初毅　代寧　曹艷杰

摘要 目的：探討苦豆堿對(duì)脂多糖（LPS）致心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響。方法：將大鼠心肌H9c2細(xì)胞分為NC組（不作任何處理）、LPS組、LPS＋苦豆堿低劑量組、LPS＋苦豆堿中劑量組、LPS＋苦豆堿高劑量組、LPS＋miR－NC組、LPS＋miR－210組、LPS＋苦豆堿中劑量組＋anti－miR－NC組、LPS＋苦豆堿中劑量組＋anti－miR－210組。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒－8（CCK－8）、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)情況；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)白細(xì)胞介素－1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）水平；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）檢測(cè)miR－210表達(dá)水平。結(jié)果：不同濃度苦豆堿處理后，LPS處理的心肌細(xì)胞活性及Ki－67、Bcl－2、miR－210蛋白表達(dá)水平增加，細(xì)胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達(dá)水平降低，IL－1β、TNF－α水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。過(guò)表達(dá)miR－210后LPS處理的心肌細(xì)胞活性、Ki－67、Bcl－2表達(dá)水平增加，細(xì)胞凋亡率及p21、Bax表達(dá)水平降低，IL－1β、TNF－α水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干擾miR－210表達(dá)能逆轉(zhuǎn)苦豆堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞增殖、凋亡及炎性因子的影響。結(jié)論：苦豆堿可通過(guò)上調(diào)miR－210抑制LPS致心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞 苦豆堿；miR－210；脂多糖；心肌細(xì)胞凋亡；炎性因子；白細(xì)胞介素－1β；腫瘤壞死因子－α；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.01.009

心血管疾病為臨床高發(fā)病，嚴(yán)重威脅著人民的身體健康，常見(jiàn)的心血管疾病有心律失常、心肌缺血、心肌梗死等，近年來(lái)中醫(yī)藥在治療心血管疾病方面表現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，療效確切，安全性較好［1］。心肌損傷與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng)在心肌損傷的發(fā)生中起重要作用［2－3］。苦豆堿是從豆科植物苦豆草的種子及地上部分提取的一種生物堿，具有抗菌、抗炎、抗心律失常和心肌保護(hù)等作用［4］?？喽箟A可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚［5］?？喽箟A可通過(guò)激活磷脂酰肌醇3－激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路抗心肌細(xì)胞缺血再灌注引起的損傷及炎癥應(yīng)答［6］；對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓具有保護(hù)作用［7］；可抑制氧化型低密度脂蛋白（ox－LDL）誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮功能障礙和炎癥反應(yīng)［8］。以上研究均表明苦豆堿具有抗損傷及抗炎作用。但苦豆堿對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制尚不清楚。miR－210是相關(guān)miRNA的一種，對(duì)心肌細(xì)胞凋亡和改善心臟功能具有重要作用；miR－210有望成為預(yù)測(cè)或診斷心血管疾病的標(biāo)志物［9］。miR－210抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和自噬［10］，miR－210過(guò)表達(dá)可通過(guò)促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖和血管生成，促進(jìn)心肌梗死后的心臟修復(fù)［11］。因此，本研究旨在探討苦豆堿是否通過(guò)調(diào)控miR－210影響LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠心肌H9c2細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)ATCC；LPS購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司；DMEM購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；苦豆堿購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒－8（CCK－8）試劑盒、凋亡試劑盒購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司；熒光定量試劑盒購(gòu)于上海經(jīng)科化學(xué)公司；白細(xì)胞介素－1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)于南京森貝伽生物公司。

1.2 細(xì)胞處理與分組

H9c2細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞，將其隨機(jī)分為NC組（不做任何處理）、LPS組（加入0.5 μg/mL的LPS）、LPS＋苦豆堿低劑量組（加入0.5 μg/mL的LPS和20 mg/L苦豆堿）、LPS＋苦豆堿中劑量組（加入0.5 μg/mL的LPS和50 mg/L苦豆堿）、LPS＋苦豆堿高劑量組（加入0.5 μg/mL的LPS和100 mg/L苦豆堿）、LPS＋miR－NC組（轉(zhuǎn)染miR－NC＋0.5 μg/mL的LPS）、LPS＋miR－210組（轉(zhuǎn)染miR－210＋0.5 μg/mL的LPS）、LPS＋苦豆堿中劑量組＋anti－miR－NC組（轉(zhuǎn)染anti－miR－NC＋0.5 μg/mL的LPS＋和50 mg/L苦豆堿）、LPS＋苦豆堿中劑量組＋anti－miR－210組（轉(zhuǎn)染anti－miR－210＋0.5 μg/mL的LPS＋和50 mg/L苦豆堿）。miR－NC、miR－210、anti－miR－NC、anti－miR－210轉(zhuǎn)染的具體步驟：取50 μL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋miR－NC、miR－210、anti－miR－NC、anti－miR－210的質(zhì)粒，混勻；同時(shí)取50 μL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染試劑，混勻后室溫靜置5 min，將上述兩種溶液混合，室溫靜置20 min，然后將其與培養(yǎng)至80%融合度的細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)染6 h后進(jìn)行藥物處理。

1.3 CCK－8檢測(cè)細(xì)胞增殖

取培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，加10 μL的CCK－8試劑，孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處OD值。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，預(yù)冷后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗，加入V－異硫氰酸熒光素（Annexin V－FITC）10 μL，再加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）5 μL，避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

提取總蛋白，BCA試劑盒定量；行電泳后聚偏二氟乙烯（PVDF）轉(zhuǎn)膜，接著封閉在5%脫脂奶粉中，加一抗4 ℃孵育過(guò)夜；加二抗室溫孵育90 min，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）發(fā)光液顯影，成像后檢測(cè)蛋白條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)水平等于目的條帶和β－actin條帶灰度值的比值。

1.6 ELISA檢測(cè)IL－1β、TNF－α水平

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，按照IL－1β、TNF－α試劑盒說(shuō)明操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中IL－1β、TNF－α水平。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－qPCR）檢測(cè)miR－210表達(dá)水平

提取各組H9c2細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行RT－qPCR，以U6為內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)量用2－△△Ct法計(jì)算。miR－210正向引物：5′－ATGCCTGTGCGTGTGA－3′，反向引物：5′－GTGCGTGTCGTGGAGTC－3′。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度苦豆堿對(duì)LPS誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞增殖、凋亡的影響

與NC組比較，LPS組細(xì)胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與LPS組比較，不同濃度苦豆堿組細(xì)胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖1、表1、圖2。

2.2 不同濃度苦豆堿對(duì)LPS誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞炎性因子的影響

與NC組比較，LPS組IL－1β、TNF－α水平升高（P＜0.05）；與LPS組比較，不同濃度苦豆堿組IL－1β、TNF－α水平降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

2.3 不同濃度苦豆堿對(duì)LPS誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞miR－210表達(dá)的影響

與NC組比較，LPS組H9c2細(xì)胞中miR－210表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與LPS組比較，不同濃度苦豆堿組H9c2細(xì)胞中miR－210表達(dá)水平升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

2.4 過(guò)表達(dá)miR－210對(duì)LPS誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與LPS＋miR－NC組比較，LPS＋miR－210組miR－210表達(dá)水平、細(xì)胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。詳見(jiàn)表4、圖3、圖4。

2.5 過(guò)表達(dá)miR－210對(duì)LPS誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞炎性因子的影響

與LPS＋miR－NC組比較，LPS＋miR－210組IL－1β、TNF－α水平降低（P＜0.001）。詳見(jiàn)表5。

2.6 干擾miR－210表達(dá)能逆轉(zhuǎn)苦豆堿對(duì)LPS誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞增殖、凋亡及炎性因子的影響

與LPS＋苦豆堿中劑量＋anti－miR－NC組比較，LPS＋苦豆堿中劑量＋anti－miR－210組miR－210表達(dá)水平、細(xì)胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達(dá)水平升高，IL－1β、TNF－α水平升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖5、圖6、表6。

3 討 論心肌細(xì)胞凋亡與多種心血管疾病有關(guān)，而許多心血管疾病都伴隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)生，抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)對(duì)防治心血管疾病具有重要意義。最近的研究顯示，中醫(yī)藥治療可抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)［12－13］。有研究報(bào)道，苦豆堿對(duì)海馬神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用［14］?？喽箟A可抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕冠狀動(dòng)脈微栓塞引起的心肌損傷［15］；可通過(guò)調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子－κB（NF－κB）信號(hào)通路，降低炎性因子TNF－α及IL－1β水平，從而改善哮喘小鼠肺功能，減輕哮喘癥狀及炎癥反應(yīng)［16］；可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)來(lái)抑制人肺血管平滑肌細(xì)胞增殖［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度苦豆堿處理LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞后，心肌細(xì)胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達(dá)水平降低，IL－1β、TNF－α水平降低，提示苦豆堿可減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

研究報(bào)道，miR－210可以抑制氧葡萄糖剝奪/再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［18］。miR－210可減輕心肌梗死后心臟細(xì)胞凋亡［19］。本研究結(jié)果顯示，不同濃度苦豆堿處理LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中，增加miR－210表達(dá)水平；過(guò)表達(dá)miR－210增加LPS處理的心肌細(xì)胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表達(dá)水平，降低細(xì)胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達(dá)水平，降低IL－1β、TNF－α水平。表明過(guò)表達(dá)miR－210抑制了LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，與以往研究結(jié)果相符，miR－210具有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。還有研究報(bào)道m(xù)iR－210具有抗炎作用，如miR－210－3p可通過(guò)抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子2（IGF2）減輕動(dòng)脈粥樣硬化中的炎癥反應(yīng)［20］。紫草素可能通過(guò)上調(diào)miR－210減輕LPS誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞（HK－2）炎性損傷［21］。此外，本研究結(jié)果顯示，干擾miR－210表達(dá)逆轉(zhuǎn)苦豆堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞增殖、凋亡及炎性因子的影響。綜上所述，苦豆堿可通過(guò)增加miR－210抑制LPS致心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

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（收稿日期：2022－09－23）

（本文編輯郭懷?。?/p>

引用信息 初毅，代寧，曹艷杰.苦豆堿通過(guò)調(diào)控miR－210對(duì)脂多糖致心肌細(xì)胞凋亡及炎性因子表達(dá)的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（1）：51－55.