的血清檢測(cè)中可得,模型組的肝酶水平較對(duì)照低;LPS/D-GalN誘導(dǎo)的AHF小鼠模型組中的NLRP3和caspase-1水平顯著比對(duì)照組水平減弱,以及模型組血清中IL-1b和白細(xì)胞介素6(IL-6)等炎癥因子明顯降低。由此可知,羊膜間質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體可能通過調(diào)節(jié)NLRP3 和Caspase-1改善急性肝衰竭的炎癥反應(yīng)。此外,在HAMSC-Exos與LPS刺激的巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中表明,外泌體降低了NLRP3、IL-1b和IL-6等炎癥因子的活化,也證明了外泌體可能通過調(diào)節(jié)NLRP3改善LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠模型的炎癥反應(yīng)[31-33]。

2.3 外泌體與肝癌 肝細(xì)胞癌(HCC)是常見癌癥之一,其多以慢性肝病以及肝硬化為基礎(chǔ)發(fā)病,病程進(jìn)展快,其確診時(shí)多發(fā)展為癌癥晚期。肝細(xì)胞癌早期診斷的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)標(biāo)志物多以血清中的甲胎蛋白為主,特異性不高,確定新的具體的特異性高的肝細(xì)胞癌標(biāo)志物更有利于發(fā)現(xiàn)早期腫瘤[34]。有許多證據(jù)表明腫瘤多位于腫瘤上皮細(xì)胞改變的復(fù)雜內(nèi)環(huán)境,其中包括非惡性的細(xì)胞類型改變,這些細(xì)胞類型改變可以通過旁分泌機(jī)制分泌外泌體、囊泡、促血管生成因子等細(xì)胞因子,并在肝臟內(nèi)表達(dá)[35]。在HCC中,源自腫瘤細(xì)胞的高水平外泌體可攜帶腫瘤相關(guān)抗原或源自肝細(xì)胞的蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA 和 lncRNA等相關(guān)生物活性分子,且不同的病理階段和生理環(huán)境下其含量以及種類都有所不同,可能成為新的潛在的腫瘤標(biāo)志物,有助于臨床上對(duì)腫瘤早期的非創(chuàng)傷性診斷[36,37]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中,通過對(duì)進(jìn)行缺乏膽堿、低蛋氨酸和氨基酸確定的飲食(CDAA飲食)喂養(yǎng)與膽堿充足和氨基酸確定的飲食(CSAA飲食)喂養(yǎng)的不同時(shí)期小鼠模型組的血清使用微陣列分析所得結(jié)果相比較,在喂養(yǎng)CDAA飲食模型組的第6、18、32 和65周的小鼠中大約有30個(gè)miRNA的失調(diào);并且通過實(shí)時(shí)RT-PCR對(duì)CDAA飲食的小鼠模型組進(jìn)行分析結(jié)果顯示由炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)的含miR-155外泌體在不同時(shí)期的含量均比對(duì)照組水平升高,其結(jié)果可以確定參與飲食誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生的含miR-155的外泌體成為特異性高的新的可能標(biāo)靶[38- 41]。

目前,HCC的治療手段多以全身化療、射頻消融術(shù)、手術(shù)切除或肝移植為主,晚期肝癌治療手段更是有限。隨著當(dāng)前科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,在治療手段上多向無細(xì)胞治療發(fā)展[10,42]。在實(shí)驗(yàn)中將富含AFP的樹突狀細(xì)胞旁分泌的外泌體(DEXAFP)連續(xù)26天通過尾靜脈注射到原位肝細(xì)胞癌的小鼠模型中,其實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)γ-干擾素(IFN-γ)的CD8+ T淋巴細(xì)胞明顯增加以及白細(xì)胞介素-2(IL-2)和IFN-γ水平明顯升高,并且CD25+Foxp3+減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和降低腫瘤的白介素-10(IL-10)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)水平,且在注射DEXAFP治療周期的不同時(shí)間點(diǎn)中對(duì)模型組小鼠進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境的變化與免疫微環(huán)境的變化呈正相關(guān),以上現(xiàn)象可表明模型組小鼠體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境得到改善,以及證明DEXAFP在原位HCC的小鼠中可以引起抗原特異性的免疫反應(yīng)、明顯的延緩腫瘤的生長(zhǎng)及提高HCC小鼠存活率[43-45]。在HCC患者的化學(xué)治療及免疫治療中會(huì)因體質(zhì)差、免疫功能降低或耐藥性增加等自身?xiàng)l件而出現(xiàn)治療效果不佳的情況,針對(duì)這些出現(xiàn)的情況,許多研究者發(fā)現(xiàn)可通過外泌體介導(dǎo)藥物進(jìn)行靶點(diǎn)治療,且治療效果可觀。其通過電穿孔法將去甲斑蝥素(NCTD)加載至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體(BMSC-Exos)中形成Exos-NCTD,并將其通過尾靜脈注射至HCC小鼠模型中,治療結(jié)束后可發(fā)現(xiàn),與NCTD治療對(duì)照組相比較,Exos-NCTD組小鼠的腫瘤重量較輕,且腫瘤細(xì)胞發(fā)生了明顯的細(xì)胞核縮小和細(xì)胞密度低等形態(tài)學(xué)上的改變,表明在使用Exos-NCTD治療過程中腫瘤細(xì)胞受到了抑制。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)NCTD治療HCC小鼠時(shí),小鼠肝臟和腎臟受到一定程度的損害,但Exos-NCTD治療組中未見明顯器官受損,這表明外泌體介導(dǎo)藥物進(jìn)行靶向治療與藥物直接治療相比較更安全,療效更好[46- 48]。

3 中醫(yī)藥聯(lián)合外泌體治療肝病

隨著干細(xì)胞療法的興起,研究者們也將中醫(yī)藥與干細(xì)胞療法相結(jié)合,特別是外泌體結(jié)合中藥治療肝纖維化、肝癌等。例如,將NCTD與BMSC-Exos共同放入電穿孔杯,通過電穿孔法將藥物載入外泌體,形成Exos-NCTD,并且將其注入老鼠體內(nèi),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Exos-NCTD在體內(nèi)可表現(xiàn)出對(duì)HCC引起肝臟損害的修復(fù)[46,49]。另有實(shí)驗(yàn)表明,LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞外泌體通過細(xì)胞內(nèi)TGF-β1/Smad信號(hào)通路激活肝星狀細(xì)胞活化促進(jìn)肝纖維化,使用黃芪總苷、甘草酸預(yù)處理可以有效對(duì)巨噬細(xì)胞外泌體對(duì)細(xì)胞內(nèi)TGF-β1/Smad信號(hào)通路活化,從而減輕肝纖維化[50]。

4 總結(jié)

基于干細(xì)胞移植治療慢性肝病的研究基礎(chǔ),通過干細(xì)胞旁分泌的外泌體治療肝病也得到了實(shí)驗(yàn)研究。雖然國內(nèi)外的很多研究者都對(duì)外泌體進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,且取得了一定的研究成果,但外泌體在臨床應(yīng)用之前尚存在許多問題,如外泌體的來源、提取保存、治療所需要的劑量、使用方法等尚不能統(tǒng)一,缺乏大樣本、大中心的隨機(jī)對(duì)照數(shù)據(jù)以及證據(jù)等級(jí)需要進(jìn)一步的提升。在疾病診斷方面,外泌體顯現(xiàn)出了較高的特異性,具有一定的應(yīng)用價(jià)值,但在檢測(cè)疾病發(fā)展過程中特異性的外泌體的過程復(fù)雜和技術(shù)尚未成熟。隨著時(shí)代的發(fā)展,科學(xué)技術(shù)的發(fā)展也將逐步成熟,應(yīng)用外泌體的干細(xì)胞治療方式將會(huì)更加安全、有效、便捷,這也更加需要我們對(duì)外泌體治療各種慢性肝病的機(jī)制及臨床應(yīng)用進(jìn)行更深入的研究,以更快的使其應(yīng)用在臨床上,解決更多的臨床問題。