余 宙, 賀韶韶, 莊浩楠, 袁格格, 陳 功, 于 歡

(湖南農(nóng)業(yè)大學植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室,湖南 長沙 410128)

斜紋夜蛾(SpodopteralituraFabricius)屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae),是世界性的農(nóng)林業(yè)主要害蟲,在亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛分布[1-3]。其具有生殖能力強、寄主范圍廣且食量大的特點,常間歇性大暴發(fā),給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成嚴重危害[4-5]。目前,對斜紋夜蛾的防治仍以藥劑防治為主。但是,化學農(nóng)藥的過度使用會導致該蟲抗藥性增強、人畜安全受到威脅及環(huán)境污染加重等問題[6-10]。

昆蟲的中腸含有大量的微生物,直接或間接對宿主發(fā)揮重要作用,包括分解毒素和殺蟲劑、抵御寄生蟲和其他病原體、在個體之間傳遞信號以及生產(chǎn)營養(yǎng)物質(zhì)和幫助消化等[11-15]。例如:藍波妙[16]發(fā)現(xiàn),斜紋夜蛾腸道菌群能夠編碼纖維素降解酶、木聚糖酶和果膠酶,由此說明斜紋夜蛾腸道細菌在宿主營養(yǎng)供給上起重要作用;Gadad et al[17]利用抗生素清除斜紋夜蛾的腸道菌群后發(fā)現(xiàn),該蟲對農(nóng)藥的抗性顯著降低,揭示了腸道微生物能夠介導斜紋夜蛾對農(nóng)藥的抗性。然而,在條件合適的情況下,共生細菌也可以成為致病菌。例如:發(fā)光光桿狀菌(Photorhabdusluminescens)是共生菌還是病原體,取決于它是寄生在線蟲的腸道中還是寄生在昆蟲的血淋巴中[18];此外,腸道菌群的組成或位置的紊亂也會導致宿主出現(xiàn)病理狀態(tài)或死亡現(xiàn)象[19-21]。這些研究均表明斜紋夜蛾腸道菌群相對豐度或結(jié)構(gòu)的改變都可能影響宿主。

本研究團隊在前期研究中篩選得到對斜紋夜蛾幼蟲具有胃毒性的BLTY品系辣椒。斜紋夜蛾1～3齡幼蟲在取食該品系辣椒葉片后出現(xiàn)大規(guī)模死亡,存活率不高于22.5%;同時,與取食沒有胃毒性的FXBX辣椒葉片相比,幼蟲發(fā)育歷期顯著延長,化蛹率和羽化率顯著降低[22]。但是,具體的抗蟲機制尚不明確。本研究利用基因測序的方法,對取食BLTY品系辣椒葉片后斜紋夜蛾腸道菌群多樣性、結(jié)構(gòu)及功能的變化進行探究,為進一步揭示BLTY品系辣椒對斜紋夜蛾的作用機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲與植物

斜紋夜蛾采自湖南農(nóng)業(yè)大學耘園實驗基地,于人工氣候養(yǎng)蟲室中用人工飼料[23]飼養(yǎng)4代以上,溫度(27±0.5) ℃,相對濕度(70±5)%,光暗比14 h∶10 h,每天定時更換飼料。將待羽化的蛹成對放入養(yǎng)蟲籠內(nèi),成蟲羽化后以10%(體積分數(shù))的蜂蜜水飼養(yǎng)。試蟲為3齡幼蟲。

供試辣椒品種BLTY2、BLTY2父本(♂BLTY2)、BLTY2母本(♀BLTY2)、FXBX種子均由湖南省蔬菜研究所提供。種子經(jīng)過消毒待發(fā)芽后,移至盛有育苗營養(yǎng)土的32穴育苗盤中。待4葉期時,將幼苗移栽至花盆中,于植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室的溫室[溫度(25±5) ℃、相對濕度(70±10)%、光暗比12 h∶12 h]中生長。用于試驗的所有植物均在溫室中生長7周,并具有7片完全展開的真葉,整個栽培過程中不使用任何化學農(nóng)藥。

1.2 樣品處理

取同一批次斜紋夜蛾3齡幼蟲,分別用BLTY2、♂BLTY2、♀BLTY2、FXBX辣椒葉片以及人工飼料[23]飼喂,48 h后,每組隨機選取60頭于超凈工作臺上解剖。解剖工具先經(jīng)75%(體積分數(shù))酒精清洗滅菌,再經(jīng)紫外光照射30 min。使用75%(體積分數(shù))酒精和5%(質(zhì)量分數(shù))次氯酸鈉對斜紋夜蛾體表消毒200 s,后迅速用0.15 mol·L-1氯化鈉漂洗3次,于冰塊上解剖斜紋夜蛾幼蟲,取出腸道,將腸道內(nèi)容物放入1.5 mL離心管中與0.05 mol·L-1磷酸緩沖液混勻,保藏于-80 ℃冰箱冷凍。

1.3 總DNA提取

使用艾科瑞細菌基因組DNA提取試劑盒提取各組樣品的腸道總DNA,使用DNA產(chǎn)物純化試劑盒(DP204,北京天根生化科技有限公司)與酶標儀(Infinite M200 PRO, TECAN)檢驗DNA的質(zhì)量和濃度,之后保存于-20 ℃冰箱待用。

1.4 文庫構(gòu)建和測序

采用通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT),在96孔梯度PCR儀(莫納生物科技有限公司)上對基因片段進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增。反應總體系25 μL(PCR buffer 2.50 μL,dNTP 0.50 μL,上、下游引物各1.00 μL,TaqDNA polymerase 0.15 μL,模板DNA 2.00 μL,ddH2O 17.85 μL)。反應程序:94 ℃預變性5.0 min,變性50 s;在45～60 ℃下退火50 s、72 ℃延伸10 min,27個循環(huán),最后產(chǎn)物于4 ℃保存。用2%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠回收2 μL的PCR產(chǎn)物,利用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(Aidlab公司)切膠純化PCR產(chǎn)物。根據(jù)純化PCR產(chǎn)物的條帶亮度和濃度計算混樣體積并建庫,每個樣品的PCR產(chǎn)物加入量為30 ng,使用Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫的片段范圍和濃度進行檢測。

1.5 腸道樣本測序數(shù)據(jù)處理及物種組成分析

將合格文庫送往深圳華大基因科技有限公司進行16S rRNA測序。主要步驟如下:將HiSeq平臺測序所得的原始reads進行過濾得到clean data;利用軟件FLASH(Fast Length Adjustment of Short Reads, v1.2.11)將reads進行拼接,利用重疊關(guān)系將雙末端測序得到的成對reads組裝成一條序列,得到高變區(qū)的tags[24];使用軟件USEARCH(v7.0.1090_i86linux32)將拼接好的tags按照序列相似性聚類生成操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)[25];得到OTU代表序列后,利用RDP classifer(1.9.1)軟件通過比對OTU代表序列與RDP數(shù)據(jù)庫進行物種注釋(置信度閾值0.6)。

1.6 腸道微生物多樣性分析

基于Illumination HiSeq平臺(https://www.illumina.com.cn)進行微生物多樣性分析。從樣本中隨機抽取序列預測不同測序深度下的物種豐富度,從而對斜紋夜蛾腸道菌群樣本數(shù)量進行評估,參考岳雪華等[26]的方法繪制物種稀釋性曲線。應用軟件Venny 2.1基于OTU數(shù)目作韋恩圖,得到各樣本特有和共有的OTU數(shù)目。利用R語言v3.4.1軟件分析斜紋夜蛾腸道細菌的Alpha多樣性,包括覆蓋度指數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)[27]。分別利用unweighted unifrac算法和binary-jaccard算法計算腸道細菌的Beta多樣性,利用主坐標分析降維并進行可視化,包括PCoA主成分分析、菌群分型分析和PCA主成分回歸分析[28]。利用QIIME 1.9.1軟件(http://qiime.org/install/index.html)生成門水平和屬水平的相對豐度圖。通過LEfSe聚類分析對科水平和目水平的菌群結(jié)構(gòu)進行統(tǒng)計檢驗和差異分析[29]。利用PICRUSt2軟件對測序結(jié)果進行KEGG功能預測分析[30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道菌群樣本數(shù)量評估

從物種稀釋性曲線(圖1)可知,隨著樣本測序數(shù)量的增大,曲線由最開始的急增逐步趨于平緩,表明斜紋夜蛾3齡幼蟲腸道的菌群信息絕大多數(shù)被測得。隨著測序數(shù)量的持續(xù)增大,檢測到的物種數(shù)不再增加,說明本次測序量充足,能夠反映所測細菌的物種廣度,可用于后續(xù)分析。

DIET為人工飼料,FXBX為無毒性辣椒葉片,其余為胃毒性辣椒葉片。

2.2 腸道細菌多樣性分析

2.2.1 OTU數(shù)韋恩圖 按照97%序列相似性聚類共得到237個OTU。其中:5種處理的斜紋夜蛾幼蟲腸道細菌共有OTU數(shù)為29個,占細菌OTU總數(shù)的12.24%;取食BLTY2、♂BLTY2、♀BLTY2、FXBX辣椒葉片以及人工飼料的斜紋夜蛾幼蟲腸道細菌特有OTU數(shù)分別為11、20、27、14、9個,分別占細菌OTU總數(shù)的4.64%、8.44%、11.39%、5.91%、3.80%(圖2)?？梢?取食辣椒葉片后的特有OTU數(shù)多于取食人工飼料的OTU數(shù)。

2.2.2 Alpha多樣性 取食不同食物的斜紋夜蛾腸道細菌覆蓋度指數(shù)介于0.999 7～0.100 0之間(圖3A),表明樣本中序列被測出的概率很高,測序結(jié)果能代表樣本中菌群的真實情況。取食BLTY品系辣椒葉片的斜紋夜蛾幼蟲腸道細菌群落的Shannon指數(shù)(圖3B)與Chao指數(shù)(圖3C)均顯著高于取食FXBX辣椒葉片和人工飼料的樣品,說明取食BLTY品系辣椒葉片后斜紋夜蛾腸道細菌的多樣性和豐度均顯著上升。

A.覆蓋度指數(shù)箱線圖;B.Shannon指數(shù)箱線圖;C.Chao指數(shù)箱線圖。DIET為人工飼料,FXBX為無毒性辣椒葉片,其余為胃毒性辣椒葉片。

2.2.3 Beta多樣性 通過R語言統(tǒng)計分析和作圖,基于unweighted unifrac距離矩陣的PCoA分析表明,取食3個BLTY品系辣椒葉片的斜紋夜蛾幼蟲腸道菌群組成較相似(圖4A),且與取食FXBX辣椒葉片和人工飼料的差異較大。菌群分型分析將取食BLTY品系的3組腸道菌群聚合在一起(圖4B),表明3組樣品的菌群組成相似,與PCoA分析結(jié)果相符。 PCA分析表明,取食BLTY品系辣椒葉片的3組樣品的腸道菌群組成與取食人工飼料的樣品發(fā)生了兩個方向的偏移(圖4C),且FXBX組與飼料組之間也存在偏移,這與PCoA分析結(jié)果一致。

2.3 腸道細菌群落物種組成分析

在門水平上,相對豐度前10的菌門如圖5A所示,厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為5組斜紋夜蛾腸道細菌的共有優(yōu)勢菌門。在取食BLTY2、♂BLTY2、♀BLTY2、FXBX和人工飼料的斜紋夜蛾腸道細菌中,厚壁菌門的相對豐度依次為78.23%、59.12%、69.18%、92.07%和84.10%,變形菌門的相對豐度分別為17.96%、31.41%、25.20%、4.10%和15.80%。與取食人工飼料相比,取食BLTY品系辣椒葉片后斜紋夜蛾幼蟲腸道細菌中厚壁菌門的相對豐度下降,而變形菌門、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度顯著上升。

DIET為人工飼料,FXBX為無毒性辣椒葉片,其余為胃毒性辣椒葉片。

在屬水平上,5組腸道細菌樣本共獲得131個菌屬。取食BLTY2、♂BLTY2、♀BLTY2、FXBX辣椒葉片和人工飼料的斜紋夜蛾腸道細菌的菌屬分別有88、89、98、53、39個,可見,取食BLTY品系辣椒葉片后的菌屬多樣性明顯豐富。其中,相對豐度前10的菌屬如圖5B所示,與取食FXBX辣椒葉片(91.99%)和人工飼料(78.06%)相比,取食BLTY品系辣椒葉片的斜紋夜蛾腸道細菌中腸球菌屬(Enterococcus)相對豐度(74.92%、58.93%、68.24%)下降,但沙門氏菌屬(Salmonella)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)和布魯氏菌屬(Brucella)相對豐度顯著上升,而這3種菌屬中多存在致病菌。綜上,取食BLTY品系辣椒葉片后斜紋夜蛾幼蟲的腸道菌群發(fā)生了顯著變化。

2.4 LEfSe聚類分析

通過LEfSe聚類分析(圖6)發(fā)現(xiàn),與取食FXBX辣椒葉片和人工飼料相比,取食BLTY品系辣椒葉片的斜紋夜蛾幼蟲腸道菌群中,放線菌目(Actinomycetales)、黃桿菌目(Flavobacteriales)、鞘氨醇桿菌目(Sphingobacteriales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、黃單胞菌目(Xanthomonadales)代表的biomarker節(jié)點顯著增大。與取食FXBX相比,取食人工飼料后斜紋夜蛾幼蟲腸道菌群中明串球菌科(Leuconostocaceae)和乳桿菌科(Lactobacillaceae)代表的節(jié)點顯著增大,且紅螺菌目(Rhodospirillales)為其特有菌目;而與取食人工飼料相比,取食FXBX的斜紋夜蛾腸道菌群中腸球菌科(Enterococcaceae)代表的節(jié)點顯著增大?？梢?取食BLTY品系辣椒葉片后斜紋夜蛾幼蟲腸道菌群在目水平上發(fā)生了較大變化。

DIET為人工飼料,FXBX為無毒性辣椒葉片,其余為胃毒性辣椒葉片。

2.5 腸道細菌功能預測

KEGG功能預測分析顯示,取食BLTY品系辣椒后斜紋夜蛾腸道細菌的一級分類水平代謝通路包括新陳代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細胞轉(zhuǎn)化、人類疾病和生物系統(tǒng),與取食FXBX辣椒葉片和人工飼料相比,取食BLTY品系辣椒葉片的斜紋夜蛾幼蟲腸道細菌在細胞轉(zhuǎn)化和新陳代謝通路的相對豐度明顯升高(圖7A)。進一步對腸道細菌代謝通路的二級分類水平分析顯示,與取食人工飼料相比,取食BLTY品系辣椒葉片后,斜紋夜蛾幼蟲腸道細菌在細胞運動、運輸和分解代謝、傳染病、信號傳導、外源化合物降解和代謝以及內(nèi)分泌系統(tǒng)通路的相對豐度顯著上升(圖7B)。

DIET為人工飼料,FXBX為無毒性辣椒葉片,其余為胃毒性辣椒葉片。

3 討論

昆蟲腸道細菌具有豐富的多樣性,并與昆蟲的健康狀況密切相關(guān),且受宿主所處的環(huán)境條件、飲食方式和結(jié)構(gòu)、年齡和遺傳關(guān)系等諸多因素影響[30-35]。本研究發(fā)現(xiàn),取食具有胃毒性的BLTY品系辣椒葉片、無毒性的FXBX辣椒葉片以及人工飼料的斜紋夜蛾幼蟲腸道細菌的OTU數(shù)目、菌屬豐富度、多樣性指數(shù)和功能均存在差異,其中,取食3個BLTY品系辣椒葉片的菌群組成較相似,并且比取食FXBX辣椒葉片和人工飼料的菌群組成更復雜多樣。類似的情況也存在于胃毒性農(nóng)藥處理后的鱗翅目昆蟲中:張靳宜等[36]發(fā)現(xiàn),甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽會對斜紋夜蛾幼蟲腸道菌群的結(jié)構(gòu)和代謝能力產(chǎn)生明顯影響,使原先不占據(jù)優(yōu)勢的棒狀桿菌屬(Corynebacteriu)和甲醇桿菌屬(Methylobacterium)豐度明顯上升,由桿菌代謝產(chǎn)物的積累促進毒性反應;姜笑維等[37]對棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)飼喂含擬除蟲菊酯類殺蟲劑的飼料后,發(fā)現(xiàn)致病菌群相對豐度顯著增加;Zeng et al[38]發(fā)現(xiàn),阿維菌素脅迫顯著增加了舞毒蛾(Lymantriadispar)幼蟲腸道中的腸桿菌屬(Enterobacter)、念珠菌屬(Candida)和鏈格孢菌屬(Alternaria)3種條件致病菌群的豐度。由此推測BLTY品系辣椒作為抗蟲品種,葉片中可能含有特殊的次生代謝物,破壞了斜紋夜蛾幼蟲腸道菌群原有的穩(wěn)態(tài)平衡和動態(tài)調(diào)控機制,引起代謝通路的顯著變化,從而對斜紋夜蛾幼蟲產(chǎn)生胃毒作用。

本研究還發(fā)現(xiàn),與取食FXBX辣椒葉片和人工飼料相比,取食BLTY品系辣椒葉片后斜紋夜蛾3齡幼蟲腸道中腸球菌屬相對豐度下降,但沙門氏菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬和布魯氏菌屬相對豐度顯著上升。腸球菌屬是昆蟲體內(nèi)一類常見的細菌,一般不會對宿主產(chǎn)生致病性[39-40]。劉語涵[41]研究發(fā)現(xiàn),腸球菌屬大量存在于家蠶(Bombyxmori)腸道內(nèi),可產(chǎn)生淀粉、脂肪、纖維素等多種酶,促進家蠶對桑葉營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用;腸球菌屬在維持腸道菌群微生態(tài)穩(wěn)定中也發(fā)揮著重要功能,特別是對微孢子蟲的孢子萌發(fā)有明顯的抑制效果[42]。沙門氏菌屬是導致人類急性食源性疾病的重要人畜共患病原菌[43];宿主免疫功能低下時,可能會由于沙門氏菌進入血液引發(fā)嚴重的菌血癥而死亡[44]。寡養(yǎng)單胞菌屬為條件致病菌,在宿主免疫力低下時易引起呼吸系統(tǒng)疾病,常與其他條件致病菌混合感染[45-46]。布魯氏菌屬侵入機體后會使機體出現(xiàn)黏膜損傷、消化道感染等癥狀并引發(fā)炎癥[47-48]。由此可見,取食BLTY品系辣椒葉片使斜紋夜蛾腸道有益菌的相對豐度下降,而致病菌的相對豐度增加,這可能是其重要的胃毒機制之一。此外,有研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群可以與植物代謝物共同作用介導宿主的病理狀態(tài)。如Mason et al[49]研究發(fā)現(xiàn),玉米中的凝集素幾丁質(zhì)酶可與草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)幼蟲腸道內(nèi)的腸桿菌共同作用,誘導發(fā)生腸道滲漏綜合癥而致該蟲死亡。本研究中,取食BLTY品系辣椒葉片后斜紋夜蛾腸道菌群發(fā)生了顯著變化,這些變化的菌群與BLTY品系辣椒葉片中的特殊代謝物共同作用,可能也是引起斜紋夜蛾幼蟲死亡的因素之一。

綜上,BLTY品系辣椒可改變斜紋夜蛾幼蟲腸道菌群的結(jié)構(gòu),主要使有益菌的相對豐度降低和致病菌的相對豐度升高,這可能是BLTY品系辣椒對斜紋夜蛾幼蟲的胃毒機制,但該機制與BLTY品系辣椒中的何種代謝物質(zhì)相關(guān)還需要進一步研究。