喻本霞，瞿顯友，江維克

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.重慶市中藥研究院 中藥資源學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400065）

雞蛋參是桔?？疲–ampanulaceae）黨參屬（CodonopsisWall.）植物雞蛋參（Codonopsis convolvulaceaKurz）的干燥塊莖，藏藥名為“尼哇”。味甘、微苦、澀，性微涼，具有生津清熱、補(bǔ)養(yǎng)氣血、健脾的功效，可以用于治療感冒，咳嗽，扁桃體炎，胸痛，食欲不振等［1-3］。雞蛋參及其變種分布于西藏南部、四川西部、云南、貴州等地，野生資源為主。在藏區(qū)以及云南等民族地區(qū)使用，民間常與雞肉或豬肉燉食，制成補(bǔ)肺藥膳、養(yǎng)心藥膳以及產(chǎn)后體虛藥膳，用于病后、產(chǎn)后體虛、肺結(jié)核、心悸等［4-5］。雞蛋參主要含糖類和少量生物堿、植物甾醇、苷類等化學(xué)成分［6-11］。近年來，多糖因其來源廣泛和安全性，在食品和醫(yī)藥行業(yè)中成為研究熱點(diǎn)，其多種生物活性比如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、保肝、抗腫瘤、抗高脂血癥、改善記憶、抗衰老已得到證實(shí)［12-15］。雞蛋參多糖含量較高，具有較高開發(fā)利用價(jià)值。

植物多糖因其理化性質(zhì)可采用水提醇沉法進(jìn)行提取，此法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，且能夠擴(kuò)大化生產(chǎn)，研究發(fā)現(xiàn)不同提取工藝所得多糖無論從量上還是質(zhì)上都存在一定差異［16］，多糖要進(jìn)行深入研究就需先明確提取工藝。本研究采用水提醇沉法對(duì)雞蛋參多糖進(jìn)行提取，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，然后再進(jìn)一步探究最優(yōu)工藝條件下獲得的雞蛋參多糖的抗氧化活性［17］，以期為雞蛋參開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 試驗(yàn)儀器

UV-2600 紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；Infinite M200 PRO 酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司）；AB204-S 高精度電子分析天平（梅特勒-托利多貿(mào)易（上海）有限公司）；KB-900 智能脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）等。

1.2 試劑與試驗(yàn)藥材

無水乙醇、丙酮、乙醚、濃硫酸購(gòu)自重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司，維生素C、葡萄糖、PBS 緩沖液購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，2，2′-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）、硫酸亞鐵、苯酚購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、雙氧水（3%）購(gòu)自金克?。ū本┥锛夹g(shù)有限公司，純水為實(shí)驗(yàn)室自制。雞蛋參藥材購(gòu)自四川瀘定，經(jīng)重慶市中藥研究院瞿顯友主任中藥師鑒定為雞蛋參。

2 方法

2.1 多糖的制備

2.1.1 藥材脫脂處理

新鮮的雞蛋參塊莖切成薄片，在60℃下烘干，粉碎，過50 目篩，得雞蛋參藥材粗粉，加入10 倍量95%乙醇，密封后磁力攪拌浸泡過夜。次日先用紗布過濾收集粗粉，再減壓過濾收集細(xì)粉，粗細(xì)粉混勻后于40℃下低溫烘干，得經(jīng)脫脂處理的雞蛋參藥材粗粉，備用。

2.1.2 多糖的提取

稱取0.20 g經(jīng)脫脂處理的雞蛋參藥材粗粉于具塞錐形瓶中，經(jīng)熱水浸提后，在5 000 r/min下對(duì)提取液進(jìn)行離心5 min，重復(fù)離心2 次，在65℃下對(duì)上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，直至濃縮液與原藥材質(zhì)量比為2 mL/g，快速攪拌下緩慢加入4倍量無水乙醇，密封，5℃冷藏過夜，倒去上清液，沉淀用乙醇、乙醚、丙酮洗滌，各重復(fù)2 次，反復(fù)以離心的方式進(jìn)行分離，于40℃下低溫烘干，得雞蛋參多糖。

2.2 多糖的含量測(cè)定

2.2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

將葡萄糖對(duì)照品烘干至恒重，取出，置干燥器內(nèi)放冷。稱取上述葡萄糖20 mg 于100 mL 容量瓶中，加入純水充分溶解后定容，得葡萄糖對(duì)照溶液。分別吸取上述對(duì)照溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于具塞試管內(nèi)，加入純水至1.0 mL，加入1.0 mL 新鮮配置的4.5%苯酚溶液混勻后，快速加入5.0 mL 濃硫酸，混勻，加塞，在100℃下水浴20 min，取出，冰水浴5 min，超聲30 s，測(cè)定在485 nm 處吸光度。以純水代替葡萄糖對(duì)照溶液為空白對(duì)照。

2.2.2 待測(cè)溶液制備

按照2.1.2項(xiàng)下進(jìn)行提取，精密吸取適量上清液稀釋一定濃度后，即得待測(cè)溶液。

2.2.3 雞蛋參多糖提取率的計(jì)算

按式（1）計(jì)算雞蛋參多糖提取率：

其中，N為提取液稀釋倍數(shù)；C為檢測(cè)樣品液多糖濃度（mg/mL）；V為提取液的體積（mL）；W為經(jīng)脫脂處理雞蛋參粉末的稱取量（mg）。

2.3 雞蛋參多糖提取條件單因素實(shí)驗(yàn)

精密稱取經(jīng)脫脂處理的雞蛋參粗粉0.20 g，考察條件為提取時(shí)間、液料比、提取溫度，60 min、40 mL/g、90℃設(shè)定為基本試驗(yàn)條件，考察提取時(shí)間30、60、90、120、150 min、液料比20、30、40、50、60 mL/g、提取溫度60、70、80、90、100℃的多糖提取率，每次變動(dòng)一個(gè)條件，研究以上3個(gè)因素對(duì)雞蛋參多糖提取率的影響。按照2.2 項(xiàng)下測(cè)定雞蛋參多糖提取率。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化雞蛋參多糖提取工藝

根據(jù)所報(bào)道的方法［18］，運(yùn)用Design-Expert 13軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。各因素變量范圍根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定，選取提取液料比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）3個(gè)因素作為響應(yīng)變量，以雞蛋參多糖提取率為響應(yīng)值，按照Box-Behnken 原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，各因素及其實(shí)驗(yàn)水平見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平表Tab.1 Variables and levels in the Box-Behnken experimental design

2.5 雞蛋參多糖體外抗氧化活性

2.5.1 測(cè)定雞蛋參多糖對(duì)DPPH 自由基的清除能力

參考紀(jì)旭光等的方法稍作修改［16，19］，稱取8 mg DPPH 于10 mL 容量瓶中，用無水乙醇定容，得2 mmol/L 的DPPH 溶液。稱取雞蛋參多糖40 mg 于10 mL 容量瓶中，用純水定容，得4 mg/mL 的雞蛋參多糖溶液，依次將雞蛋參多糖溶液稀釋為2.00、1.00、0.50、0.25、0.13 mg/mL。將上述不同濃度雞蛋參多糖溶液分別加入100 μL 于96 孔酶標(biāo)板內(nèi)，隨后加入等體積DPPH 溶液，充分混勻后，避光反應(yīng)30 min，測(cè)定反應(yīng)液在517 nm 的吸光值A(chǔ)2。用純水代替多糖溶液作為空白組，其吸光度記為A0；用無水乙醇代替DPPH 溶液作為參照組，其吸光度記為A1。以相同濃度VC 溶液與DPPH 溶液反應(yīng)作陽性對(duì)照。按式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率：

2.5.2 雞蛋參多糖對(duì)ABTS自由基的清除能力

參考李鳳偉等［20］的方法稍作修改，稱取6.62 mg過硫酸鉀和 38.41 mg ABTS 分別置于10 mL 棕色容量瓶中，用純水定容，得到2.45 mmol/L 的過硫酸鉀溶液和7 mmol/L 的ABTS 溶液，2 者等量混勻后在30℃下暗處反應(yīng)12 h 后，用PBS 緩沖液稀釋25 倍，得ABTS 自由基溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。將2.5.1 項(xiàng)下不同濃度雞蛋參多糖溶液分別加入50 μL 于96 孔酶標(biāo)板內(nèi)，隨后加入150 μL ABTS 自由基溶液，混勻，靜置10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)液在734 nm 的吸光值A(chǔ)1。用純水代替多糖溶液，其吸光度記為A0。以相同濃度VC 溶液與ABTS 自由基溶液反應(yīng)作陽性對(duì)照。按式（3）計(jì)算ABTS自由基清除率：

2.5.3 測(cè)定雞蛋參多糖對(duì)羥基自由基的清除能力

參考杭華等［21］的方法稍作修改，稱取15.29 mg硫酸亞鐵、12.43 mg 水楊酸、吸取100 μL 3%雙氧水分別置于10 mL 容量瓶中，硫酸亞鐵和雙氧水用純水定容，水楊酸用無水乙醇定容，得到9 mmoL/L 的硫酸亞鐵溶液、9 mmoL/L 的水楊酸乙醇溶液以及8.8 mmoL/L的雙氧水溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。將2.5.1項(xiàng)下不同濃度雞蛋參多糖溶液分別加入50 μL 于96 孔酶標(biāo)板內(nèi)，隨后加入50 μL 硫酸亞鐵溶液和50 μL水楊酸乙醇溶液，搖床上振搖反應(yīng)10 min，隨后加入50 μL 雙氧水溶液，于37℃下反應(yīng)30 min，測(cè)定反應(yīng)液在510 nm 的吸光值A(chǔ)2。用純水代替多糖溶液作為空白組，其吸光度記為A0；用純水代替雙氧水溶液作為參照組，其吸光度記為A1。以相同濃度VC溶液代替多糖溶液反應(yīng)作陽性對(duì)照。按式（4）計(jì)算羥基自由基清除率：

2.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 9.0.2 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。差異顯著性分析、回歸分析以及響應(yīng)曲面圖繪制均采用Design-Expert 13軟件進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

3.1 多糖的制備

經(jīng)過水提醇沉后可得到雞蛋參多糖，該多糖為淺黃色粉末，質(zhì)地蓬松，流動(dòng)性好，無甜味，無氣味。

3.2 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y= 9.860 6X- 0.004 3（R2= 0.999 7 ）。

3.3 雞蛋參多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

提取溫度為90℃、液料比為40 mL/g條件下，多糖提取率隨著時(shí)間的增加而增加，分別在60 min 和150 min 出現(xiàn)兩次顯著上升，考慮時(shí)間成本，本次響應(yīng)面設(shè)計(jì)0 水平確定為60 min。提取時(shí)間為60 min、液料比為40 mL/g 條件下，多糖提取率隨著提取溫度升高提取率整體上呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，雖在70、80℃略有回調(diào)，但與60℃并無顯著性差異。為了避免高溫對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的破壞，本次響應(yīng)面設(shè)計(jì)0水平確定為60℃。提取時(shí)間為60 min、提取溫度為90℃條件下，多糖提取率隨著液料比的增加整體上呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能因?yàn)槎嗵潜晃揭?。本次響?yīng)面設(shè)計(jì)0水平確定為20 mL/g。

3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化

3.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

雞蛋參多糖提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2，該設(shè)計(jì)方案共設(shè)計(jì)了17 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，其中析因點(diǎn)12 個(gè)，0 水平5 次重復(fù)。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Tab.2 Box-Behnken design matrix and experimental values

3.4.2 雞蛋參多糖提取工藝回歸模型的建立及方差分析

利用 Design-Expert 13 軟件對(duì)表2 中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到雞蛋參多糖提取率對(duì)提取液料比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）3 個(gè)因素的回歸方程為：雞蛋參多糖提取率 = 50.29 + 1.47A +2.84B + 2.15C + 0.310 5AB - 0.178 9AC + 0.611 6BC -1.89A2- 0.863 2B2- 3.2C2，方差分析結(jié)果見表3。由表3 可以看出：模型F值為28.22，P值為0.000 1，P< 0.05，表明模型是顯著的；模型的失擬項(xiàng)P= 0.333 8，P> 0.1，表明失擬不顯著，即該模型是穩(wěn)定的，能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際雞蛋參多糖提取情況。相關(guān)系數(shù)R2為0.973 2，數(shù)值接近1，表明模型可信度良好。擬合模型的調(diào)整R2為0.938 7 和預(yù)測(cè)R2為0.750 2，差異值小于0.2，說明該模型預(yù)測(cè)情況與實(shí)際情況相一致。變異系數(shù)為1.81，該系數(shù)數(shù)值偏低，表明實(shí)驗(yàn)值的精度高，可靠性強(qiáng)。因此，該模型對(duì)試驗(yàn)的擬合較好，可以預(yù)測(cè)雞蛋參多糖不同提取條件下的評(píng)價(jià)指標(biāo)。模型一次項(xiàng)A、B、C以及二次項(xiàng)A2、C2差異均極顯著（P< 0.01），表明3 個(gè)因素對(duì)雞蛋參多糖提取過程具有重要影響，二次項(xiàng)A2、C2對(duì)結(jié)果也有顯著影響，而交互作用系數(shù)均大于0.05，表明交互作用對(duì)最終結(jié)果的影響作用較弱。

表3 Box-Behnken回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis of Box-Behnken response surface regression model

3.4.3 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，3個(gè)因素之間交互作用對(duì)雞蛋參多糖提取率的影響如圖1所示?？筛鶕?jù)響應(yīng)面圖坡度陡峭程度、等高線密集度以及等高線形狀判斷因素間交互作用的影響程度，3 個(gè)因素之間的交互作用響應(yīng)面圖有一定坡度，但等高線分布較稀疏，等高線形狀接近圓形，表明各因素間交互作用對(duì)雞蛋參多糖提取率的影響均不顯著，這與方差分析結(jié)果相一致。利用Design-Expert 13 軟件進(jìn)行最佳條件預(yù)測(cè)，可得出雞蛋參多糖最佳提取工藝參數(shù)，液料比為24.50 mL/g，提取時(shí)間為88.79 min，提取溫度為62.66℃，多糖提取率為53.11%。為了便于實(shí)際操作，將雞蛋參多糖提取工藝微調(diào)為液料比25 mL/g，提取時(shí)間為90 min，提取溫度為63℃。在此提取工藝參數(shù)下，重復(fù)5 次提取雞蛋參多糖，最終得多糖提取率為（52.43 ± 1.61）%，與預(yù)測(cè)值接近，表明用響應(yīng)面來優(yōu)化雞蛋參多糖的提取工藝條件可行。

圖1 因素間交互作用對(duì)雞蛋參多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plot of the interaction between factors on extraction rate of CCP

3.5 雞蛋參多糖體外抗氧化活性

雞蛋參多糖體外抗氧化活性結(jié)果見圖2 ~ 4，其對(duì)DPPH 自由基、ABTS 自由基和羥基自由基均具有一定的清除能力，清除ABTS 自由基和羥基自由基的效果較好，DPPH 自由基較弱。在質(zhì)量濃度范圍0.13 ~ 4 mg/mL 內(nèi)，雞蛋參多糖溶液對(duì)3 者自由基的清除能力呈現(xiàn)非線性依賴性，濃度為4 mg/mL時(shí)，羥基自由基清除率為（54.89 ± 2.26）%，ABTS 自由基清除率為（54.37 ± 0.42）%，DPPH 自由基清除率為（38.13 ± 2.56）%，表明雞蛋參多糖具有一定抗氧化活性。

圖2 雞蛋參多糖對(duì)羥基自由基的清除曲線Fig.2 Hydroxyl radical scavenging curve of CCP

圖3 雞蛋參多糖對(duì)ABTS自由基的清除曲線Fig.3 ABTS radical scavenging curve of CCP

圖4 雞蛋參多糖對(duì)DPPH自由基的清除曲線Fig.4 DPPH radical scavenging curve of CCP

4 討論

雞蛋參為桔梗科黨參屬多年生草本植物，塊莖具有補(bǔ)養(yǎng)氣血、健脾、生津清熱的功效，主要分布在我國(guó)西南部。雞蛋參是一種常用的藏藥，《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥分冊(cè)》和《青海省藏藥炮制規(guī)范（2010年版）》均有收錄，其藏藥名為“尼哇”，藏成藥“十味龍膽花顆?！焙汀笆洱埬懟z囊”組方中均含有雞蛋參。雞蛋參野生資源并不豐富，甚至多次被列為瀕危藏藥材，為了保障雞蛋參藥材資源的供給，目前關(guān)于雞蛋參的研究多集中在人工繁育技術(shù)方面，而關(guān)于雞蛋參多糖提取及其活性的研究較少，本文對(duì)雞蛋參多糖的提取及抗氧化活性開展了研究。

多糖的提取有多種方法，如超聲、微波等，雖然這些方法各具特點(diǎn)，但熱水提取法作為一種傳統(tǒng)方法，具有易于擴(kuò)大生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，然而熱水提取法存在提取率較低的缺陷。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雞蛋參多糖含量高，即使采用熱水浸提法多糖的提取率仍然較高，因此本文選擇傳統(tǒng)的熱水浸提法作為提取雞蛋參多糖的方法。不同的提取工藝所得到的多糖，其結(jié)構(gòu)及活性都存在一定差異，因此有必要開展多糖提取工藝考察，確保得到穩(wěn)定的多糖。本文在單因素的基礎(chǔ)上綜合成本、穩(wěn)定性等實(shí)際情況，采用響應(yīng)面優(yōu)化雞蛋參多糖水提工藝，確定最佳提取條件為：提取時(shí)間90 min，提取溫度為63℃，液料比25 mL/g，在此條件下雞蛋參多糖提取率達(dá)到52.43%。雞蛋參多糖的制備需由水提液經(jīng)過離心、濃縮、醇沉、洗滌而得，在這些制備過程中難免多糖損失，本研究以水提液中多糖提取率為指標(biāo)考察提取工藝，避免了制備過程中因多糖損失而引起的誤差。經(jīng)優(yōu)選出的提取工藝所提取的雞蛋參多糖對(duì)自由基具有一定清除能力，表明其具有一定抗氧化活性，且抗氧化作用隨著濃度的增大而增強(qiáng)。雞蛋參多糖含量高、制備簡(jiǎn)單且具有一定活性，值得進(jìn)一步開發(fā)利用。