段 凱，李紅嬋，汪聰勇，徐美芳*

（1.河南省鼎元種牛育種有限公司，河南鄭州 450046；2.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南鄭州 450008）

人工授精技術(shù)在畜牧業(yè)發(fā)展中有著至關(guān)重要的作用，特別是在牛的繁殖育種中更為重要，牛的精液能夠長期冷凍保存，并在牛的繁育生產(chǎn)中得到大規(guī)模的應(yīng)用與推廣。自20 世紀(jì)60 年代開始，牛的普通冷凍精液在肉牛和奶牛的人工授精中得到了廣泛應(yīng)用，而且世界各國很快也相繼采用液氮作為保存牛常規(guī)冷凍精液的冷源。借助于精液冷凍保存技術(shù)，能有效地延長精液的可利用時(shí)間并通過精液運(yùn)輸實(shí)現(xiàn)異地輸精，從而大幅度提高種公牛的利用效率，減少種公牛養(yǎng)殖量。然而，在牛的繁殖生產(chǎn)的實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，牛常規(guī)冷凍精液解凍后在室溫中保存，輸精時(shí)間越晚，與配母牛的受胎效果越差，這與解凍后精液品質(zhì)的變化有關(guān)。頂體完整率、精子畸形率及精子活力是評價(jià)精液品質(zhì)的主要指標(biāo)。頂體異常包括頂體形態(tài)異常和頂體脫落。頂體正常的牛精子主要特征是有明顯的頂脊，頂體部分呈均勻一致的紫紅色，核環(huán)部分呈規(guī)則的月牙形，頂體輕微膨脹。頂體部分脫落和完全脫落意為頂體脫離精子，露出被頂體覆蓋的細(xì)胞核。頂體異常會導(dǎo)致頂體酶受到破壞，嚴(yán)重影響受精效果。

本研究通過探討牛常規(guī)冷凍精液解凍后的頂體完整率、精子畸形率和精子活力的變化，揭示解凍后不同時(shí)間內(nèi)精液品質(zhì)的變化規(guī)律，為牛冷凍精液解凍后質(zhì)量水平的評定和人工授精的最佳時(shí)間提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選取河南某種公牛站41118268 號種公牛生產(chǎn)的同一批次300 劑常規(guī)冷凍精液，進(jìn)行精液品質(zhì)測定。

1.2 試驗(yàn)儀器、設(shè)備、藥品及試劑

恒溫電熱水浴鍋（上海力辰儀器科技有限公司)、相差顯微鏡（奧林巴斯北京銷售服務(wù)有限公司)、血球計(jì)數(shù)器、載玻片、蓋玻片、密度儀（米尼圖生物技術(shù)（北京) 有限公司)、5.0mL 試管、吉姆薩染液（西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)、香柏油、3.0%氯化鈉溶液。

1.3 測定方法

對每劑冷凍精液進(jìn)行解凍稀釋，在剛解凍0h和解凍1、3、6、9h，均制作1 壓片標(biāo)本、1 抹片標(biāo)本，觀察并記錄精子的活力、密度、畸形率、頂體完整率以及前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)。

1.3.1 牛冷凍精液的解凍

解凍時(shí)迅速用鑷子夾住細(xì)管，直接投入37℃溫水中晃動10s，取出后再用手搓動7～8s 并擦干，剪去封口端，把精液注入到準(zhǔn)備好的干凈、干燥、無菌的5.0mL 試管中，用溫度計(jì)測定解凍后的溫度。

1.3.2 精子活力檢查

取解凍好的細(xì)管凍精剪去封口端推入小玻璃管中混勻，取10μL 滴在37℃恒溫板上的載玻片上，蓋上蓋玻片后于37℃恒溫臺的顯微鏡下放大400 倍觀測活力和密度。精子的活力即前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)占總精子數(shù)的百分率。

1.3.3 精子畸形率檢查

剛解凍后在載玻片上滴1 滴精液制成抹片，干燥后用固定液固定30min，然后用吉姆薩染液染色1.5h 后鏡檢計(jì)算畸形率。

1.3.4 精子頂體完整率檢查

用測過畸形率的抹片，上面滴1 滴香柏油，用油鏡頭進(jìn)行觀察，計(jì)算出頂體完整率和異常率。

1.3.5 前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)檢查

精液解凍后用血色素管準(zhǔn)確吸取10μL，注入盛有0.99mL 3.0%氯化鈉溶液的試管內(nèi)，混勻，使之成為100 倍稀釋的稀釋精液，將備好的血球計(jì)數(shù)板用血蓋片將計(jì)數(shù)室蓋好，用移液器吸取8μ L 稀釋精液于血蓋片邊緣，使精液自行流入計(jì)數(shù)室，均勻充滿。靜置約5min 后在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 及SAS 9.4 進(jìn)行整理、分析，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 解凍后不同時(shí)間內(nèi)的頂體完整率、精子畸形率和精子活力

由表1 可知，與剛解凍時(shí)相比，解凍后1h精子頂體完整率下降，但差異不顯著（P＞0.05)，解凍后3h、6h、9h 的精子頂體完整率顯著低于剛解凍時(shí)和解凍后1h（P＜0.05)。精子畸形率在精液解凍后隨著時(shí)間延長而逐漸升高，剛解凍時(shí)與解凍后1h 差異不顯著（P＞0.05)，但顯著低于解凍后3h、6h（P＜0.05)，且解凍后3h 的精子畸形率也顯著低于解凍后6h 的畸形率（P＜0.05)。精子活力在精液解凍后隨著時(shí)間延長而逐漸降低，剛解凍時(shí)的精子活力最高，與解凍后1h、3h、6h、9h 差異顯著（P＜0.05)，解凍后1h精子活力顯著高于6h（P＜0.05)，解凍后9h 時(shí)精子活力低于任何一個(gè)階段的活力，且差異顯著（P＜0.05)。

表1 種公牛精液不同解凍時(shí)間品質(zhì)分析

2.2 解凍后的前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)

解凍后300 次測定結(jié)果顯示每劑精液的前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)都在0.9×107～1.2×107個(gè)/劑，平均每劑細(xì)管凍精前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)為1.0×107個(gè)。

3 討論

3.1 各精液品質(zhì)變化規(guī)律

精子畸形包括頭部畸形和尾部畸形，頭部畸形的主要是頭大，頭小，長形頭，梨形頭，頭部突起等，尾部畸形的有中段線粒體膨脹、盡心端彎折、線粒體脫落、有原生質(zhì)滴等，還有尾部彎曲、斷尾、無尾等。還有的精子發(fā)育不健全，尾和頭連在一起，尾未能完全伸開。本研究精液中精子畸形率在剛解凍時(shí)平均值已達(dá)到31%，而用于輸精的精液要求畸形率不得高于20%。這可能與精液自身品質(zhì)有關(guān)，也可能是在進(jìn)行冷凍保存時(shí)，精子已受到損傷。

有效精子數(shù)即呈直線前進(jìn)運(yùn)動的精子數(shù)，計(jì)算方法為精子總數(shù)乘以精子活率。牛每劑量冷凍精液前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)是評價(jià)凍精產(chǎn)品質(zhì)量的一項(xiàng)關(guān)鍵性指標(biāo)，該項(xiàng)指標(biāo)不僅與受胎率有關(guān)系，還關(guān)系到優(yōu)秀種公牛冷凍精液的產(chǎn)量及種公牛遺傳資源的利用率。根據(jù)《牛冷凍精液》（GB4143—2022) 規(guī)定前向運(yùn)動精子數(shù)大于等于600 萬個(gè)/劑。目前國內(nèi)對降低單劑量前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)也進(jìn)行了初步的研究。李連起等[11]研究表明，當(dāng)每劑量前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)降低到500 萬時(shí)，不影響其人工授精后的情期受胎率，可以廣泛推廣應(yīng)用。雖然李慧穎等[12]認(rèn)為牛細(xì)管凍精前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)不應(yīng)低于800 萬，但張壯志等[13]研究表明當(dāng)每劑量前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)降低到600 萬時(shí)，不影響其人工授精后的情期受胎率。王彥平[14,15]研究結(jié)果表明當(dāng)每劑量中前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)降低到200 萬時(shí)，不影響青年牛人工授精后的情期受胎率。本試驗(yàn)測得的前進(jìn)運(yùn)動精子總數(shù)平均值為1.0×107個(gè)/劑，達(dá)到了國標(biāo)的要求但是相比而言，我國種公牛平均年單產(chǎn)較發(fā)達(dá)國家種公牛冷凍精液生產(chǎn)水平差距甚遠(yuǎn)，難以滿足遺傳改良的整體需要，種公牛的遺傳潛力尚未得到充分的發(fā)掘與利用。為了在今后的牛改良工作中更大限度地利用優(yōu)良種畜的遺傳資源，促進(jìn)畜群良種化，使優(yōu)良種公牛的冷凍精液發(fā)揮更大的作用，在不影響受胎率的情況下，可以嘗試降低凍精每劑量的前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)，以提高優(yōu)秀種公牛的凍精產(chǎn)量，并保證理想的配種受胎率。

4 結(jié)論

剛解凍時(shí)頂體完整率、精子畸形率與解凍后1h 差異大，剛解凍時(shí)的精子活力最高。人工授精時(shí)，剛解凍精液與解凍1 小時(shí)內(nèi)精液的頂體完整率較好、精子畸形率較低，此時(shí)輸精效果為佳。