梁淑杰，彭乙華，雷佳紅，賈艾敏，蔣紅，蔡燕1,,,5

研究快報

轉(zhuǎn)錄因子基因c.493T>C位點突變對其蛋白質(zhì)水平的影響

梁淑杰4，彭乙華2，雷佳紅3，賈艾敏3，蔣紅3，蔡燕1,3,4,5

1. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心，南充 637000 2. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，南充 637000 3. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫研究所，南充 637000 4. 川北醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院，南充 637000 5. 川北醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，南充 637000

肝細(xì)胞核因子1α (hepatocyte nuclear factor 1α，HNF1α)作為一種轉(zhuǎn)錄因子在維持胰腺β細(xì)胞功能、肝臟脂質(zhì)代謝等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。該基因突變是導(dǎo)致青少年起病的成人型糖尿病(maturity onset diabetes of the young，MODY)3型的致病原因，目前已報道的該基因的突變位點眾多，如P291fsinsC、P112L等常見的突變位點，但其具體的分子機(jī)制尚不清楚。本研究對前期工作中發(fā)現(xiàn)的1例攜帶有基因c.493T>C位點突變的MODY3患者，通過應(yīng)用Mutation Surveyor軟件分析突變位點的致病性，構(gòu)建野生型和突變型真核表達(dá)質(zhì)粒，采用Western blot檢測兩種質(zhì)粒表達(dá)的HNF1α蛋白質(zhì)的量和穩(wěn)定性變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mutation Surveyor軟件分析提示c.493T>C位點突變可能為致病性變異基因，Western blot顯示突變型真核質(zhì)粒表達(dá)的HNF1α蛋白質(zhì)的量和穩(wěn)定性均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)。上述結(jié)果表明c.493T>C (p.Trp165Arg)變異顯著影響HNF1α的表達(dá)量及穩(wěn)定性，可能為其導(dǎo)致疾病發(fā)生的原因，為后續(xù)深入探究MODY3的分子致病機(jī)制提供了新的方向。

MODY；HNF1α；基因突變

青少年起病的成人型糖尿病(maturity onset diabetes of the young，MODY)是一種以β細(xì)胞功能障礙和非胰島素依賴為特征的單基因糖尿病，常被誤診為1型和2型糖尿病，具有常染色體顯性遺傳、發(fā)病年齡早于25歲等臨床特點[1]。MODY的發(fā)病率約占糖尿病病例的1%～5%，約占兒童糖尿病的1%～6%[2]。其中肝細(xì)胞核因子1α (hepatocyte nuclear factor 1α，)突變導(dǎo)致的MODY3型是最常見的類型[3]。HNF1α是轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，在肝、胰腺、胃腸、腎中高表達(dá)，是一種以同源或異源二聚體形式發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)控肝臟多種特異性蛋白的表達(dá)，影響肝臟中葡萄糖、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的代謝[3,4]。Shih等[5]研究也發(fā)現(xiàn)，HNF1α缺失導(dǎo)致了胰島發(fā)育與代謝相關(guān)基因的異常，最終小鼠因胰島素分泌功能受損而發(fā)展成了糖尿病，表明HNF1α是維持胰腺β細(xì)胞功能的重要轉(zhuǎn)錄因子。

隨著基因測序技術(shù)的普及，基因新突變位點的發(fā)現(xiàn)不斷增多，目前報道基因突變以錯義、移碼、剪接突變、啟動子區(qū)突變、缺失等形式多見[6]，仍有大量突變尚未明確其致病性，因此需要進(jìn)一步的研究工作來解釋突變位點的確切功能。本課題組在前期工作中發(fā)現(xiàn)了1例攜帶有基因c.493T>C位點突變的MODY3患者，家族中多人具有早發(fā)型糖尿病表現(xiàn)。本研究通過生物信息學(xué)分析、基因表達(dá)載體構(gòu)建、Western blot檢測等方法，探討了該位點突變對HNF1α蛋白表達(dá)水平的影響，以期解釋該突變的可能致病性機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒

HepG2細(xì)胞、293T細(xì)胞由川北醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫研究所保存，大腸桿菌DH5α、載體質(zhì)粒pcDNA3.1-HR-Flag-H由川北醫(yī)學(xué)院雷佳紅博士提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，LB培養(yǎng)基購自英國OXOID公司。

1.1.3 主要試劑

RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、無縫克隆試劑盒、高保真DNA聚合酶購自南京諾維贊生物有限公司，膠回收試劑盒購自北京擎科生物科技股份有限公司，I酶購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)，無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000購自北京聚合美生物科技有限公司，SDS-PAGE凝膠試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，兔抗人HNF1購自英國Abcam公司，β-actin購自杭州華安生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗購自北京中山金橋公司，環(huán)己酰亞胺購自美國AbMole公司。ECL超敏型試劑盒購自合肥白鯊生物科技有限公司，引物合成和序列測定均由浙江有康生物科技有限公司完成。

1.2 生物信息學(xué)Mutation Surveyor軟件分析突變位點的致病性

從NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載基因的mRNA序列，找到突變位點及其上下游的堿基序列，截取包含突變位點在內(nèi)約10個堿基輸入到生物信息學(xué)軟件Mutation Surveyor在線分析網(wǎng)站(http://www.mutationtaster.org/)進(jìn)行功能預(yù)測。

1.3 構(gòu)建突變型和野生型HNF1α真核表達(dá)載體

1.3.1 構(gòu)建pcDNA3.1-HR-Flag-HNF1α野生型真核表達(dá)質(zhì)粒載體

培養(yǎng)HNF1α高表達(dá)的HepG2細(xì)胞提取總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增基因編碼區(qū)全長。上游引物：5′-CCCAA GCTTATGGTTTCTAAACTGAGCCAGC-3′，下游引物：5′-CGGAATTCTTACTGGGAGGAAGAGGCCATCT-3′。產(chǎn)物大小為1903bp。膠回收PCR產(chǎn)物，通過I酶進(jìn)行酶切消化去除質(zhì)粒模板DNA，采用無縫克隆試劑盒與線性化的pcDNA3.1-HR-Flag-H載體連接，將重組載體轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆進(jìn)行菌落鑒定，將陽性的重組質(zhì)粒送公司進(jìn)行測序鑒定。

1.3.2 構(gòu)建pcDNA3.1-HR-Flag-HNF1α突變型真核表達(dá)質(zhì)粒載體

設(shè)計定點突變引物，上游引物：5′-GTACACC TGGTACGTCCGCAAGCAGCGAGAGGTGGCGC-3′，下游引物：5′-CGGACGTACCAGGTGTACAGGGCG GCCCGCTTCTGC-3′。以野生型真核表達(dá)載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收PCR產(chǎn)物，同樣通過I酶進(jìn)行酶切消化，取酶切后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆進(jìn)行菌落鑒定，將陽性的重組質(zhì)粒送公司進(jìn)行測序鑒定。

1.4 Western blot檢測c.493T>C位點突變對HNF1α蛋白表達(dá)的影響

選取內(nèi)源性低表達(dá)HNF1α的293T細(xì)胞作為研究對象，培養(yǎng)條件：DMEM高糖培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清，在濕度培養(yǎng)箱中保持37℃和5%CO2的恒定條件進(jìn)行培養(yǎng)。分別提取野生型和W165R突變重組質(zhì)粒備用。轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞以每孔20萬個細(xì)胞的密度接種在6孔板中。用Lip2000分別轉(zhuǎn)染野生型和突變型的真核表達(dá)質(zhì)粒，每孔轉(zhuǎn)染4μg重組DNA和10μL Lip2000。

1.4.1 Western blot檢測HNF1α蛋白表達(dá)量的變化

收集轉(zhuǎn)染后24 h及1～4天的兩組細(xì)胞提取總蛋白，用BCA蛋白測定法進(jìn)行蛋白定量。10%SDS- PAGE電泳，每孔蛋白上樣量為30μg。電泳完畢后，濕轉(zhuǎn)膜250mA，2 h。PVDF膜室溫封閉2h，抗人HNF1α重組單克隆抗體(1∶3000) 4℃搖床孵育過夜，PBST洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗室溫孵育1.5h，采用全自動凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影，使用Image J.JS對條帶進(jìn)行歸一量化。內(nèi)參采用β-actin (1∶3000)。

1.4.2 Western blot檢測HNF1α蛋白穩(wěn)定性的變化

步驟同前，293T細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入50μg/mL環(huán)己酰亞胺(Cycloheximide，CHX)于培養(yǎng)基中。CHX是一種真核生物蛋白質(zhì)合成抑制劑，可以抑制蛋白的生物合成。收集轉(zhuǎn)染野生型與W165R重組質(zhì)粒經(jīng)CHX處理不同時間(0h、4h、8 h、12h)的細(xì)胞，并分別提取細(xì)胞總蛋白。采用Western blot方法檢測HNF1α蛋白穩(wěn)定性的變化，步驟同前。對CHX處理不同時間的野生型和W165R突變型條帶進(jìn)一步歸一化為0h處理的HNF1α條帶。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差顯示。統(tǒng)計分析使用GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行了統(tǒng)計分析，采用非配對檢驗，以<0.05確定差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

研究表明，MODY3型在歐洲、北美洲最常見，但在中國的發(fā)病率相對較低，小于1%[7]，目前基因診斷尚未完全普及，關(guān)于MODY的報道仍較少，難以統(tǒng)計完整的發(fā)病率。自1974年Tattersall等[8]發(fā)現(xiàn)以來，如何正確診斷MODY一直是困擾臨床醫(yī)生的問題。雖然不同類型的糖尿病具有高度的異質(zhì)性：2型糖尿病的特征為胰島素抵抗和胰島素相對缺乏，但不存在自身免疫性抗體，是遺傳與環(huán)境兩個危險因素的相互作用的結(jié)果[9]；1型糖尿病的特征是自身免疫性抗體導(dǎo)致β細(xì)胞的破壞，進(jìn)而導(dǎo)致β細(xì)胞的衰竭、胰島素的絕對缺乏，與2型糖尿病相比，其更具有遺傳性[10,11]；而MODY與2型糖尿病最大的不同在于年齡，2型糖尿病一般發(fā)生在成年以后，而MODY的發(fā)病年齡常早于25歲，還具有非胰島素依賴的伴有常染色體顯性遺傳的家族史，且不存在自身免疫破壞，但其臨床表現(xiàn)又有一定交疊[4]，這極大地阻礙了疾病的正確診斷。

目前已經(jīng)確定了14種基因突變與MODY相關(guān)，其中MODY3、MODY2、MODY1和MODY5約占所有MODY的90%[12,13]。MODY2是由葡萄糖激酶的雜合突變導(dǎo)致，而MODY1和MODY5分別由同為轉(zhuǎn)錄因子的HNF4α和HNF1β編碼的基因變異引起。雖然MODY3、MODY1與MODY5的臨床表現(xiàn)相似，MODY3與MODY1一樣，其特征是β細(xì)胞分泌胰島素的進(jìn)行性減少。但MODY3患者早期可出現(xiàn)尿糖陽性早于血糖升高表現(xiàn)，與之相比，MODY1一般腎糖閾正常，且尿糖陽性少見，但二者均可服用磺酰脲類藥物控制血糖。而MODY5患者對磺酰脲類藥物常無反應(yīng)，通常需要胰島素進(jìn)行治療，可能與其產(chǎn)生胰島素抵抗和高胰島素血癥相關(guān)，此外患者腎臟常伴有囊性改變，還可能伴有陰道或子宮畸形與血脂異常[14]。不同亞型的臨床表現(xiàn)存在異質(zhì)性，這使得糖尿病類型的臨床診斷更加困難。

本研究在臨床工作中發(fā)現(xiàn)了基因存在c.493T>C(p.Trp165Arg，W165R)錯義突變，結(jié)合文獻(xiàn)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，目前該位點國內(nèi)尚未見報道，Mutation Surveyor在線分析軟件預(yù)測結(jié)果顯示基因c.493T>C位點突變可能導(dǎo)致疾病發(fā)生(Prediction disease causing: probably deleterious)，其中可能性接近1(pro:0.9999)，提示該突變導(dǎo)致臨床表型的可能較大。為深入研究c.493T>C突變位點的功能，本研究通過同源重組系列實驗，成功構(gòu)建了突變型和野生型pcDNA3.1-HR-Flag-HNF1α真核表達(dá)載體。經(jīng)測序驗證并與NCBI數(shù)據(jù)庫中的人序列比對分析，結(jié)果顯示序列一致(圖1A)。Western blot蛋白檢測結(jié)果表明：(1)與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體的293T細(xì)胞對照組相比，轉(zhuǎn)染野生型和突變型質(zhì)粒均成功表達(dá)HNF1α蛋白，轉(zhuǎn)染突變型的蛋白表達(dá)量明顯低于轉(zhuǎn)染野生型的蛋白表達(dá)量(<0.05)(圖1，B和C)；(2)隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，野生型與突變型的HNF1α蛋白表達(dá)水平的差距逐漸增大，表明蛋白表達(dá)水平存在明顯差異，即突變型蛋白表達(dá)量明顯低于野生型(圖1，D和E)；(3)與未加入CHX處理的0 h組相比，野生型與突變型表達(dá)的HNF1α蛋白均呈現(xiàn)下降的趨勢，但突變型蛋白的半衰期明顯快于野生型蛋白，表明加入CHX處理細(xì)胞后，293T細(xì)胞表達(dá)的突變型HNF1α蛋白的穩(wěn)定性明顯低于野生型(<0.05)(圖1，F(xiàn)和G)。

根據(jù)ClinVar數(shù)據(jù)庫，已經(jīng)報道了798個基因突變，其中278個突變被認(rèn)定為致病性或可能致病性?；蚨ㄎ挥谌旧w12q24.31區(qū)域，包含10個外顯子[15]。HNF1α蛋白包括3個功能域：一個N端二聚體結(jié)構(gòu)域(1～32)，一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(83～279)和一個C端反轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(281～ 631)[16]?；蛲蛔兛梢园l(fā)生在任何一個結(jié)構(gòu)域，但缺乏突變熱點，其中以第4外顯子(p291fsinsc)的突變最為常見[17]。Vaxillaire等[18]發(fā)現(xiàn)，76%與MODY3相關(guān)的錯義突變發(fā)生在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這表明DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域比其他結(jié)構(gòu)域?qū)蝹€氨基酸的改變更敏感。而DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域又包括POU特異性結(jié)構(gòu)域(POUs)、POU同源結(jié)構(gòu)域(POUh)以及一個核定位信號，有研究者發(fā)現(xiàn)POU結(jié)構(gòu)域在維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性方面起著至關(guān)重要的作用[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)的c.493T>C錯義突變，位于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的POU亞結(jié)構(gòu)域中，通過軟件分析提示致病性可能大。本實驗結(jié)果顯示與野生型的HNF1α蛋白比較，c.493T>C突變后HNF1α蛋白的表達(dá)量和穩(wěn)定性明顯降低。Kind等[16]發(fā)現(xiàn)基因POU結(jié)構(gòu)的P112L變異在穩(wěn)態(tài)條件下的表達(dá)水平低于野生型蛋白，本研究結(jié)果與其相符，W165R突變也會導(dǎo)致HNF1α蛋白的表達(dá)減少。

圖1 HNF1α重組質(zhì)粒測序和Western blot檢測蛋白質(zhì)表達(dá)

A：重組質(zhì)粒測序結(jié)果；B：野生型(wild type)、突變型(W165R)過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的HNF1α蛋白表達(dá)情況；C：圖B蛋白條帶對內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理后的HNF1α蛋白表達(dá)差異；D：野生型與突變型過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞1～4天后HNF1α蛋白表達(dá)情況；E：圖D各時間點蛋白條帶對內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理后的HNF1α蛋白表達(dá)差異；F：野生型與突變型過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后加入CHX 0、4、8、12 h 檢測HNF1α蛋白表達(dá)情況；G：圖F各時間點蛋白條帶對0 h條帶進(jìn)行歸一化處理后的HNF1α表達(dá)差異。**：<0.01；***：<0.001。

不同突變位點的臨床表現(xiàn)與功能改變也有所不同。Li等[17]發(fā)現(xiàn)突變發(fā)生于二聚體結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的患者的發(fā)病年齡較低，而發(fā)生截短突變的患者發(fā)病年齡小于發(fā)生錯義突變的患者；同時發(fā)現(xiàn)MODY3患者的基礎(chǔ)胰島素水平和胰島素對高糖刺激的反應(yīng)也存在差異，患者的空腹血糖或正?；蛎黠@升高；與血糖正常人群相比，MODY3患者的基礎(chǔ)胰島素分泌較低，但高糖刺激后胰島素分泌增加，但程度不盡相同。這種差異可能是不同突變的結(jié)果，也提示了對于高糖刺激胰島素分泌可能發(fā)揮直接調(diào)節(jié)作用。研究表明，不僅參與調(diào)控胰島素的轉(zhuǎn)錄，還直接調(diào)控參與胰島素分泌的重要基因，如葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2和肝細(xì)胞核因子4α、丙酮酸激酶[20]。有研究發(fā)現(xiàn)[21]基因POU結(jié)構(gòu)的T260M致病性變異會導(dǎo)致靶基因表達(dá)減少。與都是轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分，已被證實具有相互調(diào)節(jié)的作用，可以激活的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄活性，而直接通過蛋白質(zhì)相互作用下調(diào)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活，還可以減弱自身的表達(dá)與激活。具有調(diào)控胰島β細(xì)胞的功能，從而通過調(diào)節(jié)等靶基因來調(diào)控β細(xì)胞的功能和生長。Haque等[22]也證明了DNA結(jié)合位點發(fā)生突變可能會導(dǎo)致啟動子活性下調(diào)干擾其表達(dá)，并破壞轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，從而影響其下游靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙進(jìn)而發(fā)展為糖尿病。這些研究進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了基因正常表達(dá)的重要性，本課題組也將完成后續(xù)功能實驗進(jìn)行驗證。

綜上所述，本研究探討了c.493T>C位點突變對HNF1α蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明c.493T>C變異能明顯影響的表達(dá)，提示該變異可能是導(dǎo)致青少年起病的成人型糖尿病發(fā)生的原因，為后續(xù)深入研究MODY3的分子機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

[1] McDonald TJ, Colclough K, Brown R, Shields B, Shepherd M, Bingley P, Williams A, Hattersley AT, Ellard S. Islet autoantibodies can discriminate maturity-onset diabetes of the young (MODY) from type 1 diabetes.,2011, 28(9): 1028–1033.

[2] Hattersley AT, Greeley SAW, Polak M, Rubio-Cabezas O, Nj?lstad PR, Mlynarski W, Castano L, Carlsson A, Raile K, Chi DV, Ellard S, Craig ME. ISPAD clinical practice consensus guidelines 2018: the diagnosis and management of monogenic diabetes in children and adolescents.,2018, : 47–63.

[3] Bonnefond A, Unnikrishnan R, Doria A, Vaxillaire M, Kulkarni RN, Mohan V, Trischitta V, Froguel P. Monogenic diabetes.,2023, 9(1): 12.

[4] Miyachi Y, Miyazawa T, Ogawa Y. HNF1A mutations and beta cell dysfunction in diabetes.,2022, 23(6): 3222.

[5] Shih DQ, Screenan S, Munoz KN, Philipson L, Pontoglio M, Yaniv M, Polonsky KS, Stoffel M. Loss of HNF-1α function in mice leads to abnormal expression of genes involved in pancreatic islet development and metabolism.,2001, 50(11): 2472–2480.

[6] ?ubuk H, Yal??n ?apan ?. A review of functional characterization of single amino acid change mutations in HNF transcription factors in MODY pathogenesis.,2021, 40(3): 348–360.

[7] Wang XJ, Wang T, Yu M, Zhang HB, Ping F, Zhang Q, Xu JP, Feng K, Xiao XH. Screening of HNF1A and HNF4A mutation and clinical phenotype analysis in a large cohort of Chinese patients with maturity-onset diabetes of the young.,2019, 56(3): 281–288.

[8] Tattersall RB. Mild familial diabetes with dominant inheritance., 1974, 43(170):339–357.

[9] Sapra A, Bhandari P. Diabetes. StatPearls. Treasure island (FL): StatPearls Publishing, 2023.

[10] Gillespie KM. Type 1 diabetes: pathogenesis and prevention.,2006, 175(2): 165–170.

[11] Eizirik DL, Pasquali L, Cnop M. Pancreatic β-cells in type 1 and type 2 diabetes mellitus: different pathways to failure.,2020, 16(7): 349–362.

[12] Tosur M, Philipson LH. Precision diabetes: lessons learned from maturity-onset diabetes of the young (MODY).,2022, 13(9): 1465–1471.

[13] Aarthy R, Aston-Mourney K, Mikocka-Walus A, Radha V, Amutha A, Anjana RM, Unnikrishnan R, Mohan V. Clinical features, complications and treatment of rarer forms of maturity-onset diabetes of the young (MODY) - a review.,2021, 35(1): 107640.

[14] Ge SH, Yang MG, Cui YY, Wu J, Xu LS, Dong JJ, Liao L. The clinical characteristics and gene mutations of maturity-onset diabetes of the yung type 5 in sixty-one patients.,2022, 13: 911526.

[15] Firdous P, Nissar K, Ali S, Ganai BA, Shabir U, Hassan T, Masoodi SR. Genetic testing of maturity-onset diabetes of the young current status and future perspectives.,2018, 9: 253.

[16] Kind L, Raasakka A, Molnes J, Aukrust I, Bj?rkhaug L, Nj?lstad PR, Kursula P, Arnesen T. Structural and biophysical characterization of transcription factor HNF-1A as a tool to study MODY3 diabetes variants.,2022, 298(4): 101803.

[17] Li LM, Jiang BG, Sun LL. HNF1A:from monogenic diabetes to type 2 diabetes and gestational diabetes mellitus.,2022, 13: 829565.

[18] Vaxillaire M, Abderrahmani A, Boutin P, Bailleul B, Froguel P, Yaniv M, Pontoglio M. Anatomy of a homeoprotein revealed by the analysis of human MODY3 mutations.,1999, 274(50): 35639–35646.

[19] Sneha P, Kumar DT, Doss CGP, Siva R, Hatem Z, Chandra V. Determining the role of missense mutations in the pou domain of HNF1A that reduce the DNA-binding affinity: a computational approach.,2017, 12(4): e0174953.

[20] Malikova J, Kaci A, Dusatkova P, Aukrust I, Torsvik J, Vesela K, Kankova PD, Nj?lstad PR, Pruhova S, Bj?rkhaug L. Functional analyses of HNF1A-MODY variants refine the interpretation of identified sequence variants.,2020, 105(4): dgaa051.

[21] Haliyur R, Tong X, Sanyoura M, Shrestha S, Lindner J, Saunders DC, Aramandla R, Poffenberger G, Redick SD, Bottino R, Prasad N, Levy SE, Blind RD, Harlan DM, Philipson LH, Stein RW, Brissova M, Powers AC. Human islets expressing HNF1A variant have defective β cell transcriptional regulatory networks.,2019, 129(1): 246–251.

[22] Haque E, Teeli AS, Winiarczyk D, Taguchi M, Sakuraba S, Kono H, Leszczyński P, Pierzcha?a M, Taniguchi H. HNF1A pou domain mutations found in Japanese liver cancer patients cause downregulation of HNF4A promoter activity with possible disruption in transcription networks.,2022, 13(3): 413.

Effect of mutation at c.493T>C locus of transcription factorgene on its protein level

Shujie Liang4, Yihua Peng2, Jiahong Lei3, Aimin Jia3, Hong Jiang3, Yan Cai1,3,4,5

Hepatocyte nuclear factor 1α (HNF1α) is a transcription factor that is crucial for the regulation to maintain the function of pancreatic β-cell, hepatic lipid metabolism, and other processes. Mature-onset diabetes of the young type 3 is a monogenic form of diabetes caused bymutations. Although several mutation sites have been reported, the specific mechanisms remain unclear, such hot-spot mutation as the P291fsinsC mutation and the P112L mutation and so on. In preliminary studies, we discovered one MODY3 patient carrying a mutation at the c.493T>C locus of thegene. In this study, we analyzed the pathogenic of the mutation sites by using the Mutation Surveyor software and constructed the eukaryotic expression plasmids of the wild-type and mutant type ofto detect variations in the expression levels and stability of HNF1α protein by using Western blot. The analyses of the Mutation Surveyor software showed that the c.493T>C site mutation may be pathogenic gene and the results of Western blot showed that both the amount and stability of HNF1α protein expressed by the mutation type plasmid were reduced significantly compared to those by the wild type plasmid (<0.05). This study suggests that thec.493T>C (p.Trp165Arg) mutation dramatically impacts HNF1α expression, which might be responsible for the development of the disease and offers fresh perspectives for the following in-depth exploration of MODY3's molecular pathogenic process.

maturity onset diabetes of young; hepatocyte nuclear factor 1α; mutation

2023-11-07;

2024-01-12;

2024-01-18

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院第一批臨床研究課題(編號：2021LC009)和川北醫(yī)學(xué)院博士啟動基金項目(自然科學(xué)類)(編號：CBY22-QDA28)資助[Supported by the First Batch of Clinical Research Topics of the Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College (No. 2021LC009), and the PhD Launch Fund of North Sichuan Medical College (Natural Science) (No. CBY22-QDA28)]

梁淑杰，碩士研究生，專業(yè)方向：基因突變功能研究。E-mail: liangsj16@163.com

蔡燕，主任技師，研究方向：基因突變功能研究。E-mail:caiyandd@163.com

10.16288/j.yczz.23-274

(責(zé)任編委: 孟卓賢)