胡 昕，李廣濤，高宏旗

（上海林清軒生物科技有限公司，上海 201400）

山茶屬（CamelliaL.）是山茶科（Theaceae）中最大的屬，包含20 組，共280 種，我國有238 種［1］。其中有一組為紅山茶組（Sect.Camellia），全世界有57種，而我國擁有55種，其余2種在日本［2］。紅山茶組植物不僅具有重要的經(jīng)濟、藥用、觀賞價值，在化妝品行業(yè)也具有一定的應(yīng)用價值。目前，在化妝品行業(yè)，對油茶組［3-4］和茶組［5-6］的研究較多，但對紅山茶組的研究并未很多。例如，愛茉莉公司研究了紅山茶（Camellia japonicaL.）花的抗氧化能力［7］，并考察了從山茶籽餅中提取的山奈酚三糖和四糖的抑制MMP-1 的作用［8］，且進一步得到山奈酚四糖可以通過抑制PDK1（3-phosphoinositide-dependent kinase 1）減少細胞衰老，同時可促進膠原纖維的增加［9］。還有學(xué)者研究了紅山茶葉中抗氧化物質(zhì)的抗光老化作用［10］。紅山茶花提取物還可以對城市空氣污染物激活的皮膚老化機制具有保護作用［11］。

與化妝品最相關(guān)的人體器官為皮膚。從重量和范圍的角度，皮膚是人體最大的器官，像傳感器一樣促使人體對外界變化做出反應(yīng)［12］。隨著年齡的增長，皮膚主要受到外源性因素（紫外線［13］、空氣污染［14］、溫度［15］等）和內(nèi)源性因素（遺傳或激素等）的影響，逐漸衰老，主要表現(xiàn)為皺紋的產(chǎn)生、色素的沉著或變得松垮等［16］。而與皺紋最相關(guān)的為皮膚真皮層的細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM），它可以賦予皮膚強度和彈性，假如ECM 的機械結(jié)構(gòu)破壞，意味著皮膚不再具有充足的彈性和支撐，從外形上體現(xiàn)為皺紋產(chǎn)生、皮膚松弛、缺少緊致與彈性等［17］。在分子或細胞層面，過多的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）會引發(fā)一系列細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而產(chǎn)生更多的炎癥因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs），從而導(dǎo)致ECM的降解［18-19］。因此，抗氧化成為大家較為關(guān)注的功效評價。除此之外，抗糖化也逐漸受到大家的青睞。糖基化是還原糖（如葡萄糖）與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸之間的非酶促反應(yīng)，其最終產(chǎn)物即晚期糖終末產(chǎn)物（Advanced glycation end products，AGEs）。一方面，AGEs 會導(dǎo)致色素沉著，主要體現(xiàn)為與蛋白質(zhì)形成色素加合物［20］或影響黑色素的分泌量［21］。另一方面，AGEs會導(dǎo)致皮膚皺紋的出現(xiàn)，主要原因為：（1）AGEs 與ECM 中的蛋白質(zhì)形成交聯(lián)，降低結(jié)締組織通透性，使皮膚組織硬度增加，皮膚彈性下降，導(dǎo)致皺紋產(chǎn)生［22］；（2）AGEs會與晚期糖基化終產(chǎn)物受體結(jié)合，導(dǎo)致ROS大量產(chǎn)生，最終導(dǎo)致皮膚衰老［23］。因此抗氧化、抗糖化都可以進一步抗皺，進而達到抗老的效果。

近年來，紅山茶越來越多應(yīng)用在化妝品領(lǐng)域中，但是對紅山茶的研究結(jié)果還不是很多。因此本文對紅山茶花、葉提取液的抗老功效進行了多種體外功效測試分析，主要從抗皺、抗氧化和抗糖化的角度闡述了其抗老的功效，為其在化妝品的應(yīng)用提供了一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：野生型 AB 品系斑馬魚（杭州環(huán)特生物科技股份有限公司）、人永生化角質(zhì)形成細胞（北京頤唯實檢測技術(shù)有限公司）、成纖維細胞（陜西博溪通用檢測科技有限公司）、離體皮膚組織培養(yǎng)液（FSK4，陜西博溪通用檢測科技有限公司）、MMP-1 ELISA 試劑盒（Abcam）、MMP-3 ELISA 試劑盒（Abcam）、稀釋熒光探針DCFH-DA、SOD 試劑盒（S0103，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、PBS（武漢博士德生物工程有限公司）、多聚甲醛（中國醫(yī)藥集團有限公司）、甲基乙二醛（MGO，Sigma）、熒光染料（Takara）、氨基胍硫酸鹽（AM，Sigma）、TGF-β1（Peprotech）

儀器：Accuri C6-流式細胞儀（Becton Dickinson）、CFX-96-熒光定量 PCR 儀（Bio-Rad）、UVA 照射儀（陜西博溪通用檢測科技有限公司）、150i-CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher）、SW-CJ-1F-超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、BX53-正置顯微鏡（Olympus）.

1.2 實驗方法

1.2.1 紅山茶花、葉提取液的制備

在室溫下用30%的乙醇水溶液超聲萃取干燥之后的紅山茶花、葉（上海柒潭生物科技有限公司提供）（m紅山茶花∶ m紅山茶葉= 2 ∶ 1）30 min，料液比（重量）為1 ∶ 20，隨后加熱到60℃，震蕩萃取2 h，然后將萃取液用AB-8 大孔樹脂吸附，用70%乙醇溶液洗脫；之后真空濃縮，獲得濃縮液；在濃縮液中加入水和1，3-丙二醇，使得總質(zhì)量為山茶花、葉總質(zhì)量的15倍，最終得到紅山茶花、葉提取液。

1.2.2 抗皺能力檢測

1.2.2.1 基于斑馬魚的抗皺功效測試

實驗步驟為：（1）隨機選取斑馬魚于6 孔板中，每孔30 尾。（2）水溶給予樣品，同時設(shè)置正常對照組，每孔容量為3 mL，3次生物學(xué)重復(fù)。（3）28℃條件下避光孵育24 h。（4）提取各實驗組斑馬魚總RNA，合成cDNA，利用q-PCR 檢測β-actin 和col1a1b的基因表達。（5）用β-actin作為基因表達的內(nèi)參，計算目的基因的RNA 相對表達量。計算方法如以下公式：

1.2.2.2 基于成纖維細胞的抗皺功效測試

基于成纖維細胞的MTT 法檢測實驗步驟為：（1）細胞接種：接種細胞至96孔板，培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中孵育過夜。（2）分組及配液：設(shè)置空白組、陰性對照組、陽性對照組和樣品組。其中，陰性對照組為30 J/cm2UVA輻照，陽性對照組為100 ng/mL -TGFB1溶液，樣品組為紅山茶花、葉提取液。按表1配制不同濃度的紅山茶花、葉提取液。每個濃度梯度下設(shè)置3個重復(fù)孔。（3）給藥：待 96 孔板中細胞鋪板率達到 40% ~ 60%時進行給藥。給藥完成后放置在培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中培養(yǎng) 24 h。（4）檢測：細胞孵育培養(yǎng)24 h后，棄掉上清，加入MTT工作液（0.5 mg/mL），37℃避光孵育4 h，孵育結(jié)束后，棄掉上清，每孔加 150 μL DMSO，在 490 nm 處讀取OD 值。（5）細胞相對活力計算：根據(jù)公式4計算。

表1 樣品測試濃度表Tab. 1 Test concentrations of sample

基于成纖維細胞的MMP-1 和MMP-3 測試 實驗步驟為：（1）細胞接種：接種成纖維細胞至 24 孔板，培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中孵育過夜。（2）配液：按分組分別配制受試物工作液。（3）給藥：待細胞鋪板率達到 40% ~ 60%時，進行分組給藥。給藥完成后放置在培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中培養(yǎng) 24 h。（4）UVA輻照：根據(jù)試驗分組，對需要 UVA 照射的組別進行 30 J/cm2的 UVA 輻照，置于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。（5）收樣：培養(yǎng) 24 h 后，收集細胞培養(yǎng)上清液于離心管中，置于-80℃冰箱冷凍保存。（6）ELISA 檢測：MMP-1、MMP-3 ELISA 試劑盒的操作說明書進行檢測。

1.2.3 抗氧化能力檢測

1.2.3.1 基于角質(zhì)形成細胞的MTT法檢測

實驗步驟為：（1）細胞接種：接種密度接種細胞至96 孔板，培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中孵育過夜。（2）分組及配液：實驗設(shè)置空白組、溶劑對照組和樣品組。按表2 配制不同濃度的紅山茶花、葉提取液，每個濃度梯度下設(shè)置3 個重復(fù)孔。（3）給藥：細胞培養(yǎng)24 h 后進行給藥。給藥完成后放置在培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中培養(yǎng)。（4）檢測：細胞孵育培養(yǎng)20 h 后，加入MTT 工作液（5 mg/mL），37℃避光孵育4 h，孵育結(jié)束后，每孔加100 μL 三聯(lián)液，在培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中孵育過夜。在570 nm，參考波長630 nm 條件下測吸光度。細胞相對活力計算請參考公式4。

表2 樣品測試濃度表Tab. 2 Test concentrations of sample

1.2.3.2 基于角質(zhì)形成細胞的ROS測定

實驗步驟為：（1）種板：將細胞消化，計數(shù)，置于孔板內(nèi)。（2）置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，使細胞貼壁，棄上清液，空白組每孔加入2 mL培養(yǎng)基，對照組和樣品組每孔加入2 mL 0.003%的H2O2。（3）加完H2O26 h 后，吸出六孔板中的培養(yǎng)液，空白組、對照組每孔加入2 mL 培養(yǎng)基，樣品組每孔加入2 mL 終濃度為1.875%的樣品，繼續(xù)培養(yǎng)18 h。（4）用培養(yǎng)基（無血清）稀釋熒光探針DCFH-DA（2′，7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯），使終濃度為10 μmol/L；吸出上清液，每孔加入2 mL 終濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA。（5）將六孔板置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清培養(yǎng)液洗滌3 次。（6）用熒光顯微鏡觀察，然后用胰酶消化收集細胞24℃ 1000 r/min，離心5 min，調(diào)節(jié)細胞濃度，用流式細胞儀定量檢測。

1.2.3.3 基于角質(zhì)形成細胞的SOD測定

前3 個步驟見1.2.2.2 前3 個步驟，之后棄上清液，胰酶消化，24℃ 1000 r/min，離心5 min，調(diào)節(jié)細胞濃度，按照超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）試劑盒說明書操作，用流式細胞儀定量檢測。

1.2.4 基于離體皮膚的抗糖化能力測試

本實驗采用免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）檢測離體皮膚組織中表皮層和真皮層中AGEs 含量的變化，評價紅山茶花、葉提取液的抗糖化作用。

實驗步驟為：（1）Ex vivo處理：獲取去除皮下脂肪組織，將組織在液氮和 37℃水浴鍋中反復(fù)凍融 5次，然后將皮膚組織置入 6 孔板中。用磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffered saline， PBS）沖洗 3 遍，放入 75% 乙醇中浸泡 5 min，然后再用含有雙抗的PBS 沖洗 3 遍。（2）培養(yǎng)過夜：滅菌后，將皮膚組織切成直徑為 0.6 cm 的小圓片，放入培養(yǎng)模具中，然后放入 6 孔板中，每孔加入 4 mL PBS 緩沖液，將孔板轉(zhuǎn)移至 45℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h。（3）給藥：孵育 24 h 后，給藥處理，空白對照和陰性對照都不進行給藥處理，陰性對照組將培養(yǎng)液更換為糖化反應(yīng)液（0.5 mM MGO 的 PBS 緩沖液），陽性對照組給藥 3 mM 的氨基胍硫酸鹽，將培養(yǎng)液更換為糖化反應(yīng)液，樣品組表面涂抹樣品，添加量為 1.5 μL，同時將培養(yǎng)液更換為糖化反應(yīng)液。（4）UVA 輻照：給藥結(jié)束后進行10 J/cm2UVA 的照射。（5）糖化反應(yīng)：輻照結(jié)束后，將孔板轉(zhuǎn)移至 45℃恒溫培養(yǎng)箱進行糖化反應(yīng) 72 h。（6）72 h 之后，重復(fù)步驟（3）至步驟（5）。（7）UVA 輻照進行 3 次，第 4 次之后，只進行給藥和更換糖化反應(yīng)液，不再進行 UVA 的照射處理，共計持續(xù) 21 天。（8）糖化反應(yīng)結(jié)束后，將離體皮組織轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 離心管中，用 4%多聚甲醛固定，進行包埋、切片、AGEs 免疫組化染色，顯微鏡下采集圖片。

1.2.5 結(jié)果統(tǒng)計分析

應(yīng)用Excel 2016 作圖，結(jié)果表示為Mean ± SD。各組間比較采用t-test 統(tǒng)計分析。統(tǒng)計分析均為雙尾。P< 0.05 認為具有顯著差異，P< 0.01 認為具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅山茶花、葉提取液的抗皺能力

斑馬魚中col1a1b基因表達量，如圖1 所示。從圖1 中可以得出，使用0.25% 紅山茶花、葉提取液的斑馬魚的col1a1b基因相對表達量為1.22，與正常對照組相比顯著增加，表明紅山茶花、葉提取液能促進I型膠原蛋白的表達。

圖1 紅山茶花、葉提取液對斑馬魚 col1a1b 基因相對表達量的影響Fig.1 Effect of C. japonica flower and leaf extract on the relative expression of col1a1b gene in Brachydanio rerio

在成纖維細胞上開展細胞毒性檢測試驗，細胞存活率隨著紅山茶花、葉提取液濃度的大小變化如圖2 所示，可以得到，在0.625%范圍內(nèi)的紅山茶花、葉提取液并未體現(xiàn)出明顯的細胞毒性。基于此，選取0.5% 紅山茶花、葉提取液，測試其對成纖維細胞中MMP-1 和MMP-3 含量的影響，結(jié)果如圖3 和圖4。從圖3 中可以看出，與陰性對照組相比，0.5%的紅山茶花、葉提取液可以明顯抑制MMP-1 的表達，并經(jīng)過計算得到抑制率為14.34%。從圖4中可以看出，與陰性對照組相比，0.5%的紅山茶花、葉提取液也可顯著性抑制MMP-3 的表達，抑制率為14.78%。

圖2 紅山茶花、葉提取液對成纖維細胞存活率的影響Fig.2 Effects of C. japonica flower and leaf extract on the survival rate of fibroblast

圖4 紅山茶花、葉提取液對MMP-3含量的影響Fig.4 Effects of C. japonica flower and leaf extract on MMP-3 content

因此，綜合紅山茶花、葉提取液對col1a1b基因表達量的促進以及對MMP-1 和MMP-3 表達的抑制，可以得到，紅山茶花、葉提取液可以促進膠原蛋白的表達，且可以抑制膠原蛋白或彈性蛋白等ECM的降解，從而達到抗皺的效果。

2.2 紅山茶花、葉提取液的抗氧化能力

在角質(zhì)形成細胞上開展細胞毒性檢測試驗，細胞存活率隨著紅山茶花、葉提取液濃度的大小變化如圖5所示，可以得到當(dāng)紅山茶花、葉提取液的濃度在0.234% ~ 1.875%范圍內(nèi)，細胞存活率均大于100%，并未體現(xiàn)出明顯的細胞毒性。因此選取1.875%的紅山茶花、葉提取液從對ROS 和SOD 表達的影響評估其抗氧化能力，結(jié)果如圖6 和圖7 所示。與空白組相比，對照組中活性氧ROS和SOD的表達有顯著變化，表明造模成功。從圖6 中可以看出，與對照組相比，紅山茶花、葉提取液可顯著性抑制ROS 的表達，且計算得到抑制率為28.85%；從圖7 中可以看出，與對照組相比，紅山茶花、葉提取液可顯著提升SOD 的表達，且計算得到促進率為25.65%。因此，從細胞層面，紅山茶花、葉提取液具有一定的抗氧化能力。這也與之前對紅山茶的抗氧化研究結(jié)論一致。

圖5 紅山茶花、葉提取液對角質(zhì)形成細胞存活率的影響Fig.5 Effects of C. japonica flower and leaf extract on the survival rate of keratinocytes

圖6 紅山茶花、葉提取液對ROS水平的影響Fig.6 Effects of C.japonica flower and leaf extract on ROS level

圖7 紅山茶花、葉提取液對SOD活性的影響Fig.7 Effects of C. japonica flower and leaf extract on SOD activity

2.3 紅山茶花、葉提取液的抗糖化能力

通過對離體皮膚中AGEs 免疫組化染色，且使用顯微鏡對其進行觀察，如圖8 所示（正文只展示1個復(fù)孔的顯微照片）?？梢悦黠@看出，對比于陰性對照組，涂抹了紅山茶花、葉提取液的離體皮膚中AGEs 的免疫組化強度明顯減弱，且可以分別得到表皮層和真皮層中AGEs 的含量，分別如圖9 和圖10 所示。從圖中可以得知，與陰性對照組相比，紅山茶花、葉提取液對表皮層和真皮層中AGEs 的表達均為抑制，且抑制率分別為12.65%和13.87%。因此，紅山茶花、葉提取液對離體皮膚的表皮層和真皮層均有抗糖化的作用。

圖8 離體皮膚的表皮層和真皮層中AGEs的免疫組化顯微照片F(xiàn)ig.8 Immunohisto chemistry micrographs of AGEs in the epidermis and dermis of ex vivo skin

圖9 紅山茶花、葉提取液對表皮層中AGEs表達的影響Fig.9 Effects of C. japonica flower and leaf extract on the expression of AGEs in the epidermis

圖10 紅山茶花、葉提取液對真皮層中AGEs表達的影響Fig.10 Effects of C. japonica flower and leaf extract on the expression of AGEs in the dermis

3 討論

本研究從抗皺、抗氧化及抗糖化的體外功效測試闡述了紅山茶花、葉提取液的抗老功效。從之前的大量研究中可以得知，紅山茶花、葉中主要含有山茶苷（Camellianoside）［24］、黃酮類、酚類和三萜類［25］等活性成分，因此具有優(yōu)異的生物活性，如抗氧化等，主要體現(xiàn)為對ROS 的抑制以及對DPPH 的清除，還可提升抗氧化酶如SOD 等的活性。因此，本研究的結(jié)論與這些研究結(jié)果一致。

而對于紅山茶組花、葉的抗糖化研究并無太多報道，目前研究集中在茶組或油茶組的抗糖化功效上，如油茶（Camellia oleiferaAbel.）殼［26］，綠茶（Chinese green tea）葉、紅茶（Black tea）葉及烏龍茶（Oolong tea）葉都具有抗糖化的功效［27］。但紅山茶組、茶組及油茶組都屬于山茶屬，因此本研究也驗證了紅山茶組也具有抗糖化的功效。

近年來在化妝品領(lǐng)域，對紅山茶的研究也在逐漸增多，選擇不同種紅山茶的花、葉、籽或籽餅為研究對象，使用不同組學(xué)分析工具分析其DNA序列或活性成分［28］?，F(xiàn)在越來越多的化妝品公司選擇將紅山茶提取物作為原料添加進化妝品中，并進行人體功效測試證明其確實具有優(yōu)異的功效，如抗皺、緊致、抗氧化等。未來也需更深入且準確地分析出紅山茶不同部位（花、葉等）中的活性單體成分，對其進行作用靶點和通路的研究，使其作用機理更為明確，另外，開發(fā)出更高效的提取工藝對其進行富集，最終使其可以更好地應(yīng)用在化妝品行業(yè)中。