范紹斌, 蘇濟鈺, 樊改麗, 阮志平, 張華峰, 胡艷萍, 賈 悅, 梁欣妤, 王宗華, 胡紅莉

(1.福建農(nóng)林大學植物保護學院,福建 福州 350002;2.閩江學院地理與海洋學院,福建 福州 350108; 3.廈門市綠化中心,福建 廈門 361004;4.廈門市園林植物園,福建 廈門 361003)

酒瓶椰子[Hyophorbelagenicaulis(L. H. Bailey) H. E. Moore]是棕櫚科酒瓶椰子屬中一種非常珍貴的觀賞植物,其干形奇特、樹姿秀美、葉姿婆娑,下部的莖干膨大,形狀宛如酒瓶。酒瓶椰子的適應(yīng)性較強,既可作為盆栽裝飾植物,也可作為園林綠化樹種。其原產(chǎn)于熱帶地區(qū),我國臺灣、廣西、海南、廣東和福建等地均進行了引種栽培[1]。隨著其種植規(guī)模逐漸擴大,病害問題日益嚴重,主要包括心腐病、葉枯病等[2]。

近年來,廈門市園林植物園中酒瓶椰子的葉片出現(xiàn)了大量褐色病斑,隨著病情的加重,病斑向外擴張并互相連接,形成不規(guī)則的褐色大病斑,最終導(dǎo)致全葉枯死,嚴重影響了植株的正常生長,降低了其觀賞價值。由于該病害引起的癥狀與前人報道的酒瓶椰子葉枯病的發(fā)病癥狀[2]類似,本研究將該病害歸為酒瓶椰子葉枯病。

有關(guān)酒瓶椰子葉枯病的研究主要集中在其發(fā)病癥狀的描述方面,對造成該病害的病原菌的研究較少。植物病害綜合防治的基礎(chǔ)是查明病因。本研究從廈門市園林植物園內(nèi)采集12份染病的酒瓶椰子葉片樣品,對其病原菌進行分離和純化,并通過形態(tài)特征觀察和基于3個基因(ITS、TUB2和TEF1)的系統(tǒng)發(fā)育分析,對所獲得的病原菌菌株進行鑒定,為酒瓶椰子葉枯病的綠色防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與純化

2017年8月在廈門市園林植物園(24°27′N,118°05′E)內(nèi)采集典型的酒瓶椰子發(fā)病葉片,通過常規(guī)組織分離法分離病原菌菌株[3],隨后將這些菌株保存在裝有馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面培養(yǎng)基(200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂、1 L蒸餾水)的5 mL凍存管中,待菌絲長滿PDA斜面培養(yǎng)基后再將凍存管放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌的形態(tài)鑒定

觀察、記錄菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后的性狀(包括菌落直徑、顏色、質(zhì)地、是否產(chǎn)孢等),在體視顯微鏡(奧林巴斯SZX-16)下觀察子實體形態(tài)特征,在顯微鏡(奧林巴斯BX-53)下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子(大小、顏色、形狀等)的形態(tài)特征。根據(jù)形態(tài)特征,查閱相關(guān)的資料[4]進行初步鑒定。

1.3 病原菌的分子鑒定

參考朱仰艷等[3]的DNA提取、PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測等方法,并根據(jù)實際情況進行調(diào)整。本研究所用的3對引物:真菌核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS為ITS1-F/CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA和ITS4/TCCTCCGCTTATTGATATGC[5-6];微管蛋白TUB2為Bt2a/GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC和Bt2b/ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC[7];轉(zhuǎn)錄延伸因子TEF1為EF1-728F/CATCGAGAAGTTCGAGAAGG 和EF2/GGARGTACCAGTSATCATGTT[8-9]。

將PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,在NCBI數(shù)據(jù)庫中,通過BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對將所得菌株鑒定到屬,選取已發(fā)表文章中相似度和可信度較高的參考序列,以及Hyde et al[10]和Gualberto et al[11]研究中所用的部分序列用于本研究的系統(tǒng)發(fā)育分析。使用PhyloSuite v1.2.1軟件[12]以最大似然法和貝葉斯法構(gòu)建3個基因的聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹,將菌株鑒定到種。用Figtree v.1.4.0軟件(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)對系統(tǒng)發(fā)育樹進行適當調(diào)節(jié)后,再用Adobe Acrobat DC和PowerPoint軟件進行編輯與美化。

1.4 菌株致病性測定

為了確定所獲得的菌株是否為酒瓶椰子葉枯病的病原菌,本研究采用柯赫式法則進行驗證。選取健康的酒瓶椰子葉片,先用清水洗凈葉片表面,并用無菌濾紙擦干表面水分,再用75%(體積分數(shù))酒精對葉片進行消毒,隨后將葉片放入透明培養(yǎng)皿中(皿內(nèi)放2張用水潤濕過的濾紙),用潤濕的棉花包裹葉柄部,保持培養(yǎng)皿內(nèi)濕潤但無積水。然后用無菌的20 μL槍頭在葉片表面輕微造傷,每片葉造傷4處,每處放置一塊直徑為5 mm的菌餅。每個菌株做3組重復(fù)試驗,以接種無菌的PDA培養(yǎng)基作為空白對照。最后將其放入恒溫培養(yǎng)箱(12L∶12D、25 ℃)中進行培養(yǎng),觀察并記錄7 d后的發(fā)病情況。之后取植物組織的病健交界處,再次按組織分離法分離、純化菌株,并對其進行鑒定,與最初分離獲得的菌株進行形態(tài)特征比較和系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的初步鑒定

共采集了12份酒瓶椰子的發(fā)病葉片(圖1),分離、純化得到5個類擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis-like)真菌菌株。類擬盤多毛孢屬真菌包含擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)、新擬盤多毛孢屬(Neopestalotiopsis)和假擬盤多毛孢屬(Pseudopestalotiopsis)[4]。綜合該類真菌特有的形態(tài)特征(分生孢子中間3個細胞的顏色等)[4]和3個基因(ITS、TUB2和TEF1)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的比對結(jié)果,將其中3個菌株(ZL11、ZL14和ZL29)歸為擬盤多毛孢屬,1個菌株(ZL45)歸為新擬盤多毛孢屬,1個菌株(ZL30)歸為假擬盤多毛孢屬。

圖1 酒瓶椰子(A)及其病葉(B)Fig.1 H.lagenicaulis (A) and symptoms of leaf blight (B)

2.2 病原菌的分子鑒定

用最大似然法和貝葉斯法構(gòu)建了3個基因串聯(lián)(ITS+TUB2+TEF1)的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,最大似然樹和貝葉斯樹的拓撲結(jié)構(gòu)是一致的。因此,選擇3個基因的貝葉斯樹(圖2)進行展示。

最大似然支持率≥50%或貝葉斯后驗概率≥0.50顯示在系統(tǒng)發(fā)育樹上;最大似然支持率低于 50%或貝葉斯后驗概率低于 0.50用“*”表示。本研究所分離的菌株用紅色字體標出;標尺表示每個位點的核苷酸替換的預(yù)期數(shù)量。

3個基因DNA序列的總長度為1 304 bp,即ITS為482 bp,TUB2為416 bp,TEF1為406 bp。ITS最適模型為GTR+I,TUB2最適模型為HKY+G,TEF1最適模型為GTR+I+G。系統(tǒng)發(fā)育樹被分為3個支系,分別對應(yīng)Neopestalotiopsis、Pestalotiopsis和Pseudopestalotiopsis。在Neopestalotiopsis分支中, ZL45與N.cubana以99%的支持率和1.00的后驗概率聚在一起。在Pestalotiopsis分支中:ZL29與P.diploclisiae聚類,支持率為81%,而后驗概率小于0.50;ZL11與P.neolitseae聚在一起,支持率為92%,后驗概率為1.00;ZL14為一個單獨的類群,但支持率和后驗概率都很低。在Pseudopestalotiopsis分支中, ZL30與Ps.theae聚類,支持率為91%,后驗概率為1.00。

2.3 病原菌的形態(tài)特征

2.3.1 菌株ZL45 (N.cubanaMaharachch, K.D. Hyde &Crous) 培養(yǎng)性狀:PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長速度較快,培養(yǎng)7 d后,菌落直徑達到8.0 cm;菌落正面顏色雪白,絨毛狀,邊緣較規(guī)則,具有同心輪紋,但不明顯;背面為蜂蜜色(圖3A-3B)。PDA培養(yǎng)基上的子實體為黑色墨汁狀,埋生或半埋生,單獨或聚生(圖3C)。

A-B.PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后的菌落(A為正面,B為反面);C.分生孢子堆;D.分生孢子盤、產(chǎn)孢細胞及未成熟的分生孢子; E-F.分生孢子。單位長度:20 μm。

顯微特征:分生孢子盤上的分生孢子梗不明顯,通常退化為產(chǎn)孢細胞,產(chǎn)孢細胞無色透明、群生,呈保齡球形狀(圖3D);分生孢子5個細胞,梭形,直或稍彎曲,大小為(23.0～27.5) μm×(7.0～8.8) μm;中間3個細胞異色,長度為15.3～18.9 μm,從基部起第2個細胞呈淡褐色,第3個和第4個細胞呈暗褐色;頂端細胞呈圓錐狀、無色透明,長度為3.5～5.0 μm,頂端著生2～4根管狀附屬絲(通常為2或3根),長度為22.5～28.8 μm;基部細胞圓錐形、無色透明,長度為4.4～6.3 μm,基部附屬絲通常有1根,長度為4.9～7.5 μm(圖3E-3F)。

ZL45與N.cubana在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起,支持率和后驗概率都比較高;同時,ZL45的形態(tài)特征與N.cubana[4]比較相似。故將ZL45鑒定為N.cubana。

N.cubana是Maharachchikumbura et al[4]在古巴不知名植物上發(fā)現(xiàn)的種,該種真菌可引起泰國橡膠樹(Heveabrasiliensis)發(fā)生落葉病[13]。本研究首次在我國發(fā)現(xiàn)該種真菌(地理新記錄),同時,酒瓶椰子是該種真菌的新寄主(寄主新記錄)。此外,先前未見酒瓶椰子發(fā)生新擬盤多毛孢屬真菌的報道,這是酒瓶椰子作為新擬盤多毛孢屬真菌寄主的首次報道。

2.3.2 菌株ZL29 (P.diploclisiaeMaharachch, K.D. Hyde &Crous) 培養(yǎng)性狀:PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長速度一般,培養(yǎng)7 d后,菌落直徑達到6.5 cm;菌落正面顏色雪白,絨毛狀,邊緣不規(guī)則,沒有同心輪紋;背面為淡橙色(圖4A-4B)。PDA培養(yǎng)基上的子實體為黑色墨汁狀,埋生或半埋生,單獨或聚生(圖4C)。

A-B.PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后的菌落(A為正面,B為反面);C.分生孢子堆;D.分生孢子盤、產(chǎn)孢細胞及未成熟的分生孢子; E-F.分生孢子。單位長度:20 μm。

顯微特征:分生孢子盤上的分生孢子梗不明顯,通常退化為產(chǎn)孢細胞,產(chǎn)孢細胞無色透明、群生,呈保齡球形狀(圖4D);分生孢子5個細胞,梭形,直或稍彎曲,大小為(23.3～30.0) μm×(5.0～6.6) μm;中間3個細胞同色,均為淺褐色,長度為14.5～18.8 μm;頂端細胞呈圓錐狀、無色透明,長度為4.2～5.0 μm,頂端著生2～4根管狀附屬絲,長度為11.9～20.7 μm;基部細胞圓錐形、無色透明,長度為4.8～6.3 μm,基部附屬絲通常有1根,長度為2.5～5.0 μm(圖4E-4F)。

ZL29與P.diploclisiae在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起,支持率為81%,后驗概率小于0.50;但ZL29的形態(tài)特征與P.diploclisiae[4]總體相似。故將ZL29鑒定為P.diploclisiae。

P.diploclisiae是Maharachchikumbura et al[4]在蒼白秤鉤風(Diploclisiaglaucescens)和假九節(jié)(Psychotriatutcheri)上發(fā)現(xiàn)的種,該種真菌是我國桉樹(Eucalyptusrobusta)的主要內(nèi)生真菌之一[14]。這是酒瓶椰子作為該種真菌寄主的首次報道(寄主新記錄),并且首次提出了該種真菌可以作為病原菌危害植物。

2.3.3 菌株ZL14 (P.humicolaMaharachch, K.D. Hyde &Crous) 培養(yǎng)性狀:PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長速度較快,培養(yǎng)7 d后,菌落直徑達到8.0 cm;菌落正面顏色雪白,絨毛狀,邊緣不規(guī)則,具有同心輪紋;背面為淡黃褐色(圖5A-5B)。PDA培養(yǎng)基上的子實體為黑色墨汁狀,埋生或半埋生,單獨或聚生(圖5C)。

A-B.PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后的菌落(A為正面,B為反面);C.分生孢子堆;D.分生孢子盤、產(chǎn)孢細胞及未成熟的分生孢子; E-F.分生孢子。單位長度:20 μm。

顯微特征:分生孢子盤上的分生孢子梗不明顯,通常退化為產(chǎn)孢細胞,產(chǎn)孢細胞無色透明、群生,呈保齡球形狀(圖5D);分生孢子5個細胞,梭形,直或稍彎曲,大小為(19.8～25.0) μm×(5.0～7.5) μm;中間3個細胞同色,均為淺褐色,長度為12.2～15.1 μm;頂端細胞長度為3.5～5.0 μm,頂端著生1～3根管狀附屬絲,長度為7.7～20.6 μm;基部細胞長度為4.0～5.0 μm,基部附屬絲通常有1根,長度為3.8～6.3 μm(圖5E-5F)。

ZL14在系統(tǒng)發(fā)育樹中為一個獨立的分支,然而支持率小于50%,后驗概率小于0.50;ZL14與P.bicolor、P.diploclisiae、P.dracaenae和P.humicola是姊妹分支。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn), ZL14的形態(tài)特征與P.humicola[4]非常相似,因此,將其鑒定為P.humicola。

P.humicola是Maharachchikumbura et al[4]在我國香港的灰冬青(Ilexcinerea)果實上發(fā)現(xiàn)的種,目前,關(guān)于該種真菌的報道很少。本研究首次報道酒瓶椰子是該種真菌的寄主(寄主新記錄),并且首次提出了該種真菌可以作為病原菌危害植物。

2.3.4 菌株ZL11 (P.neolitseaeH.A. Ariyawansa &K.D. Hyde) 培養(yǎng)性狀:PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長速度較快,培養(yǎng)7 d后,菌落直徑達到8.0 cm;菌落正面顏色雪白,絨毛狀,邊緣較規(guī)則,具有同心輪紋,但不明顯;背面為淡橙色(圖6A-6B)。PDA培養(yǎng)基上的子實體為黑色墨汁狀,埋生或半埋生,單獨或聚生(圖6C)。

A-B.PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后的菌落(A為正面,B為反面);C.分生孢子堆;D.分生孢子盤、產(chǎn)孢細胞及未成熟的分生孢子; E-F.分生孢子。單位長度:20 μm。

顯微特征:分生孢子盤上的分生孢子梗不明顯,通常退化為產(chǎn)孢細胞,產(chǎn)孢細胞無色透明、群生,呈保齡球形狀(圖6D);分生孢子5個細胞,梭形,直或稍彎曲,大小為(19.0～26.3) μm×(4.8～7.5) μm;中間3個細胞同色,均為淺褐色,長度為11.1～16.3 μm;頂端細胞圓錐狀、無色透明,長度為3.7～6.3 μm,頂端著生2～4根管狀附屬絲,長度為8.8～18.8 μm;基部細胞長度為3.8～5.4 μm,基部附屬絲通常有1根,長度為1.2～5.1 μm(圖6E-6F)。

ZL11與P.neolitseae在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成姊妹分支,支持率92%,后驗概率1.00,都比較高;同時,ZL11的形態(tài)特征與P.neolitseae[15]大體相似。故將ZL11鑒定為P.neolitseae。

P.neolitseae是Ariyawansa et al[15]在我國臺灣蘭嶼新木姜子(Neolitseavillosa)上發(fā)現(xiàn)的種,其能引起蘭嶼新木姜子發(fā)生葉斑病。酒瓶椰子是該種真菌的新寄主(寄主新記錄)。

2.3.5 菌株ZL30 [Ps.theae(Sawada) Maharachch, K.D. Hyde &Crous] 培養(yǎng)性狀:PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長速度較快,培養(yǎng)7 d后,菌落直徑達到8.5 cm;菌落正面顏色雪白,絨毛狀,邊緣規(guī)則,具有同心輪紋;背面為淡橙色(圖7A-7B)。PDA培養(yǎng)基上的子實體為黑色墨汁狀,埋生或半埋生,單獨或聚生(圖7C)。

A-B. PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后的菌落(A為正面,B為反面);C.分生孢子堆;D.分生孢子盤、產(chǎn)孢細胞及未成熟的分生孢子; E-F.分生孢子。單位長度:20 μm。

顯微特征:分生孢子盤上的分生孢子梗不明顯,通常退化為產(chǎn)孢細胞,產(chǎn)孢細胞無色透明、群生,呈保齡球形狀(圖7D);分生孢子5個細胞,梭形,直或稍彎曲,大小為(22.0～26.4) μm×(7.2～8.8) μm;中間3個細胞異色,長度為14.5～18.2 μm,從基部起第2個細胞淺褐色,第3個和第4個細胞褐色;頂端細胞圓錐狀、無色透明,長度為3.4～4.1 μm,頂端著生2～3根管狀附屬絲,長度為15.9～30.6 μm;基部細胞長度為3.6～4.5 μm,基部附屬絲通常有1根,長度為3.5～8.7 μm(圖7E-7F)。

ZL30與Ps.theae在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起,支持率91%,后驗概率1.00;同時,ZL30的形態(tài)特征與Ps.theae[16]較為相似。故將ZL30鑒定為Ps.theae。

Ps.theae是Sawada[16]在茶樹上發(fā)現(xiàn)的種,該種真菌為茶輪斑病的主要病原真菌[17-18]。本研究首次報道酒瓶椰子為該種真菌的寄主(寄主新記錄);此外,先前沒有酒瓶椰子上發(fā)生假擬盤多毛孢屬真菌的報道,這是酒瓶椰子作為假擬盤多毛孢屬真菌寄主的首次報道。

2.4 病原菌的致病性

本研究對所有獲得的菌株進行柯赫式法則驗證,發(fā)現(xiàn)N.cubana(ZL45)、P.diploclisiae(ZL29)、P.humicola(ZL14)和Ps.theae(ZL30)可以侵染酒瓶椰子葉片,并在接種3 d后出現(xiàn)了葉枯病的初期癥狀,接種7 d后,病斑直徑大小分別為(1.18±0.24)、(0.81±0.06)、(1.39±0.13)、(0.57±0.05) cm(圖8-9)。致病性從強到弱依次為P.humicola、N.cubana、P.diploclisiae和Ps.theae,而P.neolitseae不能侵染酒瓶椰子葉片。取被侵染葉片的病健交界處,分離、純化菌株,通過形態(tài)觀察和系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),其與最初得到的菌株均一致,證實N.cubana、P.diploclisiae、P.humicola和Ps.theae是酒瓶椰子葉枯病的病原菌。

圖8 酒瓶椰子葉片接種5種類擬盤多毛孢屬真菌和PDA(CK)7 d后的發(fā)病情況Fig.8 Pathogenicity test on H.lagenicaulis leaves inoculated with 5 Pestalotiopsis-like species and PDA (CK) at 7 d

誤差線為標準差,柱上不同字母表示經(jīng)單因素ANOVA檢驗具有顯著差異(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

類擬盤多毛孢屬真菌的3個屬形態(tài)特征很相似,主要區(qū)別在于分生孢子中間3個細胞的顏色不同:擬盤多毛孢屬的3個細胞同色,多為淺褐色;新擬盤多毛孢屬的3個細胞異色;假擬盤多毛孢屬的3個細胞同色,多為深褐色[4]。類擬盤多毛孢屬真菌是能夠侵染各類植物的常見病原菌,例如,N.chrysea可以侵染楓香(Liquidambarformosana),P.neglecta能夠侵染柳杉(Cryptomeriajaponica),Ps.gilvanii可以侵染瓜拉那(Paulliniacupanavar.sorbilis)[11,19-20]。目前,類擬盤多毛孢屬真菌中只有P.bicolor發(fā)生于酒瓶椰子的報道[21]。

本研究從酒瓶椰子病葉上分離得到5個類擬盤多毛孢屬真菌菌株,即P.neolitseae、P.diploclisiae、P.humicola、N.cubana和Ps.theae,均首次在酒瓶椰子上被發(fā)現(xiàn),并且這也是酒瓶椰子上發(fā)現(xiàn)新擬盤多毛孢屬和假擬盤多毛孢屬真菌的首次報道;同時,N.cubana首次在我國被發(fā)現(xiàn)。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出,ZL29與P.diploclisiae以及ZL14與P.humicola的支持率和后驗概率都較低;但因為形態(tài)特征相似,所以暫將ZL29和ZL14分別鑒定為P.diploclisiae和P.humicola。后續(xù)還需要通過更多模式菌株的參考序列或新的基因分子標記做進一步鑒定。

本研究中,N.cubana、P.diploclisiae、P.humicola和Ps.theae均被確定為病原菌;而P.neolitseae不能侵染酒瓶椰子的葉片,因此,暫不將其定義為酒瓶椰子葉枯病的病原菌。此外,P.humicola對酒瓶椰子葉片的致病性最強,下一步需要重點對P.humicola進行深入研究。