劉偉強(qiáng)，秦斗文，史國民，徐庭亮，巨秀婷*

（1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院， 青海 西寧 810016； 2.青海省園林植物與觀賞園藝重點(diǎn)實(shí)驗室/青海大學(xué)高原花卉研究中心， 青海 西寧 810016）

伊犁郁金香（Tulipa iliensisRegel）屬于我國野生的郁金香種質(zhì)資源之一，生境以山前平原和低山坡地居多，主要分布在我國新疆地區(qū)的部分草場，面積達(dá)數(shù)十萬畝［1］，此外在中亞地區(qū)也有分布［2］。伊犁郁金香是百合科郁金香屬的多年生草本植物，外花被片背面綠紫紅色或黃綠色，內(nèi)花被片黃色［3］，花期3 ～ 5 月，具有良好的觀賞、飼用等價值，被評價為優(yōu)良性狀突出的野生郁金香之一［4］，良好的生態(tài)適應(yīng)性也為其優(yōu)良性狀的開發(fā)提供更多可能。前人基于伊犁郁金香已開展了種子萌發(fā)特性［5-6］、引種栽培［7-8］、遺傳多樣性［9］等多方面的研究。

葉綠體是地球上植物細(xì)胞內(nèi)光合作用的主要場所，也是可以獨(dú)立遺傳復(fù)制的重要細(xì)胞器［10］。植物葉綠體基因組的數(shù)目、順序相對保守且具有相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，所含遺傳信息豐富［11］，常被用于群體進(jìn)化、種質(zhì)資源鑒定及群體遺傳學(xué)研究，在植物的進(jìn)化過程中具有十分重要的作用［12］。在大多數(shù)植物漫長的進(jìn)化過程中，密碼子獨(dú)特的使用方式和使用偏好性會逐步形成，即使是同種植物的不同基因之間，密碼子的偏好也會存在一定的差異。如酸棗［Ziziphus jujubavar.spinosa（Bunge） Hu ex H. F.Chow］葉綠體基因組密碼子使用偏性的影響因素中，來自外界的選擇壓力起主要作用［13］；而金銀花大毛花（Lonicera japonicaThunb.）［14］、無刺龍舌蘭（Yucca treculeanaCarrière）［15］在選擇壓力和突變的共同作用下出現(xiàn)使用偏性。通過對葉綠體基因組中的密碼子選擇行為的分析，可以幫助研究者更好地認(rèn)識葉綠體中的功能基因的表達(dá)規(guī)律和進(jìn)化方式，進(jìn)而加深對植物進(jìn)化關(guān)系的認(rèn)識［16］。

為更準(zhǔn)確地將野生種質(zhì)資源的優(yōu)良園藝性狀應(yīng)用到郁金香的分子輔助育種過程中［17］，葉綠體工程育種作為一種新型技術(shù)為植物導(dǎo)入外源基因提供新的途徑。根據(jù)最優(yōu)密碼子來設(shè)計外源基因表達(dá)載體，可以起到優(yōu)化外源基因在葉綠體基因組中表達(dá)的作用［18］，為郁金香分子育種提供優(yōu)良的遺傳基因奠定基礎(chǔ)。本研究通過對伊犁郁金香葉綠體基因組的密碼子組成、偏性特征及影響因素、最優(yōu)密碼子進(jìn)行分析，為野生郁金香資源開發(fā)、優(yōu)良性狀的遺傳改良、外源基因表達(dá)及葉綠體工程育種等提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

從課題組前期測序得到的伊犁郁金香葉綠體基因組（NCBI 登錄號：MT316023）中根據(jù)各基因的注釋結(jié)果，剔除了序列長度小于300 bp、重復(fù)基因和內(nèi)部存在終止密碼子的序列，獲得53條可以編碼蛋白的基因序列（Coding DNA sequence，CDS）用于密碼子各項參數(shù)分析。

1.2 分析方法

1.2.1 密碼子偏好性相關(guān)參數(shù)分析

利用CodonW1.4.2 軟件分析伊犁郁金香葉綠體基因組篩選到的53 條序列的密碼子的偏好性參數(shù)，得到各CDS 的有效密碼子（Effective number of codon， ENC）、相對同義密碼子的相對使用度（Relative synonymous codon usage， RSCU）。通過EMBOSS：cusp 在線工具（http：//emboss.toulouse.inra.fr/cgi-bin/emboss/cusp）計算出伊犁郁金香葉綠體基因組不同基因的GC總含量（GCall）以及各密碼子第1位（GC1）、第2 位（GC2）、第3 位（GC3）的GC 含量［19］。利用SPSS 22.0 對以上各參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2.2 密碼子堿基組成的差異性分析

中性繪圖分析以GC3為橫坐標(biāo)，GC12（GC1和GC2的均值）為縱坐標(biāo)，利用R 語言繪制散點(diǎn)圖，完成GC3與GC12相關(guān)性分析［20］。

1.2.3 堿基組成對密碼子偏好性影響分析

GC3和ENC 值分別作橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖進(jìn)行ENC-plot 分析，通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線［21］，結(jié)合散點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的距離，判斷伊犁郁金香密碼子偏好性的主要影響因素。若散點(diǎn)距標(biāo)準(zhǔn)曲線較近說明受突變影響，反之則受自然選擇的影響。為了能夠精確散點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的距離，根據(jù)公式ENC 比值［（預(yù)期ENC 值-實(shí)際ENC 值）/預(yù)期ENC 值］計算ENC 比值頻率，對密碼子偏好性的影響因素進(jìn)行精確分析。

1.2.4 堿基奇偶偏好分析

計算密碼子第3 位上的A、T、C、G 的含量，以A3/（A3+ T3）為縱坐標(biāo)，G3/（G3+ C3）為橫坐標(biāo)進(jìn)行PR2-plot分析，以無偏倚的點(diǎn)為中心點(diǎn)繪制散點(diǎn)圖。根據(jù)圖中散點(diǎn)分布的位置判斷第3位堿基的偏倚方向來分析密碼子偏好性的影響因素［22］。

1.2.5 最優(yōu)密碼子確定

對53 條伊犁郁金香的CDS 序列進(jìn)行ENC 值排序，從高低兩端各選出10%的基因，構(gòu)建高低表達(dá)庫篩選高表達(dá)密碼子。利用高表達(dá)RSCU和低表達(dá)RSCU 的差值，計算ΔRSCU。將ΔRSCU ≥ 0.08 的密碼子定為高表達(dá)優(yōu)越密碼子，RSCU值 > 1的密碼子定為高頻密碼子，同時滿足高頻率密碼子和高表達(dá)優(yōu)越密碼子確定為最優(yōu)密碼子［23］。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子偏好性相關(guān)參數(shù)分析

根據(jù)伊犁郁金香葉綠體基因組密碼子組成分析和ENC 值計算（表1），發(fā)現(xiàn)不同基因的GC含量有差異。GC1、GC2、GC3的平均含量分別為46.66%、39.39% 和27.15%，總體的GC 含量GCall為37.73%，其中GC3的平均含量最低，說明GC3偏好以A/U 結(jié)尾。為明確伊犁郁金香葉綠體基因組密碼子使用偏性程度，根據(jù)53 條CDS 序列的ENC 值的范圍，發(fā)現(xiàn)ycf3基因的ENC 值最大為62.28，rps18基因的ENC 值最小為38.33，表明不同基因密碼子的偏性程度具有差異。ENC 值的理論取值范圍為20 ～ 61，當(dāng)ENC 值越接近20 說明其偏性越強(qiáng)，ENC 值越接近61 則越弱［24］，一般以ENC 值35 作為區(qū)分密碼子使用偏好性強(qiáng)弱的標(biāo)志［25］。伊犁郁金香葉綠體基因組中所有基因的ENC 值均分布于38.33 ～ 62.28 之間，大于標(biāo)準(zhǔn)值35，表明伊犁郁金香葉綠體基因組的密碼子使用偏好性較弱。

表1 伊犁郁金香葉綠體基因組GC含量以及ENC值Tab. 1 The GC content and ENC value of chloroplast genome of T. iliensis

對伊犁郁金香葉綠體基因組的GC1、GC2、GC3、GCall及ENC 值進(jìn)行相關(guān)性分析（表2），發(fā)現(xiàn)GCall與GC1、GC2和GC3之間均呈極顯著正相關(guān)（P< 0.01），GC1和GC2呈極顯著正相關(guān)（P< 0.01），而GC3與GC2無顯著相關(guān)性（P> 0.05），說明密碼子第1 位和第2 位的堿基組成具有一定的相似性，但是與第3位有差異。ENC 與GC1、GC2相關(guān)性不顯著（P>0.05），但與GC3的相關(guān)性系數(shù)為0.539，達(dá)到極顯著相關(guān)水平（P< 0.01），說明GC3會影響密碼子的使用偏性。

表2 伊犁郁金香葉綠體基因組各相關(guān)參數(shù)的相關(guān)性分析Tab. 2 Correlation analysis of parameters related to each gene in the chloroplast genome of T. iliensis

對伊犁郁金香葉綠體基因組的RSCU進(jìn)行分析（表3），發(fā)現(xiàn)53個序列中RSCU > 1的密碼子共有31個，其中16 個以U 結(jié)尾，13 個以A 結(jié)尾，1 個以G 結(jié)尾，1 個以C 結(jié)尾，表明伊犁郁金香葉綠體基因組密碼子更趨向于A/U結(jié)尾。

表3 伊犁郁金香葉綠體基因組相對同義密碼子使用度Tab. 3 Relative synonymous codon usage of chloroplast genome of T. iliensis

2.2 密碼子堿基組成的差異性分析

中性繪圖分析是通過分析不同的堿基組成來判斷密碼子偏好性的主要影響因素，主要通過GC12和GC3的相關(guān)程度進(jìn)行評價。若GC12和GC3相關(guān)性顯著，則突變?yōu)槠眯缘闹饕绊懸蛩?，若相關(guān)性不顯著，則選擇壓力為其偏好性的主要影響因素［26］。根據(jù)伊犁郁金香密碼子的中性繪圖分析（圖1），圖中每一個散點(diǎn)代表一個基因，GC3的取值范圍在0.19 ～ 0.36之間，GC12的取值范圍在0.30 ～ 0.55之間，并得到GC12與GC3的相關(guān)系數(shù)為0.309，回歸系數(shù)為0.417。表明GC1、GC2、GC3的堿基組成之間存在差異，相關(guān)性并不顯著。因此，自然選擇是影響其偏好性的主要因素。

圖1 中性繪圖分析Fig. 1 Analysis of neutrality plot

2.3 堿基組成對密碼子偏好性影響分析

ENC-plot 分析（圖2）結(jié)果表明，伊犁郁金香葉綠體基因組的部分基因圍繞標(biāo)準(zhǔn)曲線周圍分布，大部分基因分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方且離標(biāo)準(zhǔn)曲線的距離較遠(yuǎn)，說明伊犁郁金香葉綠體基因組密碼子的偏好性主要受到自然選擇的影響。

圖2 ENC-plot分析Fig.2 Analysis of ENC-plot

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算發(fā)現(xiàn)，部分基因距標(biāo)準(zhǔn)曲線較近，實(shí)際ENC 值與預(yù)期ENC 值接近，部分基因位于標(biāo)準(zhǔn)曲線下方較遠(yuǎn)位置，實(shí)際ENC 值與預(yù)期ENC值存在一定的偏距。ENC比值頻數(shù)表（表4）可以更直觀的比較實(shí)際ENC 值與預(yù)期ENC 值的差異，發(fā)現(xiàn)ENC 比值為-0.05 ～ 0.05 的有23 個，占比為43%；分布在-0.05 ～ 0.05以外的基因有30個，占比為57%，大部分基因離預(yù)期ENC 值較遠(yuǎn)，表明自然選擇是伊犁郁金香葉綠體基因組密碼子偏好性的主要影響因素。

表4 ENC比值頻數(shù)分布Tab. 4 Distribution of ENC ration

2.4 堿基奇偶偏好分析

PR2-plot 分析主要根據(jù)第3 位堿基的偏倚方向來分析密碼子偏好性的影響因素。在PR2-plot 分析中（圖3），觀察各散點(diǎn)的分布發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因位于右下方，說明嘧啶T 的使用頻率大于嘌呤A 的使用頻率，嘌呤G的使用頻率大于嘧啶C的使用頻率。PR2-plot分析表明伊犁郁金香葉綠體基因組密碼子使用偏好性不僅受突變的影響，同時也受到自然選擇的影響。

圖3 PR2-plot分析Fig. 3 Analysis of PR2-plot

2.5 最優(yōu)密碼子分析

結(jié)合伊犁郁金香葉綠體基因組的RSCU（表3），以RSCU 值 > 1 為標(biāo)準(zhǔn)篩選到高頻密碼子共31 個，并從構(gòu)建的高低表達(dá)庫中以ΔRSCU ≥ 0.08 為標(biāo)準(zhǔn)篩選到高表達(dá)密碼子共22個（表5）。根據(jù)最優(yōu)密碼子的選擇標(biāo)準(zhǔn)（同時滿足高頻率密碼子和高表達(dá)優(yōu)越密碼子）確定18 個最優(yōu)密碼子，分別為GCU、CGA、CGU、UGU、CAA、GAA、GGU、AUU、CUA、UUA、AAA、UUU、CCU、AGU、UCU、ACU、GUA 以及GUU，其中以U 結(jié)尾有11 個，以A 結(jié)尾有7 個，說明伊犁郁金香葉綠體基因組偏愛使用以A和U堿基結(jié)尾的密碼子。

表5 伊犁郁金香葉綠體基因組最優(yōu)密碼子分析Tab. 5 Optimal codon analysis of chloroplast genome in T. iliensis

3 討論

3.1 密碼子堿基組成

密碼子是生命信息的基本遺傳單位［27］，編碼同一氨基酸的同義密碼子被使用的頻率各異，而頻繁使用的密碼子決定了其使用偏好模式［28］。本研究得到的伊犁郁金香葉綠體基因組密碼子不同位置的GC含量不同，而GC3含量的多少是生物密碼子堿基組成的重要衡量指標(biāo)［29］。通過對伊犁郁金香葉綠體基因組篩選出的53 條CDS 序列進(jìn)行密碼子偏好性分析，得到GC3的含量為27.15%，說明伊犁郁金香偏向使用A/U 類型的密碼子，在向日葵（Helianthus annuusL.）［30］、二喬玉蘭（Yulania soulangeanaSoul.-Bod.）［31］等物種研究中也得到類似的結(jié)論。

3.2 影響密碼子偏性因素

堿基突變、自然選擇、密碼子各位置堿基含量、tRNA 豐度和基因序列長度等多種因素都被認(rèn)為會對密碼子的使用模式產(chǎn)生影響［32］。根據(jù)中性繪圖分析、ENC-plot 分析的結(jié)果判斷伊犁郁金香葉綠體基因組密碼子偏好性的主要影響因素，發(fā)現(xiàn)使用頻率為T > A、G > C，說明影響密碼子偏好性的主要影響因素是自然選擇，這與馬尾松（Pinus massonianaLamb.）［33］、苦蕎［Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn.］［34］、辣椒（Capsicum annuumL.）［35］等密碼子偏好性的影響因素一致。但是根據(jù)PR2-plot 分析的結(jié)果認(rèn)為突變也是伊犁郁金香葉綠體基因組密碼子偏好性的影響因素之一，而密碼子偏好的選擇也會受多重因素的影響，如香花油茶（Camellia osmanthaYe CX， Ma JL et Ye H.）［36］的相關(guān)研究中同樣認(rèn)為突變和自然選擇共同影響著密碼子的偏好選擇模式。

3.3 最優(yōu)密碼子

功能基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)均受到密碼子的影響，選擇最優(yōu)密碼子可在構(gòu)建基因表達(dá)載體時有效提高基因的表達(dá)效率［37］。在本研究中通過構(gòu)建高低基因表達(dá)庫，共篩選到18 個最優(yōu)密碼子，此前有研究表明葉綠體基因中最優(yōu)密碼子的數(shù)量因物種不同而異。29 種木蘭科（Magnoliaceae）［38］植物的葉綠體基因最優(yōu)密碼子數(shù)在14 ～ 22之間，7種睡蓮屬（NymphaeaL.）［39］植物研究中最優(yōu)密碼子介于14 ～ 17 個；而在秋茄（Kandelia obovataSheue et al.）［40］的研究中僅確定了3 個最優(yōu)密碼子；西藏凹乳芹（Vicatia thibeticade Boiss.）［41］的最優(yōu)密碼子數(shù)量為4個。以上研究結(jié)果再次證實(shí)了同義密碼子使用偏好特性是在多種因素共同影響下形成的。對伊犁郁金香葉綠體基因組使用模式的研究可為后續(xù)野生郁金香資源開發(fā)、優(yōu)良性狀的遺傳改良、外源基因表達(dá)及葉綠體工程育種等提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。