解宇潔, 薛 婧, 姜曉東, 殷 輝, 趙曉軍, 馮 鑄, 李新鳳

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,山西 太谷 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西 太谷 030801; 3.山西省農(nóng)業(yè)種子總站,山西 太原 030006)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld),屬藜科藜屬一年生草本植物,原產(chǎn)于南美洲安第斯高地,是一種全營(yíng)養(yǎng)單體植物,因其特殊的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及耐寒、耐旱、耐鹽堿等特性,被越來(lái)越多的人青睞[1]。由PeronosporavariabilisGaüm引起的霜霉病是各藜麥產(chǎn)區(qū)常見的病害,嚴(yán)重影響藜麥的產(chǎn)量和品質(zhì),給藜麥產(chǎn)業(yè)造成了較大經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前,對(duì)該病害的防治仍然以傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑防治為主,既存在安全隱患,又提高了生產(chǎn)成本;抗病品種的合理利用是防治植物病害最經(jīng)濟(jì)、有效的措施[3]。了解藜麥抗霜霉病菌基因的表達(dá)模式和作用機(jī)制,進(jìn)而選育抗病品種,對(duì)藜麥霜霉病的防治乃至藜麥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

常見的基因表達(dá)量分析方法有Northern blots、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)、微陣列(microarray)法、基因表達(dá)連續(xù)分析(serial analysis of gene expression, SAGE)法、微球法等[4]。其中,qRT-PCR由于具有高重復(fù)性、高靈敏性和高特異性等特性,已被廣泛用于微生物檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性分析和基因表達(dá)研究等方面[5-6]。相對(duì)定量研究要求選擇在不同試驗(yàn)條件下都能相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因,對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平進(jìn)行校正,內(nèi)參基因的穩(wěn)定性對(duì)qRT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性具有決定性[7]?？刂粕锛?xì)胞基本結(jié)構(gòu)和代謝功能的持家基因常被用作內(nèi)參基因,目前用于植物研究的內(nèi)參基因有編碼肌動(dòng)蛋白(actin, act)、α-微管蛋白(α-tubulin,α-tub)、18S核糖體RNA(18S ribosomal RNA, 18S rRNA)、翻譯延伸因子(translation elongation factor, ef-1)、β-微管蛋白(β-tubulin,β-tub)和泛素連接酶(ubiquitin-ligase enzyme, ubc)等的基因[8-10]。但越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),在不同組織、器官或試驗(yàn)條件下都能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因幾乎不存在[11-12]。因此,為確保qRT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性,需要根據(jù)不同處理選擇相應(yīng)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因[13-14]。

基于qRT-PCR中基因表達(dá)的Ct值,一系列專門用于分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性的程序被開發(fā),目前應(yīng)用最多的有g(shù)eNorm[15]、NormFinder[16]、BestKeeper[17]和RefFinder[18]等軟件。其中,geNorm和NormFinder軟件用于計(jì)算各候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定(M)值,M值越小,內(nèi)參基因穩(wěn)定性越強(qiáng)。geNorm程序以M=1.5為閾值,若M值大于1.5則不適合作為候選內(nèi)參基因。同時(shí),geNorm可以通過(guò)計(jì)算配對(duì)變異(V)值確定試驗(yàn)所需的最適內(nèi)參基因數(shù)目,以提高結(jié)果可信度,該程序以0.15為閾值,當(dāng)Vn/Vn+1小于0.15時(shí),則最適內(nèi)參基因數(shù)目為n個(gè)[19]。BestKeeper通過(guò)計(jì)算各候選內(nèi)參基因Ct值之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation, SD)判定候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性,SD值越小,基因表達(dá)越穩(wěn)定,若SD>1,則認(rèn)為該基因不穩(wěn)定[19]。RefFinder將當(dāng)前主流的計(jì)算程序(geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt法[20])進(jìn)行整合,根據(jù)每個(gè)程序的排名,為單個(gè)基因賦予合適的權(quán)重,并計(jì)算其權(quán)重的幾何平均值,以獲得最終的總體排名[18]。這4款軟件的工作原理各不相同,常組合使用以綜合評(píng)估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性[21]。

目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于藜麥內(nèi)參基因篩選的研究十分有限,并且主要集中在非生物脅迫下藜麥內(nèi)參基因的篩選。例如:賈冰晨等[22]研究發(fā)現(xiàn),藜麥在鹽脅迫下的最佳內(nèi)參基因?yàn)锳CT-1和TUB-6;Fiallos-Jurado et al[23]研究發(fā)現(xiàn),藜麥在茉莉酸甲酯脅迫下的最佳內(nèi)參基因?yàn)镸ON1。但未見生物脅迫下藜麥內(nèi)參基因的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)選取編碼藜麥18S rRNA(CqRPS18)、ubc(CqUBC)、α-tub(CqTUA-1)、真核翻譯起始因子(CqELF3)、act(CqACT1)、β-tub(CqTUB-6)、ef-1(CqEF-1a)、液泡融合蛋白(CqMON1)的8個(gè)基因[23]作為霜霉病菌脅迫下藜麥的候選內(nèi)參基因,利用qRT-PCR技術(shù)及geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder軟件分析和評(píng)價(jià)其在藜麥霜霉病菌脅迫下的表達(dá)穩(wěn)定性,旨在為深入開展藜麥抗霜霉病菌相關(guān)基因表達(dá)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藜麥材料74421和2403分別為感霜霉病菌和抗霜霉病菌品系。供試藜麥霜霉病菌為本實(shí)驗(yàn)室純化、繁殖,保存于室內(nèi)盆栽藜麥上,并結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定為P.variabilis的菌株。純化、繁殖方法:2021年在山西省太谷區(qū)藜麥種植基地采集自然發(fā)病的典型藜麥霜霉病罹病葉片,用無(wú)菌水洗凈葉片表面霉層,斜插于水瓊脂平板上,待長(zhǎng)出新霉層后,將其接種至苗齡為6周的盆栽藜麥(74421)上,表現(xiàn)出與田間相同的發(fā)病癥狀。

1.2 材料處理

將供試藜麥種子用35%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲霜靈可濕性粉劑按種子質(zhì)量的0.2%～0.3%拌勻后,播于裝有無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)土的花盆內(nèi),6周后接種霜霉病菌。自預(yù)先準(zhǔn)備好的病株葉片上刮取霜霉病菌孢子囊,置于添加0.05%(體積分?jǐn)?shù))Tween-20的無(wú)菌水中,制成每毫升含1×106個(gè)孢子的懸浮液,在3 h內(nèi)將其噴施到抗病和感病的藜麥材料上,用白色透明塑料袋覆蓋,放入人工氣候箱內(nèi),在23 ℃、相對(duì)濕度100%的條件下,先黑暗培養(yǎng)24 h,再改為12 h光照/12 h黑暗交替培養(yǎng)。分別于接種0、2、6、12、24、48、72 h后收集葉片,液氮速凍后用于RNA提取,每個(gè)處理設(shè)3株生物學(xué)重復(fù)。

1.3 藜麥葉片總RNA提取及cDNA合成

藜麥葉片總RNA提取參照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒(Code No.9769S)說(shuō)明書,之后利用超微量蛋白核酸分析儀(BioDrop μlite+)測(cè)定RNA濃度及光密度(D)值,通過(guò)D260 nm/D230 nm值和D260 nm/D280 nm值評(píng)價(jià)RNA的質(zhì)量?；虮磉_(dá)分析所用的cDNA(complementary DNA)模板均按照TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒(Code No.RR036A)說(shuō)明書合成。

1.4 候選內(nèi)參基因與目標(biāo)基因的引物設(shè)計(jì)

參照逆境脅迫下常用的植物內(nèi)參基因,并根據(jù)NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)發(fā)布的藜麥全基因組序列,選取CqRPS18、CqUBC、CqTUA-1、CqELF3、CqACT1、CqTUB-6、CqEF-1a、CqMON1共8個(gè)基因作為候選內(nèi)參基因。除CqACT1、CqTUB-6和CqMON1基因序列利用已報(bào)道引物[22-23]外,其余基因序列的特異性引物均自行設(shè)計(jì)。先通過(guò)NCBI網(wǎng)站搜索藜麥全基因組序列,并下載藜麥各內(nèi)參基因與目標(biāo)基因相應(yīng)的CDS序列,再在Primer-BLAST網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)在線設(shè)計(jì)特異性引物。參數(shù)設(shè)置如下:擴(kuò)增長(zhǎng)度80～200 bp,引物序列長(zhǎng)度17～25 bp,上游引物與下游引物的解鏈溫度(melting temperature, TM)相差5 ℃以內(nèi),限定物種為藜麥(C.quinoaWilld.taxid:63459),以保證引物的特異性。引物序列見表1,設(shè)計(jì)好的引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 候選內(nèi)參基因和目標(biāo)基因信息及其擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)Table 1 Information, amplification efficiency and correlation coefficient of candidate reference genes and target gene

1.5 候選內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及引物擴(kuò)增效率的測(cè)定

等量取42個(gè)樣本的cDNA模板,混合后用ddH2O稀釋6個(gè)濃度,每個(gè)濃度梯度稀釋5倍,利用合成的引物于CFX96 qRT-PCR儀(Bio-Rad)中對(duì)相應(yīng)內(nèi)參基因與目標(biāo)基因序列進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。根據(jù)所得Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到斜率K和線性相關(guān)系數(shù)r2,根據(jù)公式E=(5(-1/K)-1)×100%[24],計(jì)算擴(kuò)增效率E。

采用TaKaRa TB Green?Premix ExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)熒光染料(Code No.RR820A)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)定量分析。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù),以未加cDNA模板作為陰性對(duì)照。qRT-PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL:2×TB Green Premix ExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)10 μL、上游引物(10 μmol·L-1)0.8 μL、下游引物(10 μmol·L-1)0.8 μL、稀釋后的cDNA模板2 μL、ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s,55 ℃,30 s,72 ℃,20 s,40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后獲得65～95 ℃熔解曲線。

1.6 候選內(nèi)參基因引物特異性鑒定

分析候選內(nèi)參基因的熔解曲線,并將qRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠(100 V)電泳25 min,分析擴(kuò)增長(zhǎng)度、電泳條帶數(shù)及是否有非特異性擴(kuò)增。

1.7 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

通過(guò)geNorm和NormFinder軟件計(jì)算各候選內(nèi)參基因的M值,geNorm以M=1.5為閾值,并計(jì)算Vn/Vn+1值,確定最佳候選內(nèi)參基因數(shù)目,閾值為0.15[19];采用ΔCt法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)值(STDEV)[20];通過(guò)BestKeeper軟件計(jì)算各候選內(nèi)參基因Ct值之間的SD值,閾值為1[19];用RefFinder軟件綜合評(píng)估最適內(nèi)參基因[18]。

1.8 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證

以CqSGAT為目標(biāo)基因?qū)见溗共【{迫下8個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證,采用2-ΔΔCt法[25]分析相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù),并利用Excel 2016軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥葉片RNA的質(zhì)量

提取的RNA樣品的D260 nm/D230 nm值和D260 nm/D280 nm值均在2.0～2.1之間,說(shuō)明提取的RNA純度較高,符合后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2.2 候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率及擴(kuò)增特異性

繪制各候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算引物擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù),結(jié)果如表1所示。8個(gè)候選內(nèi)參基因的相關(guān)系數(shù)均大于0.99,擴(kuò)增效率均介于90%～110%之間,表明cDNA模板量與相應(yīng)的Ct值具有良好的線性關(guān)系,符合qRT-PCR對(duì)引物擴(kuò)增效率的要求。

各候選內(nèi)參基因qRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,擴(kuò)增片段與目的片段大小吻合,無(wú)非特異性擴(kuò)增及引物二聚體(圖1)。進(jìn)一步分析熔解曲線,發(fā)現(xiàn)8個(gè)候選內(nèi)參基因均為單一熔解峰,各樣品擴(kuò)增曲線具有良好的重復(fù)性(圖2)。以上結(jié)果表明,8個(gè)候選內(nèi)參基因的引物特異性好,qRT-PCR反應(yīng)專一性強(qiáng),結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

M.Marker;1.CqRPS18;2.CqUBC;3.CqTUA-1;4.CqELF3;5.CqACT1; 6.CqTUB-6;7.CqEF-1a;8.CqMON1。

A.CqRPS18;B.CqUBC;C.CqTUA-1;D.CqELF3;E.CqACT1;F.CqTUB-6;G.CqEF-1a;H.CqMON1。

2.3 候選內(nèi)參基因的表達(dá)豐度

8個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值介于19～31之間,其中,CqEF-1a基因的Ct值最小(20～24),CqELF3基因的Ct值最大(25～31),未加模板的對(duì)照組未檢測(cè)到熒光信號(hào)(圖3)。

圖3 候選內(nèi)參基因的Ct值分布

2.4 候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

geNorm軟件分析結(jié)果如圖4和表2所示。V2/V3=0.014<0.15(圖4),表明本研究中最適候選內(nèi)參基因數(shù)目為2個(gè)。8個(gè)候選內(nèi)參基因的M值均小于1.5,說(shuō)明所有基因表達(dá)都比較穩(wěn)定。M值表現(xiàn)為CqEF-1a=CqMON1

表2 內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性Table 2 Expression stability of reference gene

NormFinder軟件分析結(jié)果(表2)表明,8個(gè)候選內(nèi)參基因的M值表現(xiàn)為CqEF-1a

BestKeeper軟件分析結(jié)果(表2)表明,除CqELF3外的7個(gè)候選內(nèi)參基因的SD值均小于1.00,說(shuō)明這些基因的表達(dá)都比較穩(wěn)定。SD值表現(xiàn)為CqMON1

ΔCt法得到的基因穩(wěn)定性排名如表2所示,表現(xiàn)為CqEF-1a>CqRPS18>CqMON1>CqTUA-1>CqUBC>CqACT1>CqTUB-6>CqELF3,即最適合作為內(nèi)參基因的是CqEF-1a和CqRPS18,該結(jié)果與NormFinder軟件的評(píng)估結(jié)果一致。

RefFinder軟件得到的穩(wěn)定性綜合排名如表2所示,表現(xiàn)為CqEF-1a>CqMON1>CqRPS18>CqTUA-1>CqUBC>CqACT1>CqTUB-6>CqELF3,即最適合作為內(nèi)參基因的是CqEF-1a和CqMON1,該結(jié)果與geNorm軟件的評(píng)估結(jié)果一致。綜合4個(gè)軟件和ΔCt法的分析結(jié)果可知,CqEF-1a、CqMON1和CqRPS18的穩(wěn)定性好。

2.5 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證

圖5顯示,以除CqUBC外的7個(gè)候選基因作為參照時(shí),CqSGAT基因在藜麥抗病品系2403中的表達(dá)趨勢(shì)基本一致:表達(dá)量均在霜霉病菌侵染后波動(dòng)上升,12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高,后呈下降趨勢(shì),但在72 h時(shí)略有回升。此外,在不同內(nèi)參基因處理下,CqSGAT的表達(dá)量存在較大差距。

74421為藜麥感病品種,2403為藜麥抗病品種。

分別以CqEF-1a或CqRPS18作為內(nèi)參基因以及二者作為雙內(nèi)參基因時(shí),CqSGAT基因在藜麥感病品種74421中的表達(dá)趨勢(shì)一致,表達(dá)量均在霜霉病菌侵染后6 h內(nèi)逐漸升高,在12 h時(shí)下降,24 h時(shí)再次升高,之后波動(dòng)下降;而以其余6個(gè)候選基因作為內(nèi)參基因時(shí)CqSGAT在藜麥感病品種中的表達(dá)趨勢(shì)與上述情況有所不同。綜上,選擇CqEF-1a和CqRPS18組合作為藜麥在霜霉病菌脅迫下的內(nèi)參基因。

3 討論

本研究分析了CqRPS18、CqUBC、CqTUA-1、CqELF3、CqACT1、CqTUB-6、CqEF-1a、CqMON1共8個(gè)候選內(nèi)參基因在藜麥霜霉病菌脅迫下的表達(dá)穩(wěn)定性,并以CqSGAT基因作為目標(biāo)基因,進(jìn)一步驗(yàn)證了候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性,確定藜麥在霜霉病菌脅迫下穩(wěn)定表達(dá)的最適內(nèi)參基因?yàn)镃qEF-1a和CqRPS18。

通過(guò)比較geNorm、NormFinder、BestKeeper軟件和ΔCt方法的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),geNorm、NormFinder軟件和ΔCt法得到的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序基本一致,而BestKeeper軟件得到的穩(wěn)定性排序與其他3種方法有明顯差異。在鹽脅迫下藜麥內(nèi)參基因的篩選中也發(fā)現(xiàn),BestKeeper軟件的分析結(jié)果不同于其他算法[22]。此差異可能是由試驗(yàn)數(shù)據(jù)的誤差和不同軟件的統(tǒng)計(jì)學(xué)算法不同引起的。因此,使用目標(biāo)基因驗(yàn)證候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性是十分必要的。

絲氨酸∶乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶(serine∶glyoxylate aminotransferase,SGAT)存在于植物、動(dòng)物、微生物中,此酶參與高等植物光呼吸代謝過(guò)程,是過(guò)氧化物酶體中的標(biāo)志酶,主要催化絲氨酸和乙醛酸之間的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng),生成羥基丙酮酸和甘氨酸[26]。該酶對(duì)植物的碳代謝和氮代謝循環(huán)都起著重要作用。Taler et al[27]從印度野生甜瓜的霜霉病抗性品種中克隆得到兩個(gè)具有SGAT活性的甜瓜霜霉病抗性基因At1和At2,且過(guò)表達(dá)At1和At2基因的甜瓜對(duì)霜霉病的抗性增強(qiáng)。也有研究表明,SGAT的表達(dá)調(diào)控與植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物脅迫、非生物脅迫及抗衰老方面有密切關(guān)系[28]。因此,結(jié)合前期該基因在藜麥抗病和感病材料中的表達(dá)差異,選擇其作為藜麥抗霜霉病的候選基因。

分別以不同候選基因作為參照,比較目標(biāo)基因的表達(dá)量變化趨勢(shì),若候選基因穩(wěn)定表達(dá),則目標(biāo)基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)一致,相反,則可能出現(xiàn)目標(biāo)基因表達(dá)量變化趨勢(shì)不一致的現(xiàn)象。本研究中,4種軟件分析結(jié)果均認(rèn)為CqEF-1a、CqMON1和CqRPS18基因表達(dá)穩(wěn)定性好,但以CqMON1為內(nèi)參基因時(shí),CqSGAT基因在藜麥感病品種中的表達(dá)量變化趨勢(shì)與CqEF-1a和CqRPS18作為內(nèi)參基因時(shí)不一致。其原因可能是該基因的熒光閾值設(shè)置不合適,導(dǎo)致Ct值過(guò)高,進(jìn)而使試驗(yàn)結(jié)果不能準(zhǔn)確反映目標(biāo)基因的實(shí)際表達(dá)趨勢(shì),故CqMON1基因是否適合作為藜麥在霜霉病菌脅迫下的內(nèi)參基因,還有待調(diào)整熒光閾值后再進(jìn)行驗(yàn)證。此外,本課題組前期研究認(rèn)為藜麥抗霜霉病的性狀可能是由多基因控制的數(shù)量性狀[29],所以候選內(nèi)參基因在霜霉病菌脅迫下的表達(dá)穩(wěn)定性還有待使用其他抗病基因進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

賈冰晨等[22]研究發(fā)現(xiàn),藜麥在鹽脅迫下的最佳內(nèi)參基因?yàn)锳CT-1和TUB-6;Fiallos-Jurado et al[23]研究發(fā)現(xiàn),藜麥在茉莉酸甲酯脅迫下的最佳內(nèi)參基因?yàn)镸ON1。本研究結(jié)果表明,藜麥在霜霉病菌脅迫下的最適內(nèi)參基因?yàn)镃qEF-1a和CqRPS18。這說(shuō)明同一內(nèi)參基因在同一物種不同脅迫條件下表達(dá)的穩(wěn)定性不盡相同,所以需要根據(jù)不同處理?xiàng)l件選擇相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。此外,生物體中持家基因數(shù)目龐大,今后還有待進(jìn)一步挖掘表達(dá)水平更穩(wěn)定的內(nèi)參基因。